Quy trình trích DNA từ khuẩn lạc của Trần Nhân Dũng (2011)
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao để định danh bằng kỹ thuật PCR.
- Chọn khoảng 10 khuẩn lạc ròng, cho vào tuýp 2,2 mL (ưu tiên chọn những khuẩn lạc rời).
- Cho 1 viên bi sắt vào tuýp và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1 mL Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. - Ly tâm 13000 rpm/5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tuýp mới.
- Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 rpm/5 phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5 phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút (45oC).
- Hòa tan trong 100 µl TE 0,1X. - Trữ ở -20oC.
- Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
- Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
- Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn bắt cặp (annealing).
- Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
- Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sài đất, phản ứng PCR gen 16S-rDNA(Lane, 1991) sử dụng đoạn mồi:
27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
- Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine.
Bảng 7: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ
(oC) Thời gian 1 Biến tính 95 5 phút 2 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 30 95 53 72 1 phút 30 giây 90 giây 3 Kéo dài 72 5 phút Ổn định 10
- Chuẩn bị gel agarose 1% với thể tích 40 mL. Cân 0,4 g agarose cho vào chai nắp xanh. Đong 40 mL dung dịch TE 1X cho vào chai và lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt chai vào lò vi sóng, đun khoảng 5 phút để cho agarose tan hoàn toàn và tạo thành dung dịch trong suốt. Lấy chai ra để nguội khoảng 55- 60oC rồi bổ sung 0,8 μl Ethium
bromide, lắc nhẹ đều. Rót dung dịch vào góc dưới của khuôn gel đã được chuẩn bị, tránh tạo bọt khí. Để khoảng 45 phút cho gel nguội và đặc lại rồi lấy lược ra khỏi khuôn.
- Đặt khuôn gel vào bể điện di dung dịch TE buffer 1X cho ngập gel. Load các mẫu sản phẩm PCR vào mỗi giếng với thể tích 10 μl bao gồm 8 μl mẫu trộn với 2 μl loading buffer. Sau cùng, load 4 μl DNA thang chuẩn 100 bp vào giếng. Mở nguồn điện, cài đặt cho thiết bị ở 95 Vol trong 80 - 90 phút. Quan sát thấy chất chỉ thị màu xanh di chuyển gần cuối gel, tắt nguồn điện, lấy khuôn gel ra để chụp hình. Chụp hình gel đã điện di sản phẩm PCR.
- Sau khi điện di, chụp hình DNA bằng hệ thống máy Bio-Rad Universal Hood II (Mỹ). Nếu các dòng vi khuẩn có band ở vị trí trùng với kích thước và vị trí của đối chứng dương thì đó là dòng vi khuẩn cùng loài với đối chứng dương. Chọn 3 dòng triển vọng nhất để giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Hàn Quốc.
3.3.10. Xử lý số liệu
Hình 5: Vòng pellicle xuất hiện sau 2 – 3 ngày chủng vi khuẩn vào môi trường NFb bán đặc
Hình chụp, ngày 15/6/2014
Vòng pellicle
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
Từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá thu được ở huyện Châu Thành và huyện Lai Vung thuộc tỉnh Đồng Tháp đã phân lập được 17 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA đặc. Hầu hết các dòng vi khuẩn này phân bố ở cả rễ, thân và lá của cây Diếp cá. Vi khuẩn phân lập được tập trung nhiều nhất ở rễ là 8 dòng chiếm tỷ lệ 47,06%, kế đến ở lá là 5 dòng chiếm tỷ lệ 29,41% và ở thân là 4 dòng chiếm tỷ lệ 23,53%. Khi được chủng vào môi trường NFb bán đặc và ủ trong khoảng thời gian 2 - 3 ngày, các dòng vi khuẩn tạo thành vòng pellicle màu trắng đục cách mặt môi trường khoảng 0,5 – 1 cm (Hình 5). Chứng tỏ các dòng vi khuẩn này đều có khả năng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí, đồng thời chúng phát triển và làm thay đổi màu môi trường NFb ban đầu.
Kết quả này cũng phù hợp với với những nghiên cứu trước đây của tác giả Nguyễn Khánh Ngọc (2013) về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa, nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Tâm (2011) về vi khuẩn nội sinh trong cây mía và nghiên cứu của Phạm Thanh Sang (2014) về vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá.
