3.2.5.1.Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982).
3.2.5.2.Hóa chất
- Chuẩn bị dung dịch KCl : Hòa tan 15g KCl vào nước cất để được 100mL. - Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào nước cất để được 1000mL. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 4mL Stock (NH4+) để được 200mL, sau cùng được dung dịch 2µg/mL.
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside vào nước cất để được 500mL.
- Hypochloride buffer: hòa tan 15mL NaOCl và 5g NaOH vào nước cất để được 500mL.
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng (không đạm). 3.2.5.3.Tiến hành thí nghiệm
- Cho 15mL môi trường NFb lỏng vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. 3.2.5.4.Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
- Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất để được 500mL.
Hình 3. Sự thay đổi màu của dãy dung dịch NH4+ theo phương pháp Indophenol Blue
(*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0; 1; 2; 3; 4 và 5 μg/mL) Hình chụp, ngày 6/10/2014
0 1 2 3 4 5
- Pha buffer: cho 15mL NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 8g NaOH vào nước cất để được 800mL.
- Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm:
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5mL H2O, 0mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4mL H2O, 1mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3mL H2O, 2mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2mL H2O, 3mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1mL H2O, 4mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0mL H2O, 5mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử
- Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn:
Hút 1,5mL dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào Eppendorf.
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Hút 1mL dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4mL H2O, 5mL buffer, 5mL thuốc thử. Vortex cho đều và tiến hành đo phổ OD.
Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ đồ thị trên Excel có thể tính được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
Đường kính halo
E = --- x 100 (Nguyen et al., 1992) Đường kính khuẩn lạc
3.2.6. Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan
- Chuẩn bị môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999). (Bảng 6)
- Dùng micropipette hút lần lượt 5µl dung dịch vi khuẩn nội sinh từ mỗi ống nghiệm môi trường tăng sinh PDA lỏng có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường chứa lân khó tan (NBRIP đặc), mỗi đĩa 3 dòng và 3 lần lặp lại. - Sau đó ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 12 – 24 giờ, dòng nào phát
triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân khó tan.
- Quan sát khả năng tạo vòng halo. Đo đường kính vòng halo và đường kính khuẩn lạc vào các ngày 2, 4, 6 sau khi ủ.
Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan Hiệu quả hòa tan lân E được tính theo công thức:
3.2.7. Khảo sát khả năng tổng hợp IAA 3.2.7.1.Chuẩn bị 3.2.7.1.Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng (không Tryptophan).
- Cho 15mL môi trường NFb lỏng vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng).
3.2.7.2.Hóa chất
- Thuốc thử Salknowski R2: 4,5g FeCl3 trong 1 lít dung dịch H2SO4 10,8 M - Chuẩn bị phosphat buffer 200 mL:
Dung dịch A: 0,136g KH2SO4 trong 100mL nước cất
0 2,5 5 10 20 30 40 80
Hình 4. Sự thay đổi màu của dãy dung dịch IAA theo phương pháp Salkowski
(*Ghi chú: từ trái qua phải của hình là 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40 và 80 μg/mL) Hình chụp, ngày 13/10/2014
3.2.7.3.Phương pháp
Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn theo phương pháp Salkowski IAA (Glickmann và Dessaux, 1995).
- Lấy 39mL dung dịch A, 61mL dung dịch B cho thêm nước cất vừa đủ 200mL, chỉnh pH = 7.
- Hút 1,5mL dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào Eppendorf. - Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1mL phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530nm.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thương mại hòa tan với 10mL phosphat buffer được nồng độ là 160µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/mL.
- Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 80µg/mL.
- Kết quả đo OD các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
- Các số liệu thu thập được được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab. 3.2.8. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn - Chuẩn bị môi trường PDA (Bảng 2)
- Hút 50µl dung dịch pha loãng của vi khuẩn gây bệnh (E. coli, Aeromonas hydrophyla) trải lên bề mặt đĩa môi trường.
- Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào dung dịch vi khuẩn nuôi đạt mật số 10 7 - 108 tế bào/mL trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn gây bệnh (Bauer et al., 1966).
