Từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá thu được ở huyện Châu Thành và huyện Lai Vung thuộc tỉnh Đồng Tháp đã phân lập được 17 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA đặc. Hầu hết các dòng vi khuẩn này phân bố ở cả rễ, thân và lá của cây Diếp cá. Vi khuẩn phân lập được tập trung nhiều nhất ở rễ là 8 dòng chiếm tỷ lệ 47,06%, kế đến ở lá là 5 dòng chiếm tỷ lệ 29,41% và ở thân là 4 dòng chiếm tỷ lệ 23,53%. Khi được chủng vào môi trường NFb bán đặc và ủ trong khoảng thời gian 2 - 3 ngày, các dòng vi khuẩn tạo thành vòng pellicle màu trắng đục cách mặt môi trường khoảng 0,5 – 1 cm (Hình 5). Chứng tỏ các dòng vi khuẩn này đều có khả năng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí, đồng thời chúng phát triển và làm thay đổi màu môi trường NFb ban đầu.
Kết quả này cũng phù hợp với với những nghiên cứu trước đây của tác giả Nguyễn Khánh Ngọc (2013) về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa, nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Tâm (2011) về vi khuẩn nội sinh trong cây mía và nghiên cứu của Phạm Thanh Sang (2014) về vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá.
Bảng 8: Vị trí và địa điểm thu mẫu của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc
STT Dòng vi khuẩn Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu
1 DR1 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 2 DR2 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 3 DR3 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 4 DR4 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 5 DR5 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 6 DR6 Rễ Châu Thành – Đồng Tháp 7 DR7 Rễ Lai Vung – Đồng Tháp 8 DR8 Rễ Lai Vung – Đồng Tháp 9 DT1 Thân Châu Thành – Đồng Tháp 10 DT2 Thân Châu Thành – Đồng Tháp
11 DT3 Thân Lai Vung – Đồng Tháp
12 DT4 Thân Lai Vung – Đồng Tháp
13 DL1 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 14 DL2 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 15 DL3 Lá Châu Thành – Đồng Tháp 16 DL4 Lá Lai Vung – Đồng Tháp 17 DL5 Lá Lai Vung – Đồng Tháp 4.1.1. Đặc điểm khuẩn lạc
Quan sát và mô tả đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn khi cấy trên môi trường PDA đặc cho thấy, đường kính khuẩn lạc thay đổi từ 0,5mm đến 6mm sau một ngày ủ. Hầu hết các dòng vi khuẩn đều phát triển rất nhanh, thời gian để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc là 12 giờ, chậm nhất là 36 giờ. Phần lớn các vi khuẩn phân lập được đều có khuẩn lạc dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, màu trắng đục, một số ít khuẩn lạc có độ nổi lài hoặc phẳng và có màu trắng ngà. Đặc điểm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc được thể hiện ở bảng 9.
Màu sắc khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng đục, 11/17 dòng chiếm tỷ lệ 64,7%; 3/17 dòng có khuẩn lạc màu trắng ngà chiếm tỷ lệ 17,6% và 3/17 dòng có khuẩn lạc màu trắng sữa chiếm tỷ lệ 17,6%.
Hình dạng khuẩn lạc:Tất cả các khuẩn lạc đều có dạng tròn, 17/17 dòng chiếm tỷ lệ 100%.
Độ nổi khuẩn lạc: Đa số khuẩn lạc có độ nổi mô, 15/17 dòng chiếm tỷ lệ 88,2% và 2/17 dòng có độ nổi lài chiếm tỷ lệ 11,8%.
Dạng bìa khuẩn lạc: Tất cả các khuẩn lạc đều có dạng bìa nguyên, 17/17 dòng chiếm tỷ lệ 100%.
Kích thước khuẩn lạc: Đường kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được có kích thước dao động từ 0,5 – 6mm sau khi cấy trên môi trường PDA và ủ ở 30oC khoảng từ 12 - 36h.