Bảng 8: Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc
STT Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu
1 DR1 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 2 DR2 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 3 DR3 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 4 DR4 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 5 DR5 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 6 DR6 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 7 DR7 Rễ Lai Vung – Đồng Tháp 8 DR8 Rễ Lai Vung – Đồng Tháp 9 DT1 Thân Châu Thành – Đồng Tháp 10 DT2 Thân Châu Thành – Đồng Tháp
11 DT3 Thân Lai Vung – Đồng Tháp
12 DT4 Thân Lai Vung – Đồng Tháp
13 DL1 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 14 DL2 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 15 DL3 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 16 DL4 Lá Lai Vung – Đồng Tháp 17 DL5 Lá Lai Vung – Đồng Tháp 4.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn khi cấy trên môi trường PDA đặc cho thấy, đường kính khuẩn lạc thay đổi từ 0,5mm đến 6mm sau một ngày ủ. Hầu hết các dòng vi khuẩn đều phát triển rất nhanh, thời gian để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc là 12 giờ, chậm nhất là 36 giờ. Phần lớn các vi khuẩn phân lập được đều có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, một số ít khuẩn lạc có độ nổi lài hoặc phẳng và có màu trắng ngà. Đặc điểm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc được thể hiện ở bảng 9.
Màu sắc khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng đục, 11/17 dòng chiếm tỷ lệ 64,7%; 3/17 dòng có khuẩn lạc màu trắng ngà chiếm tỷ lệ 17,6% và 3/17 dòng có khuẩn lạc màu trắng sữa chiếm tỷ lệ 17,6%.
Hình dạng khuẩn lạc:Tất cả các khuẩn lạc đều có dạng tròn, 17/17 dòng chiếm tỷ lệ 100%.
Độ nổi khuẩn lạc: Đa số khuẩn lạc có độ nổi mô, 15/17 dòng chiếm tỷ lệ 88,2% và 2/17 dòng có độ nổi lài chiếm tỷ lệ 11,8%.
Dạng bìa khuẩn lạc: Tất cả các khuẩn lạc đều có dạng bìa nguyên, 17/17 dòng chiếm tỷ lệ 100%.
Kích thước khuẩn lạc: Đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có kích thước dao động từ 0,5 – 6mm sau khi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 30oC khoảng từ 12 - 36h.
Bảng 9: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc
STT Dòng vi
khuẩn Hình dạng Màu sắc Độ nổi Dạng bìa
Kích thước (mm) 1 DR1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 2 2 DR2 Tròn Trắng ngà Lài Nguyên 6 3 DR3 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 2 4 DR4 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,9 5 DR5 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,2 6 DR6 Tròn Trắng ngà Mô Nguyên 0,5 7 DR7 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1 8 DR8 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 0,8 9 DT1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,5 10 DT2 Tròn Trắng đục Lài Nguyên 6
11 DT3 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 1
12 DT4 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 0,8
13 DL1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 4
14 DL2 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 2
15 DL3 Tròn Trắng ngà Mô Nguyên 0,5
16 DL4 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 4
17 DL5 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1
Kết quả mô tả này cũng phù hợp với những mô tả về đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá của Phạm Thanh Sang (2014), trong cây mè của Phùng Văn Tạo (2013).
DR4 DR8
DT3 DT4
DL5 DT2
Hình 6: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường PDA đặc
(Hình chụp, ngày 31/7/2014)
(Dòng DR4) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng DR8) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng DT3) Khuẩn lạc màu trắng sữa, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng DT4) Khuẩn lạc màu trắng sữa, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng DT2) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi lài (Dòng DL5) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô
4.1.2. Đặc điểm tế bào vi khuẩn
Quan sát hình thái và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép, dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần cho thấy các dòng vi khuẩn có đặc điểm như sau (Bảng 10):
Bảng 10: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc
STT Dòng vi khuẩn Gram * Hình dạng Chuyển động ** Kích thước vi khuẩn (µm)
Chiều dài Chiều rộng
1 DR1 - Que dài + 3,09 1,20 2 DR2 + Que dài + 3,43 0,86 3 DR3 + Que ngắn + 2,06 0,86 4 DR4 - Que dài - 3,43 1,71 5 DR5 - Que ngắn + 1,37 0,86 6 DR6 - Cầu đôi + 1,20 1,20 7 DR7 - Que ngắn + 2,23 0,86 8 DR8 - Que ngắn + 2,57 0,86 9 DT1 - Que dài - 3,43 1,37 10 DT2 - Que dài - 3,60 1,37 11 DT3 - Que ngắn + 1,71 1,03 12 DT4 - Que ngắn + 1,54 0,86 13 DL1 - Que dài - 3,43 1,71 14 DL2 - Que dài + 3,43 1,20 15 DL3 - Cầu đôi + 2,57 1,37 16 DL4 + Que ngắn + 1,20 0,86 17 DL5 - Que ngắn + 1,89 0,86
(Ghi chú: *: - Gram âm, + Gram dương; **: - không chuyển động, + có chuyển động)
Khả năng chuyển động: Đa số các vi khuẩn đều có khả năng chuyển động do có chiên mao, 13/17 dòng có khả năng chuyển động, chiếm tỷ lệ 76,5% và 4/17 dòng không có khả năng chuyển động, chiếm tỷ lệ 23,5%.
Hình dạng: Phần lớn các dòng vi khuẩn đều có dạng hình que dài, 7/17 dòng có dạng hình que dài, chiếm tỷ lệ 41,2%, 8/17 dòng có dạng hình que ngắn, chiếm tỷ lệ 47,1%, 2/17 dòng có dạng cầu đôi chiếm tỷ lệ 11,8%.
