trong cây Diếp cá
Khi khảo sát khả năng tổng hợp IAA của 17 dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá, kết quả cho thấy có 6 dòng vi khuẩn có lượng IAA tạo ra cao. Ở ngày thứ 2 sau khi chủng vi khuẩn chưa thích nghi với môi trường nên chỉ tổng hợp được một lượng IAA thấp, đến ngày thứ 4 vi khuẩn đã thích nghi được với môi trường, đồng thời chúng đã phát triển mạnh nên lượng IAA tổng hợp được tăng lên đáng kể. Hàm lượng IAA giảm rõ rệt ở ngày thứ 6 sau khi chủng, có thể môi trường đã cạn kiệt chất dinh dưỡng, cũng có thể vi khuẩn đã bắt đầu pha suy vong. Do đó, khả năng tổng hợp IAA của chúng bị hạn chế, vi khuẩn có xu hướng sử dụng lượng IAA mà chúng tạo ra dẫn đến hàm lượng IAA giảm mạnh (Hình 12).
Hình 8: Hàm lượng IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng phân lập được từ cây Diếp cá
(*Ghi chú: Những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%) a b b c c b a b c d e c b a c b d d 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 DR2 DR8 DT3 DT4 DL1 DL5 Dòng vi khuẩn H à m l ư ợn g I A A ( µ g /m l) Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
Dòng DR2 tổng hợp được lượng IAA cao nhất (6,93 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại. Tiếp đến là dòng DR8 cũng tổng hợp được một lượng IAA tương đối cao (6,24 µg/mL), dòng DL1 có lượng IAA thấp nhất với lượng IAA là 4,76 µg/mL (Hình 12). Điều này chứng tỏ, dòng DR2 là dòng vi khuẩn nội sinh có khả năng tổng hợp IAA mạnh nhất được phân lập từ rễ của mẫu Diếp cá thu ở huyện Châu Thành, tỉnh Đồng Tháp. Qua kết quả trên cho thấy, trong phạm vi nghiên cứu này dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ có khả năng tổng hợp IAA mạnh hơn dòng vi khuẩn phẩn phân lập được từ thân và lá.
Tóm lại, khi khảo sát và so sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá, cho thấy lượng IAA mà vi khuẩn tổng hợp được có sự thay đổi rõ rệt theo thời gian. Các dòng vi khuẩn có lượng IAA tăng cao nhất ở ngày thứ 4 và giảm ở ngày thứ 6 sau khi chủng. Tuy nhiên, do mỗi dòng vi khuẩn có những đặc tính khác nhau nên khả năng tổng hợp IAA của chúng cũng khác nhau, thể hiện sự thích ứng khác nhau của các dòng vi khuẩn trong môi trường. Khuynh hướng này phù hợp với những mô tả về khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn nội sinh trong cây mía
của Nguyễn Thị Phương Tâm (2011), vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá của Phạm Thanh Sang (2014), vi khuẩn nội sinh trong cây lúa của Nguyễn Khánh Ngọc (2013).
Trong số mười bảy dòng vi khuẩn được khảo sát, dòng DR2 tổng hợp được lượng IAA cao nhất (6,93 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng khác ở ngày thứ 4 sau khi chủng. Khi so sánh với khả năng tổng hợp IAA của dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng nhất (dòng RS10 với lượng IAA tổng hợp được là 8,51 µg/mL) phân lập được từ cây Diếp cá của Phạm Thanh Sang (2014) thì nhận thấy khả năng tổng hợp IAA của dòng DR2 thấp hơn. Tuy nhiên, khi so sánh với lượng IAA tổng hợp được của dòng R6 (5,12 µg/mL) phân lập từ cây Diếp cá của Nguyễn Thị Bảo Trân (2014), nhận thấy khả năng tổng hợp IAA của dòng DR2 cao hơn. Như vậy, khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh là một trong những tiềm năng giúp cho cây phát triển tốt, đồng thời các dòng vi khuẩn nội sinh ở các cây khác nhau thì khả năng tổng hợp IAA của chúng có thể khác nhau.
4.5. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn ở các dòng vi khuẩn phân lập được Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được khi tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn với 2 loài vi khuẩn gây bệnh là E. coli và A. hydrophila, kết quả 9/17 dòng vi khuẩn có khả năng kháng vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột (chiếm tỷ lệ 53%) và 7/17 dòng vi khuẩn có khả năng kháng lại vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh ở cá (chiếm tỷ lệ 41%). Trong đó có 7/17 dòng có khả năng kháng khuẩn với cả 2 loài vi khuẩn gây bệnh (chiếm tỷ lệ 41%).