Bảng 9: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc
STT Dòng vi
khuẩn Hình dạng Màu sắc Độ nổi Dạng bìa
Kích thước (mm) 1 DR1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 2 2 DR2 Tròn Trắng ngà Lài Nguyên 6 3 DR3 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 2 4 DR4 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,9 5 DR5 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,2 6 DR6 Tròn Trắng ngà Mô Nguyên 0,5 7 DR7 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1 8 DR8 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 0,8 9 DT1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1,5 10 DT2 Tròn Trắng đục Lài Nguyên 6
11 DT3 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 1
12 DT4 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 0,8
13 DL1 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 4
14 DL2 Tròn Trắng sữa Mô Nguyên 2
15 DL3 Tròn Trắng ngà Mô Nguyên 0,5
16 DL4 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 4
17 DL5 Tròn Trắng đục Mô Nguyên 1
Kết quả mô tả này cũng phù hợp với những mô tả về đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá của Phạm Thanh Sang (2014), trong cây mè của Phùng Văn Tạo (2013).
DR4 DR8
DT3 DT4
DL5 DT2
Hình 6: Một số dạng khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường PDA đặc
(Hình chụp, ngày 31/7/2014)
(Dòng DR4) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng DR8) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng DT3) Khuẩn lạc màu trắng sữa, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng DT4) Khuẩn lạc màu trắng sữa, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (Dòng DT2) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi lài (Dòng DL5) Khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô
4.1.2. Đặc điểm tế bào vi khuẩn
Quan sát hình thái và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép, dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần cho thấy các dòng vi khuẩn có đặc điểm như sau (Bảng 10):
Bảng 10: Đặc điểm tế bào của các dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá trên môi trường PDA đặc
STT Dòng vi khuẩn Gram * Hình dạng Chuyển động ** Kích thước vi khuẩn (µm)
Chiều dài Chiều rộng
1 DR1 - Que dài + 3,09 1,20 2 DR2 + Que dài + 3,43 0,86 3 DR3 + Que ngắn + 2,06 0,86 4 DR4 - Que dài - 3,43 1,71 5 DR5 - Que ngắn + 1,37 0,86 6 DR6 - Cầu đôi + 1,20 1,20 7 DR7 - Que ngắn + 2,23 0,86 8 DR8 - Que ngắn + 2,57 0,86 9 DT1 - Que dài - 3,43 1,37 10 DT2 - Que dài - 3,60 1,37 11 DT3 - Que ngắn + 1,71 1,03 12 DT4 - Que ngắn + 1,54 0,86 13 DL1 - Que dài - 3,43 1,71 14 DL2 - Que dài + 3,43 1,20 15 DL3 - Cầu đôi + 2,57 1,37 16 DL4 + Que ngắn + 1,20 0,86 17 DL5 - Que ngắn + 1,89 0,86
(Ghi chú: *: - Gram âm, + Gram dương; **: - không chuyển động, + có chuyển động)
Khả năng chuyển động: Đa số các vi khuẩn đều có khả năng chuyển động do có chiên mao, 13/17 dòng có khả năng chuyển động, chiếm tỷ lệ 76,5% và 4/17 dòng không có khả năng chuyển động, chiếm tỷ lệ 23,5%.
Hình dạng: Phần lớn các dòng vi khuẩn đều có dạng hình que dài, 7/17 dòng có dạng hình que dài, chiếm tỷ lệ 41,2%, 8/17 dòng có dạng hình que ngắn, chiếm tỷ lệ 47,1%, 2/17 dòng có dạng cầu đôi chiếm tỷ lệ 11,8%.
Hình 7: Vi khuẩn có Gram âm (DR1) và Gram dương (DL4) ở vật kính 100
Hình chụp, ngày 4/11/2014
DR1 DL4
khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá của Phạm Thanh Sang (2014), trong cây mía của Nguyễn Thị Phương Tâm (2011).
4.2. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa trên lượng NH4 dựa trên lượng NH4
+
(ammonium) tổng hợp được
Tiến hành khảo sát khả năng cố định đạm dựa vào lượng NH4+ (ammonium) do vi khuẩn sinh ra bằng phương pháp so màu Indophenol Blue. Kết quả cho thấy, tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng cố định đạm. Mười bảy dòng vi khuẩn phân lập được từ cây Diếp cá được chia thành 3 nhóm (nhóm vi khuẩn nội sinh ở rễ, ở thân và ở lá) để khảo sát và so sánh lượng ammonium do vi khuẩn tạo ra ở các ngày 2, ngày 4 và ngày 6 sau khi chủng trong môi trường Nfb lỏng, không N, không Yeast extract. Hầu hết các dòng vi khuẩn khi khảo sát ở ngày thứ 2 sau khi chủng, nhận thấy có một lượng đạm nhất định trong môi trường, đến ngày thứ 4 lượng đạm có chiều hướng giảm xuống và tăng lên đạt mức cực đại ở ngày thứ 6. Tuy nhiên có một số dòng (DT4, DL1, DL3) có lượng đạm tăng ở ngày 4 và giảm ở ngày 6 sau khi chủng (Bảng 11).
