Sau khi quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn. Quy trình nhuộm Gram được thực hiện như sau:
- Lấy 10µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhầm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để yên 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ từ 1-2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy cà để trong một phút. - Rửa bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ 1-2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để yên 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).