4.5.1. Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Escherichia. coli
Khả năng kháng E. coli của các dòng vi khuẩn được thể hiện thông qua sự hình thành vòng sáng vô khuẩn xung quanh mẫu giấy thấm có dịch vi khuẩn trên môi trường PDA đã được trải vi khuẩn E. coli. Khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được với vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột, kết quả cho thấy 9 dòng vi khuẩn (DR1, DR2, DR3, DT1, DT2, DL1, DL2, DL3, DL4) có khả năng tạo vòng sáng vô khuẩn. Điều này chứng tỏ các dòng vi khuẩn này có khả năng kháng lại vi khuẩn E. coli.
Ở ngày đầu sau khi ủ, tất cả 17 dòng vi khuẩn đều phát triển khuẩn lạc, tuy nhiên chỉ có 9 dòng vi khuẩn có khả năng kháng lại vi khuẩn E. Coli.
Hình 13: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn DL3 và DL1 với vi khuẩn E. coli sau 1 ngày ủ
Hình chụp, ngày 21/10/2014
DL3 DL1
nhiên khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê so với dòng DL3 (3,85 mm) và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại và. Dòng DR2, DR3 và DT2 có cùng kích thước vòng vô khuẩn là 2,1mm và đây cũng là vòng vô khuẩn nhỏ nhất ở ngày đầu sau khi ủ.
Ở ngày 2 sau khi ủ, kích thước vòng vô khuẩn của cả 9 dòng vi khuẩn đều giảm. Vòng vô khuẩn lớn nhất vẫn là dòng DL1 (3,6 mm), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại. Thấp nhất là hai dòng DL2 và DT2 có cùng kích thước vòng vô khuẩn là 1,6 mm.
Sau 3 ngày ủ, kích thước vòng vô khuẩn ở tất cả các dòng giảm xuống rõ rệt, dao động từ 0,9 – 2,9 mm. Vòng vô khuẩn lớn nhất vẫn là dòng DL1 (2,9 mm) khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại và thấp nhất là dòng DL2 với đường kính vòng vô khuẩn là 0,9 mm. Điều này chứng tỏ, có thể đây là những dòng vi khuẩn phát triển nhanh nên chỉ ở ngày đầu sau khi ủ vi khuẩn đã tiết ra một lượng lớn kháng sinh làm ức chế sự phát triển của vi khuẩn E. coli. Hiệu quả kháng khuẩn giảm dần sau 3 ngày ủ, có thể do tốc độ phát triển của vi khuẩn quá nhanh nên ở ngày 2 và ngày 3 sau khi ủ vi khuẩn đã bắt đầu pha suy vong nên khả năng tổng hợp kháng sinh cũng bị hạn chế dẫn đến hiệu quả kháng khuẩn giảm. Cũng có thể do vi khuẩn gây bệnh đã kích hoạt được gen có khả năng kháng lại kháng sinh hoặc do ở ngày 2 và ngày 3 sau khi ủ, mật số vi khuẩn E. coli tăng quá cao nên hiệu quả kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được đã giảm xuống.
Tóm lại, sau 3 ngày khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E. coli, kết quả cho thấy dòng DL1 có khả năng kháng E. coli
mạnh nhất trong số 9 dòng vi khuẩn có khả năng kháng E. coli, với kích thước vòng vô khuẩn là 4,35 mm.
Bảng 18: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn E. coli
STT Dòng vi khuẩn
Kích thước vòng vô khuẩn (mm)
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
1 DR1 2,90cd 2,55c 1,90b 2 DR2 2,10e 1,65ef 1,25cd 3 DR3 2,10e 1,90de 1,00d 4 DT1 3,40bc 2,50c 2,00b 5 DT2 2,10e 1,60f 1,40c 6 DL1 4,35a 3,60a 2,90a 7 DL2 2,35de 1,60f 0,90d 8 DL3 3,85ab 2,90b 2,10b 9 DL4 3,00c 2,00d 1,40c CV (%) 8,39 5,72 10,00
(*Ghi chú: Những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%)
4.5.2. Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Khi khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn A. hydrophila gây bệnh trên cá. Kết quả cho thấy, có 7 dòng vi khuẩn (DR2, DR3, DT1, DT2, DL2, DL3, DL4) có khả năng tạo vòng vô khuẩn xung quanh khuẩn lạc chỉ sau 1 ngày ủ, chứng tỏ 7 dòng vi khuẩn này có khả năng kháng lại vi khuẩn A. hydrophila (Hình 14).