- Ủ 35°C trong 12h – 24h. Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn.
- Đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng trong 3 ngày liên tiếp.
Công thức tính đường kính vòng vô khuẩn
Đường kính vòng vô khuẩn = Đường kính vòng sáng – Đường kính khuẩn lạc (Hernandez et al., 2005)
3.2.9. Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh
Quy trình trích DNA từ khuẩn lạc của Trần Nhân Dũng (2011)
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao để định danh bằng kỹ thuật PCR.
- Chọn khoảng 10 khuẩn lạc ròng, cho vào tuýp 2,2 mL (ưu tiên chọn những khuẩn lạc rời).
- Cho 1 viên bi sắt vào tuýp và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1 mL Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. - Ly tâm 13000 rpm/5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tuýp mới.
- Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 rpm/5 phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5 phút. - Sấy khô chân không trong 10 phút (45oC).
- Hòa tan trong 100 µl TE 0,1X. - Trữ ở -20oC.
- Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm có ba bước:
- Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là 94oC - 95oC trong 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn biến tính (denaturation).
- Bước 2: Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho phép các mồi (primers) bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn bắt cặp (annealing).
- Bước 3: Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (elongation).
- Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Sài đất, phản ứng PCR gen 16S-rDNA(Lane, 1991) sử dụng đoạn mồi:
27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ 1492R 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’
- Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR Bio-Rad DNA Engine.
Bảng 7: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ
(oC) Thời gian 1 Biến tính 95 5 phút 2 Biến tính Gắn mồi Kéo dài 30 95 53 72 1 phút 30 giây 90 giây 3 Kéo dài 72 5 phút Ổn định 10
- Chuẩn bị gel agarose 1% với thể tích 40 mL. Cân 0,4 g agarose cho vào chai nắp xanh. Đong 40 mL dung dịch TE 1X cho vào chai và lắc nhẹ cho agarose tan đều. Đặt chai vào lò vi sóng, đun khoảng 5 phút để cho agarose tan hoàn toàn và tạo thành dung dịch trong suốt. Lấy chai ra để nguội khoảng 55- 60oC rồi bổ sung 0,8 μl Ethium
bromide, lắc nhẹ đều. Rót dung dịch vào góc dưới của khuôn gel đã được chuẩn bị, tránh tạo bọt khí. Để khoảng 45 phút cho gel nguội và đặc lại rồi lấy lược ra khỏi khuôn.
- Đặt khuôn gel vào bể điện di dung dịch TE buffer 1X cho ngập gel. Load các mẫu sản phẩm PCR vào mỗi giếng với thể tích 10 μl bao gồm 8 μl mẫu trộn với 2 μl loading buffer. Sau cùng, load 4 μl DNA thang chuẩn 100 bp vào giếng. Mở nguồn điện, cài đặt cho thiết bị ở 95 Vol trong 80 - 90 phút. Quan sát thấy chất chỉ thị màu xanh di chuyển gần cuối gel, tắt nguồn điện, lấy khuôn gel ra để chụp hình. Chụp hình gel đã điện di sản phẩm PCR.
- Sau khi điện di, chụp hình DNA bằng hệ thống máy Bio-Rad Universal Hood II (Mỹ). Nếu các dòng vi khuẩn có band ở vị trí trùng với kích thước và vị trí của đối chứng dương thì đó là dòng vi khuẩn cùng loài với đối chứng dương. Chọn 3 dòng triển vọng nhất để giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Hàn Quốc.