Hình 7: Vi khuẩn có Gram âm (DR1) và Gram dương (DL4) ở vật kính 100
Hình chụp, ngày 4/11/2014
DR1 DL4
khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá của Phạm Thanh Sang (2014), trong cây mía của Nguyễn Thị Phương Tâm (2011).
4.2. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa trên lượng NH4 dựa trên lượng NH4
+
(ammonium) tổng hợp được
Tiến hành khảo sát khả năng cố định đạm dựa vào lượng NH4+ (ammonium) do vi khuẩn sinh ra bằng phương pháp so màu Indophenol Blue. Kết quả cho thấy, tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng cố định đạm. Mười bảy dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá được chia thành 3 nhóm (nhóm vi khuẩn nội sinh ở rễ, ở thân và ở lá) để khảo sát và so sánh lượng ammonium do vi khuẩn tạo ra ở các ngày 2, ngày 4 và ngày 6 sau khi chủng trong môi trường Nfb lỏng, không N, không Yeast extract. Hầu hết các dòng vi khuẩn khi khảo sát ở ngày thứ 2 sau khi chủng, nhận thấy có một lượng đạm nhất định trong môi trường, đến ngày thứ 4 lượng đạm có chiều hướng giảm xuống và tăng lên đạt mức cực đại ở ngày thứ 6. Tuy nhiên có một số dòng (DT4, DL1, DL3) có lượng đạm tăng ở ngày 4 và giảm ở ngày 6 sau khi chủng (Bảng 11).
Bảng 11: Khả năng tổng hợp đạm của 17 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ cây Diếp cá
STT Dòng vi khuẩn
Hàm lượng NH4+ trung bình (µg/mL)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 DR1 0,27bcd 0,09h 0,71e 2 DR2 0,34ab 0,16e 0,70ef 3 DR3 0,32abc 0,18d 1,39a 4 DR4 0,39a 0,19d 0,74d 5 DR5 0,38a 0,14f 0,66g 6 DR6 0,25cd 0,01i 0,68fg 7 DR7 0,38a 0,09h 0,80c 8 DR8 0,34d 0,12g 0,67g 9 DT1 0,26bcd 0,02i 0,75d 10 DT2 0,23d 0,14f 0,90b 11 DT3 0,22d 0,01i 0,58h 12 DT4 0,06e 0,44a 0,28i 13 DL1 0,09e 0,38b 0,27i 14 DL2 0,36a 0,18d 0,87b 15 DL3 0,06e 0,31c 0,27i 16 DL4 0,33abc 0,02i 0,75d 17 DL5 0,32abc 0,14fg 0,58h CV (%) 17,99 5,45 2,03
(Ghi chú: Những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5%.)
4.2.1. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ cây Diếp cá (Nhóm 1) được từ rễ cây Diếp cá (Nhóm 1)
Ở ngày thứ 2 sau khi chủng vi khuẩn vào môi trường NFb lỏng, không N, không Yeast extract, kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ cây Diếp cá có được lượng đạm nhất định dao động từ 0,25 – 0,39µg/mL. Sang ngày thứ 4 sau khi chủng lượng đạm lại giảm xuống, điều này chứng tỏ lượng đạm ở ngày thứ 2 không phải do các dòng vi khuẩn ở rễ tổng hợp được. Lượng đạm có được là do lượng Yeast extract được bổ sung vào môi trường trong quá trình nuôi tăng sinh vi khuẩn (1g Yeast extract/1L môi trường NFb). Khi trong môi trường có đạm, vi khuẩn sẽ sử dụng nguồn đạm này để duy trì số lượng mà không cần tổng hợp đạm.
Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, vi khuẩn đã sử dụng hết lượng đạm còn lại trong môi trường và bắt đầu tổng hợp được một lượng đạm tương đối thấp, dao động từ 0,01 – 0,19 µg/mL. Trong đó lượng đạm cao nhất do dòng DR4 tổng hợp được (0,19 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại và thấp nhất là dòng DR6 (0,01 µg/mL) (Bảng 12).
Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, đa số các dòng đều tạo ra một lượng đạm tăng đáng kể so với ngày thứ 2 và ngày thứ 4. Dòng DR3 có lượng đạm cao nhất (1,39 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại. Dòng DR7 cũng là dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm cao (0,80 µg/mL). Thấp nhất là dòng DR5 với lượng đạm tổng hợp được là 0,66 µg/mL, tuy nhiên lượng đạm này đã cao hơn rất nhiều so với lượng đạm mà dòng DR5 có được ở ngày thứ 4 (0,14 µg/mL).
Bảng 12: Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ tổng hợp theo thời gian (µg/mL)
STT Dòng vi khuẩn
Hàm lượng NH4+ trung bình (µg/mL)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 DR1 0,27c 0,09d 0,71d