3.2.1. Thu thập và xử lý mẫu
Thu thập
Hai mẫu Diếp cá được thu ở huyện Châu Thành và một mẫu Diếp cá được thu ở huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp.
Dùng dao đào đất xung quanh cây Diếp cá để có thể thu được toàn bộ cây Diếp cá. Sau đó cho vào bọc nylon và mang về phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật để tiến hành xử lý mẫu và phân lập.
Xử lý mẫu
Tách phần đất bám xung quanh rễ. Cho 20g đất hòa tan vào 80mL nước cất để sử dụng vào việc đo pH của đất vùng rễ.
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá dưới vòi nước chảy. Tách rời rễ, thân và lá cây Diếp cá (để ráo tự nhiên, để riêng từng bộ phận trong bọc nylon buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (5°C) nếu chưa phân lập ngay).
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm rồi làm khô chúng bằng giấy hút ẩm.
Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% (trong 30 giây), rửa sạch lại bằng nước cất, tiếp tục khử trùng bằng dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy trải lên môi trường PDA đặc
để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có khuẩn lạc phát triển thì cần phải xử lý khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật có trong đất.
3.2.2. Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem giã nhuyễn trong cối, sau đó cho thêm 1 - 2mL nước cất vô trùng vào mẫu và trộn đều.
Hút 100µl phần dịch trong cho vào 900µl nước cất đã chuẩn bị sẵn trong Eppendorf (đã được pha loãng 5 lần), đem vortex. Tiến hành pha loãng mẫu 10 lần, 100 lần,… nếu cần thiết.
Hút 100µl dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm chứa môi trường NFb bán đặc, đậy nắp lại rồi đem ủ ở 30°C để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 2 - 3 ngày ủ, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một vòng màu trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 2 - 6mm. Hút 5µl dung dịch từ vòng pellicle cấy trải sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30°C để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Sau 2-3 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, đều và phải nằm trên đường cấy tiến hành cấy chuyển sang những đĩa khác cho tới khi quan sát dưới kính hiển vi thấy vi khuẩn đã ròng. Trữ mẫu đã ròng vào ống nghiệm chứa môi trường PDA đặc (thạch nghiêng).
3.2.3. Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và kích thước vi khuẩn
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng, kích thước và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
- Nhỏ một giọt nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Khử trùng kim cấy hay kim mũi giáo trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy, lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật.
- Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45°, hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
- Quan sát mẫu vật: quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học từ vật kính 10X sang vật kính 40X, để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
Đo kích thước tế bào vi khuẩn
Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong nước cất vô trùng tiếp tục đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần.
Cách chuẩn bị mẫu:
- Nhỏ 10µl nước cất vô trùng lên kính mang vật.
- Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
- Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. - Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật một góc 45°, rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí.
Thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính được dùng để đo kích thước tế bào vi khuẩn
- Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính.
- Thước trắc vi thị kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm, được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài là 10µm.
Phương pháp đo:
- Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh cho thấy ảnh rõ của thước. - Xê dịch thước trắc vi thị kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho 2 thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính thế nào cho 1 vạch của thước trắc vi vật kính trùng với 1 vạch của thước trắc vi thị kính và 1 vạch thứ 2 nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
- Đếm số khoảng của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. - Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau:
m n
N x *10
N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35
- Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. Di chuyển vi mẫu sao cho 1 đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm vạch thứ 2 trùng với đầu kia của mẫu đo.
- Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính nằm trong hai vạch này.
- Tính kích thước của vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của 2 thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.4. Nhuộm Gram vi khuẩn
Sau khi quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn. Quy trình nhuộm Gram được thực hiện như sau:
- Lấy 10µl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhầm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal Violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để yên 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ từ 1-2 giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy cà để trong một phút. - Rửa bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70° thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sao cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ 1-2 giọt Fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để yên 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của Fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
- Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
3.2.5. Khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ 3.2.5.1.Nguyên tắc 3.2.5.1.Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982).
3.2.5.2.Hóa chất
- Chuẩn bị dung dịch KCl : Hòa tan 15g KCl vào nước cất để được 100mL. - Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào nước cất để được 1000mL. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 4mL Stock (NH4+) để được 200mL, sau cùng được dung dịch 2µg/mL.
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside vào nước cất để được 500mL.
- Hypochloride buffer: hòa tan 15mL NaOCl và 5g NaOH vào nước cất để được 500mL.
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng (không đạm). 3.2.5.3.Tiến hành thí nghiệm
- Cho 15mL môi trường NFb lỏng vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng. 3.2.5.4.Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
- Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất để được 500mL.