Ở ngày 1 sau khi ủ, tất cả 7 dòng vi khuẩn này dòng đều tạo được vòng vô khuẩn, trong đó 3 dòng DT2, DL4, DL2 có vòng vô khuẩn lớn nhất và có cùng đường kính vòng vô khuẩn là 2mm, tuy nhiên 3 dòng này khác biệt không ý nghĩa về mặt thống kê so với dòng DT1. Dòng DR2 và DR3 có vòng vô khuẩn nhỏ nhất với cùng một kích thước vòng vô khuẩn là 1mm.
Hình 14: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn A. hydrophila
(*Ghi chú: Những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%) a b a a a b b b d a c b c d a e b d d c d 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 DR2 DR3 DT1 DT2 DL2 DL3 DL4 Dòng vi khuẩn V ò n g v ô k h u ẩ n ( m m ) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 có vòng vô khuẩn lớn nhất (3,9 mm), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại và vòng vô khuẩn nhỏ nhất là của dòng DL3 (1,95mm).
Ở ngày thứ 3 sau khi ủ, kích thước vòng vô khuẩn ở tất cả các dòng đều tăng, trong đó vòng vô khuẩn của dòng DL4 tăng lên đáng kể, tăng gấp đôi so với vòng vô khuẩn ở ngày 2 (từ 3 mm tăng lên 6 mm). Dòng DL4 có kích thước vòng vô khuẩn lớn nhất và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại. Kế đến là dòng DL2 với vòng vô khuẩn 4,9 mm và vòng vô khuẩn nhỏ nhất vẫn là dòng DL3 với kích thước vòng vô khuẩn là 2mm. Điều này chứng tỏ dòng DL4 có khả năng kháng vi khuẩn A. hydrophila mạnh nhất trong số 7 dòng có khả năng kháng A. hydrophila.
Như vậy, khả năng kháng A. hydrophila của các các dòng vi khuẩn phân lập được tăng dần từ ngày 1 đến ngày 3 sau khi ủ. Có thể đây là những dòng vi khuẩn phát triển chậm, sau 2 đến 3 ngày thì chúng mới phát triển đến pha log. Do đó, sau 2 đến 3 ngày ủ các dòng vi khuẩn này phát triển mạnh và tổng hợp được một lượng kháng sinh khá lớn nên hiệu quả kháng khuẩn cũng tăng hơn so với ở ngày 1.
Hình 15: Khả năng kháng khuẩn của dòng vi khuẩn DL4 và DL2 với vi khuẩn A. hydrophila sau 1 ngày ủ
Hình chụp, ngày 23/10/2014
DL4 DL2
Trong số 17 dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá khi khảo sát kết quả cho thấy, 9 dòng vi khuẩn (DR1, DR2, DR3, DT1, DT2, DL1, DL2, DL3, DL4) có khả năng kháng E. coli, 7 dòng vi khuẩn (DR2, DR3, DT1, DT2, DL2, DL3, DL4) có khả năng kháng A. hydrophila. Đặc biệt, 7 dòng vi khuẩn (DR2, DR3, DT1, DT2, DL2, DL3, DL4) có khả năng kháng lại cả 2 dòng vi khuẩn gây bệnh (E. coli và A. hydrophila).
Dòng DL1 có khả năng kháng E. coli mạnh nhất (4,35 mm), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại. Khi so sánh với dòng R7 phân lập từ cây Diếp cá của Nguyễn Minh Kế (2014), nhận thấy hiệu quả kháng khuẩn của dòng DL1 với dòng DR7 gần bằng nhau (dòng DL1 là 4,35 mm, dòng R7 là 4,33 mm).
Dòng DL4 có khả năng kháng A. hydrophila mạnh nhất (6 mm), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại. Khi so sánh với khả năng kháng A. hydrophila của dòng vi khuẩn RS1 (5,33 mm) phân lập được từ cây Diếp cá của Phạm Thanh Sang (2014), nhận thấy khả năng kháng A. hydrophila của dòng DL4 cao hơn.