Bảng 11: Khả năng tổng hợp đạm của 17 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ cây Diếp cá
STT Dòng vi khuẩn
Hàm lượng NH4+ trung bình (µg/mL)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 DR1 0,27bcd 0,09h 0,71e 2 DR2 0,34ab 0,16e 0,70ef 3 DR3 0,32abc 0,18d 1,39a 4 DR4 0,39a 0,19d 0,74d 5 DR5 0,38a 0,14f 0,66g 6 DR6 0,25cd 0,01i 0,68fg 7 DR7 0,38a 0,09h 0,80c 8 DR8 0,34d 0,12g 0,67g 9 DT1 0,26bcd 0,02i 0,75d 10 DT2 0,23d 0,14f 0,90b 11 DT3 0,22d 0,01i 0,58h 12 DT4 0,06e 0,44a 0,28i 13 DL1 0,09e 0,38b 0,27i 14 DL2 0,36a 0,18d 0,87b 15 DL3 0,06e 0,31c 0,27i 16 DL4 0,33abc 0,02i 0,75d 17 DL5 0,32abc 0,14fg 0,58h CV (%) 17,99 5,45 2,03
(Ghi chú: Những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5%.)
4.2.1. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ cây Diếp cá (Nhóm 1) được từ rễ cây Diếp cá (Nhóm 1)
Ở ngày thứ 2 sau khi chủng vi khuẩn vào môi trường NFb lỏng, không N, không Yeast extract, kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ cây Diếp cá có được lượng đạm nhất định dao động từ 0,25 – 0,39µg/mL. Sang ngày thứ 4 sau khi chủng lượng đạm lại giảm xuống, điều này chứng tỏ lượng đạm ở ngày thứ 2 không phải do các dòng vi khuẩn ở rễ tổng hợp được. Lượng đạm có được là do lượng Yeast extract được bổ sung vào môi trường trong quá trình nuôi tăng sinh vi khuẩn (1g Yeast extract/1L môi trường NFb). Khi trong môi trường có đạm, vi khuẩn sẽ sử dụng nguồn đạm này để duy trì số lượng mà không cần tổng hợp đạm.
Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, vi khuẩn đã sử dụng hết lượng đạm còn lại trong môi trường và bắt đầu tổng hợp được một lượng đạm tương đối thấp, dao động từ 0,01 – 0,19 µg/mL. Trong đó lượng đạm cao nhất do dòng DR4 tổng hợp được (0,19 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại và thấp nhất là dòng DR6 (0,01 µg/mL) (Bảng 12).
Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, đa số các dòng đều tạo ra một lượng đạm tăng đáng kể so với ngày thứ 2 và ngày thứ 4. Dòng DR3 có lượng đạm cao nhất (1,39 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại. Dòng DR7 cũng là dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm cao (0,80 µg/mL). Thấp nhất là dòng DR5 với lượng đạm tổng hợp được là 0,66 µg/mL, tuy nhiên lượng đạm này đã cao hơn rất nhiều so với lượng đạm mà dòng DR5 có được ở ngày thứ 4 (0,14 µg/mL).
Bảng 12: Lượng ammonium do các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ tổng hợp theo thời gian (µg/mL)
STT Dòng vi khuẩn
Hàm lượng NH4+ trung bình (µg/mL)
Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 DR1 0,27c 0,09d 0,71d 2 DR2 0,34b 0,16b 0,70de 3 DR3 0,32b 0,18a 1,39a 4 DR4 0,39a 0,19a 0,74c 5 DR5 0,38a 0,14b 0,66g 6 DR6 0,25c 0,01e 0,68ef 7 DR7 0,38a 0,09d 0,80b 8 DR8 0,34b 0,12c 0,67fg CV (%) 5,55 8,22 1,46
(*Ghi chú: Những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%).