Hình 3. Sự thay đổi màu của dãy dung dịch NH4+ theo phương pháp Indophenol Blue
(*Ghi chú: Từ trái qua phải của hình là 0; 1; 2; 3; 4 và 5 μg/mL) Hình chụp, ngày 6/10/2014
0 1 2 3 4 5
- Pha buffer: cho 15mL NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 8g NaOH vào nước cất để được 800mL.
- Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm:
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5mL H2O, 0mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4mL H2O, 1mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3mL H2O, 2mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2mL H2O, 3mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1mL H2O, 4mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0mL H2O, 5mL NH4+, 5mL buffer, 5mL thuốc thử
- Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn:
Hút 1,5mL dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào Eppendorf.
Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Hút 1mL dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4mL H2O, 5mL buffer, 5mL thuốc thử. Vortex cho đều và tiến hành đo phổ OD.
Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ đồ thị trên Excel có thể tính được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
Đường kính halo
E = --- x 100 (Nguyen et al., 1992) Đường kính khuẩn lạc
3.2.6. Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan
- Chuẩn bị môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999). (Bảng 6)
- Dùng micropipette hút lần lượt 5µl dung dịch vi khuẩn nội sinh từ mỗi ống nghiệm môi trường tăng sinh PDA lỏng có bổ sung yeast extract 1% nhỏ lên đĩa môi trường chứa lân khó tan (NBRIP đặc), mỗi đĩa 3 dòng và 3 lần lặp lại. - Sau đó ủ ở 30oC, theo dõi sự phát triển của chúng từ 12 – 24 giờ, dòng nào phát
triển được trên môi trường NBRIP thì có khả năng hòa tan lân khó tan.
- Quan sát khả năng tạo vòng halo. Đo đường kính vòng halo và đường kính khuẩn lạc vào các ngày 2, 4, 6 sau khi ủ.
Độ hữu hiệu của các dòng vi khuẩn hòa tan lân khó tan Hiệu quả hòa tan lân E được tính theo công thức:
3.2.7. Khảo sát khả năng tổng hợp IAA 3.2.7.1.Chuẩn bị 3.2.7.1.Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng (không Tryptophan).
- Cho 15mL môi trường NFb lỏng vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121°C trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng).
3.2.7.2.Hóa chất
- Thuốc thử Salknowski R2: 4,5g FeCl3 trong 1 lít dung dịch H2SO4 10,8 M - Chuẩn bị phosphat buffer 200 mL:
Dung dịch A: 0,136g KH2SO4 trong 100mL nước cất
0 2,5 5 10 20 30 40 80
Hình 4. Sự thay đổi màu của dãy dung dịch IAA theo phương pháp Salkowski
(*Ghi chú: từ trái qua phải của hình là 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40 và 80 μg/mL) Hình chụp, ngày 13/10/2014
3.2.7.3.Phương pháp
Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn theo phương pháp Salkowski IAA (Glickmann và Dessaux, 1995).
- Lấy 39mL dung dịch A, 61mL dung dịch B cho thêm nước cất vừa đủ 200mL, chỉnh pH = 7.
- Hút 1,5mL dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào Eppendorf. - Ly tâm 5500 vòng/phút trong 10 phút.
- Hút cẩn thận 1mL phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
- Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530nm.
- Chuẩn bị đường chuẩn IAA: Cân 0,0016g IAA thương mại hòa tan với 10mL phosphat buffer được nồng độ là 160µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 0; 2,5; 5; 10; 20; 30; 40; 80 µg/mL.
- Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 80µg/mL.
- Kết quả đo OD các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
- Các số liệu thu thập được được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab. 3.2.8. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn - Chuẩn bị môi trường PDA (Bảng 2)
- Hút 50µl dung dịch pha loãng của vi khuẩn gây bệnh (E. coli, Aeromonas hydrophyla) trải lên bề mặt đĩa môi trường.
- Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào dung dịch vi khuẩn nuôi đạt mật số 10 7 - 108 tế bào/mL trong vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn gây bệnh (Bauer et al., 1966).
- Ủ 35°C trong 12h – 24h. Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn.
- Đo đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng trong 3 ngày liên tiếp.
Công thức tính đường kính vòng vô khuẩn
Đường kính vòng vô khuẩn = Đường kính vòng sáng – Đường kính khuẩn lạc (Hernandez et al., 2005)
3.2.9. Nhận diện một số dòng vi khuẩn nội sinh
Quy trình trích DNA từ khuẩn lạc của Trần Nhân Dũng (2011)
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn cao để định danh bằng kỹ thuật PCR.
- Chọn khoảng 10 khuẩn lạc ròng, cho vào tuýp 2,2 mL (ưu tiên chọn những khuẩn lạc rời).
- Cho 1 viên bi sắt vào tuýp và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1 mL Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. - Ly tâm 13000 rpm/5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tuýp mới.
- Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 rpm/5 phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 µl Ethanol 70%, ly tâm 13000 rpm/5 phút.