3.3.10. Xử lý số liệu
Hình 5: Vòng pellicle xuất hiện sau 2 – 3 ngày chủng vi khuẩn vào môi trường NFb bán đặc
Hình chụp, ngày 15/6/2014
Vòng pellicle
CHƯƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn
Từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá thu được ở huyện Châu Thành và huyện Lai Vung thuộc tỉnh Đồng Tháp đã phân lập được 17 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA đặc. Hầu hết các dòng vi khuẩn này phân bố ở cả rễ, thân và lá của cây Diếp cá. Vi khuẩn phân lập được tập trung nhiều nhất ở rễ là 8 dòng chiếm tỷ lệ 47,06%, kế đến ở lá là 5 dòng chiếm tỷ lệ 29,41% và ở thân là 4 dòng chiếm tỷ lệ 23,53%. Khi được chủng vào môi trường NFb bán đặc và ủ trong khoảng thời gian 2 - 3 ngày, các dòng vi khuẩn tạo thành vòng pellicle màu trắng đục cách mặt môi trường khoảng 0,5 – 1 cm (Hình 5). Chứng tỏ các dòng vi khuẩn này đều có khả năng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí, đồng thời chúng phát triển và làm thay đổi màu môi trường NFb ban đầu.
Kết quả này cũng phù hợp với với những nghiên cứu trước đây của tác giả Nguyễn Khánh Ngọc (2013) về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa, nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Tâm (2011) về vi khuẩn nội sinh trong cây mía và nghiên cứu của Phạm Thanh Sang (2014) về vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá.
Bảng 8: Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc
STT Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu
1 DR1 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 2 DR2 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 3 DR3 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 4 DR4 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 5 DR5 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 6 DR6 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 7 DR7 Rễ Lai Vung – Đồng Tháp 8 DR8 Rễ Lai Vung – Đồng Tháp 9 DT1 Thân Châu Thành – Đồng Tháp 10 DT2 Thân Châu Thành – Đồng Tháp
11 DT3 Thân Lai Vung – Đồng Tháp
12 DT4 Thân Lai Vung – Đồng Tháp
13 DL1 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 14 DL2 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 15 DL3 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 16 DL4 Lá Lai Vung – Đồng Tháp 17 DL5 Lá Lai Vung – Đồng Tháp 4.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn khi cấy trên môi trường PDA đặc cho thấy, đường kính khuẩn lạc thay đổi từ 0,5mm đến 6mm sau một ngày ủ. Hầu hết các dòng vi khuẩn đều phát triển rất nhanh, thời gian để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc là 12 giờ, chậm nhất là 36 giờ. Phần lớn các vi khuẩn phân lập được đều có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, một số ít khuẩn lạc có độ nổi lài hoặc phẳng và có màu trắng ngà. Đặc điểm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc được thể hiện ở bảng 9.
Màu sắc khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng đục, 11/17 dòng chiếm tỷ lệ 64,7%; 3/17 dòng có khuẩn lạc màu trắng ngà chiếm tỷ lệ 17,6% và 3/17 dòng có khuẩn lạc màu trắng sữa chiếm tỷ lệ 17,6%.
Hình dạng khuẩn lạc:Tất cả các khuẩn lạc đều có dạng tròn, 17/17 dòng chiếm tỷ lệ 100%.
Độ nổi khuẩn lạc: Đa số khuẩn lạc có độ nổi mô, 15/17 dòng chiếm tỷ lệ 88,2% và 2/17 dòng có độ nổi lài chiếm tỷ lệ 11,8%.
Dạng bìa khuẩn lạc: Tất cả các khuẩn lạc đều có dạng bìa nguyên, 17/17 dòng chiếm tỷ lệ 100%.
Kích thước khuẩn lạc: Đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có kích thước dao động từ 0,5 – 6mm sau khi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 30oC khoảng từ 12 - 36h.
Bảng 9: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc
STT Dòng vi
khuẩn Hình dạng Màu sắc Độ nổi Dạng bìa
Kích thước (mm) 1 DR1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 2 2 DR2 Tròn Trắng ngà Lài Nguyên 6 3 DR3 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 2 4 DR4 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,9 5 DR5 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,2 6 DR6 Tròn Trắng ngà Mô Nguyên 0,5 7 DR7 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1 8 DR8 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 0,8 9 DT1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,5 10 DT2 Tròn Trắng đục Lài Nguyên 6
11 DT3 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 1
12 DT4 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 0,8
13 DL1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 4
14 DL2 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 2
15 DL3 Tròn Trắng ngà Mô Nguyên 0,5