Có thể đây là những dòng vi khuẩn phát triển chậm, nhu cầu sử dụng đạm ít nên sau 2 ngày chủng lượng đạm trong môi trường vẫn còn tương đối cao, đến ngày 4 khi nguồn đạm dần cạn kiệt vi khuẩn bắt đầu tổng hợp đạm làm cho lượng đạm ngày 6 tăng lên đáng kể. Điều này chứng tỏ, khi trong môi trường không có đạm vi khuẩn sẽ kích hoạt enzyme nitrogenase để tổng hợp đạm, do đó lượng đạm ngày 6 tăng lên rất nhiều.
Hình 8: Hàm lượng ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân cây Diếp cá
(*Ghi chú: Những giá trị trong cùng một ngày có mẫu tự giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%) c b b a a c b c d c a b 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 DT1 DT2 DT3 DT4 Dòng vi khuẩn H à m l ư ợn g a m m o n iu m ( µ g /m l) Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 năng cố định đạm. Ở ngày 6 sau khi chủng, hàm lượng đạm cao nhất do dòng DR3 tổng hợp được (1,39 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại, kế đến là dòng DR7 với lượng đạm tổng hợp được là 0,80 µg/mL. Như vậy, dòng DR3 và dòng DR7 là hai dòng vi khuẩn triển vọng của nhóm vi khuẩn phân lập từ rễ.
4.2.2. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân cây Diếp cá (Nhóm 2) được từ thân cây Diếp cá (Nhóm 2)
Trường hợp 1: các dòng vi khuẩn có lượng đạm giảm ở ngày 4 và tăng ở ngày 6 (DT1, DT2, DT3)
Tương tựnhư các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ, sau khi chủng các dòng vi khuẩn phân lập từ thân (DT1, DT2, DT3) vào môi trường NFb lỏng, không N, không Yeast extract. Ở ngày thứ 2 sau khi chủng khảo sát thấy lượng đạm dao động từ 0,22 – 0,26 µg/mL. Tuy nhiên lượng đạm này không phải do các dòng vi khuẩn ở thân tổng hợp được. Lượng đạm có được là do lượng Yeast extract được bổ sung vào môi trường trong quá trình nuôi tăng sinh vi khuẩn.
Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, vi khuẩn đã thích ứng với môi trường và sinh trưởng mạnh nên đã sử dụng hết lượng đạm có sẵn trong môi trường và bắt đầu tổng hợp đạm. Do đó lượng đạm ở ngày thứ 4 chỉ đạt ở mức thấp dao động từ 0,01 – 0,14 µg/mL.
Đến ngày thứ 6 sau khi chủng, cả 3 dòng DT1, DT2, DT3 đều tạo ra được một lượng đạm khá cao so với ngày thứ 4. Dòng DT2 có lượng đạm cao nhất (0,90 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với 2 dòng DT1 và DT3. Tuy nhiên, dòng DT1 cũng là dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp đạm cao (0,75 µg/mL). Thấp nhất là dòng DT3 với lượng đạm tổng hợp được là 0,58 µg/mL.
Cũng như các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ, các dòng vi kuẩn phân lập từ thân (DT1, DT2, DT3) có thể là những dòng vi khuẩn phát triển chậm, nên đến ngày thứ 4 sau khi chủng vi khuẩn mới sử dụng hết lượng đạm có sẵn trong môi trường. Khi trong môi trường cạn kiệt chất dinh dưỡng và lượng đạm không đủ cho vi khuẩn sử dụng thì chúng bắt đầu tổng hợp đạm, dẫn đến lượng đạm ngày 6 tăng lên đáng kể.
Trường hợp 2: dòng vi khuẩn có lượng đạm tăng ở ngày 4 và giảm ở ngày 6 (DT4)
Ởngày thứ 2 sau khi chủng, dòng DT4 đã sử dụng hết lượng đạm có sẵn trong môi trường và bắt đầu tổng hợp được một lượng đạm tương đối thấp (0,06 µg/mL).
Đến ngày thứ 4 sau khi chủng, do vi khuẩn đã thích nghi với môi trường và quá trình sinh trưởng mạnh nên dòng DT4 tổng hợp được một lượng đạm khá cao (0,44 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng DT1, DT2 và DT3.
Ở ngày thứ 6 sau khi chủng, lượng đạm của dòng DT4 giảm xuống thấp nhất (0,28 µg/mL), khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các dòng còn lại.