Tóm lại, trong phạm vi nghiên cứu này, các dòng vi khuẩn phân lập được từ lá có khả năng kháng khuẩn hiệu quả hơn các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ và thân của cây Diếp cá. Đồng thời, các dòng vi khuẩn này có khả năng kháng lại vi khuẩn A. hydrophila hiệu quả hơn so với vi khuẩn E. Coli, đặc biệt là dòng DL4 có khả năng kháng tốt với A. hydrophila . Điều này cho thấy, các dòng vi khuẩn này có triển vọng
1 2 3 D
Hình 16: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA
Ghi chú: Giếng D: Thang chuẩn 100bp. Kích thước mẫu là 1500bp Giếng 1: Dòng DR2
Giếng 2: Dòng DR3 Giếng 3: Dòng DL4
1500 bp cho sản xuất kháng sinh để ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản.
4.6. Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
Sau khi kiểm tra các đặc tính sinh hóa của 17 dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá, chọn 3 dòng vi khuẩn triển vọng nhất là dòng DR2, DR3 và DL4 để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R (Hình 16).
Sau khi khuếch đại DNA của các dòng vi khuẩn, 3 dòng vi khuẩn này được gửi giải trình tự và định danh tại công ty Macrogen, Hàn Quốc.
Sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trình tự tương đồng với các trình tự trên ngân hàng gen với kết quả như sau (Bảng 19):
Bảng 19: Kết quả nhận diện 3 dòng vi khuẩn triển vọng
STT Dòng vi khuẩn Kết quả nhận diện Độ tương đồng (%)
1 DR2 Bacillus aryabhattai dòng B8W22 95 2 DR3 Bacillus aryabhattai dòng B8W22 97 3 DL4 Bacillus aryabhattai dòng B8W22 96
Ba dòng vi khuẩn DR2, DR3 và DL4 sau khi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R kết hợp với sử dụng công cụ Blast của NCBI để so sánh trình tự
tương đồng với các trình tự trên ngân hàng gen. Kết quả cho thấy, 3 dòng vi khuẩn này đều được nhận diện là vi khuẩn Bacillus aryabhattai dòng B8W22.
Tuy nhiên, khi so sánh về các đặc tính sinh hóa của 3 dòng vi khuẩn này thì nhận thấy có một vài sự khác biệt:
Sự khác biệt về đặc điểm khuẩn lạc:
+ Màu sắc: Dòng DR3 và DL4 có màu trắng đục, trong khi khuẩn lạc của dòng DR2 có màu trắng ngà.
+ Độ nổi: Dòng DR2 có độ nổi lài, trong khi khuẩn lạc của dòng DR3 và DL4 có độ nổi mô.
+ Kích thước: Kích thước khuẩn lạc của dòng DR2 là 6 mm, dòng DR3 là 2 mm, dòng DL4 là 4 mm (Bảng 20).
Bảng 20: Đặc điểm khuẩn lạc của của 3 dòng vi khuẩn giải trình tự
STT Dòng vi
khuẩn Hình dạng Màu sắc Độ nổi Dạng bìa
Kích thước (mm)
1 DR2 Tròn Trắng ngà Lài Nguyên 6
2 DR3 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 2
3 DL4 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 4
Ghi chú: Dòng DR2: Phân lập từ mẫu Diếp cá thu ở huyện Châu Thành – Đồng Tháp, pH= 6,42 Dòng DR3: Phân lập từ mẫu Diếp cá thu ở huyện Châu Thành – Đồng Tháp, pH = 6,34 Dòng DL4: Phân lập từ mẫu Diếp cá thu ở huyện Lai Vung – Đồng Tháp, pH =5,62
Sự khác biệt về đặc điểm tế bào: Dòng DR2 có dạng que dài, trong khi dòng DR3 và DL4 có dạng que ngắn (Bảng 21).
Bảng 21: Đặc điểm tế bào của 3 dòng vi khuẩn giải trình tự
STT Dòng vi khuẩn Gram * Hình dạng Chuyển động ** Kích thước vi khuẩn (µm)
Chiều dài Chiều rộng
1 DR2 + Que dài + 3,43 0,86
2 DR3 + Que ngắn + 2,06 0,86
3 DL4 + Que ngắn + 1,20 0,86
(Ghi chú: *: - Gram âm, + Gram dương; **: - không chuyển động, + có chuyển động)
Sự khác biệt về khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA:
+ Dòng DR3 có khả năng cố định đạm mạnh hơn so với dòng DR2 và DL4