PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn (Khuất Hữu Thanh, 2006):
- Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90-95oC, làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau. Đoạn DNA khuôn có các đoạn dài gồm nhiều nucleotide giống nhau, hoặc tỷ lệ G-C càng cao, có nhiệt độ biến tính (Tm) cao hơn. Do vậy cần căn cứ đặc điểm của DNA khuôn để lựa chọn nhiệt độ biến tính phù hợp, giai đoạn này kéo dài 1 phút đến 2 phút.
- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55-65oC để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3, theo nguyên lý Chargaff. Giai đoạn này khoảng 30-60 giây.
- Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70-72oC thích hợp với điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase. Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymer hóa (polymerization). Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA.
Chu kỳ gồm ba bước này sẽ được lặp lại nhiều lần khoảng 25-40 (tùy vào ứng dụng chuyên biệt). Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72oC trong 5 phút, sau đó cho ngừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4oC (tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).
Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kỳ trước được làm khuôn ở chu kỳ kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR thường thực hiện 20-40 chu kỳ, từ mỗi đoạn DNA khuôn có thể tạo nên 220-240 bản sao DNA. Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng, lượng mồi và dNTP tự do giảm, enzyme DNA polymerase hoạt động yếu dần, do đó cần tính toán hàm lượng mồi dNTP, enzyme để đảm bảo phản ứng PCR có kết quả tốt nhất.