phân lập vi khuẩn nội sinh thân cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh tây ninh

... nitrate nông sản Vì vi c nghiên cứu Phân lập vi khuẩn nội sinh thân bắp trồng đất xám tỉnh Tây Ninh cần thiết Mục tiêu nghiên cứu đề tài :  Phân lập dòng vi khuẩn nội sinh thân bắp có khả cố định... CẦN THƠ VI N NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH THÂN CÂY BẮP TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM Ở TỈNH TÂY NINH CÁN... 4.1 Phân lập đặc điểm dòng vi khuẩn nội sinh phân lập .24 4.1.1 Phân lập vi khuẩn 24 4.1.2 Đặc điểm dòng vi khuẩn phân lập .27 4.2 Khả cố định đạm dòng vi khuẩn phân lập

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH THÂN CÂY BẮP TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM Ở TỈNH TÂY NINH CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Gs. Ts CAO NGỌC ĐIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN MINH THƯ MSSV: 3103992 LỚP:VI SINH VẬT HỌC K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH THÂN CÂY BẮP TRỒNG TRÊN ĐẤT XÁM Ở TỈNH TÂY NINH CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Gs. Ts CAO NGỌC ĐIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN MINH THƯ MSSV: 3103992 LỚP:VI SINH VẬT HỌC K36 Cần Thơ, Tháng 11/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) GS. Ts Cao Ngọc Điệp Nguyễn Minh Thư DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn Gs.Ts Cao Ngọc Điệp và cố vấn học tập –cô Nguyễn Thị Pha đã tận tình hướng dẫn, góp ý và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn đến! - Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học cùng quý thầy cô đã hướng dẫn và chỉ dạy tôi trong suốt quá trình học tập. - Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ, Chị Trần Thị Giang cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ cho tôi thực hiện tốt đề tài. Cuối cùng tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến Cha, Mẹ và những người thân luôn luôn ủng hộ và động viên tôi, tạo điều kiện tốt để tôi học tập và là nguồn động lực lớn lao giúp tôi vượt qua mọi khó khăn trong cuộc sống. Tôi xin chân thành cảm ơn! Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Năm mươi mốt dòng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường NFb và môi trường LGI từ thân cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh Tây Ninh đều có khả năng tổng hợp đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA chiếm tỉ lệ 100%. Trong 51 dòng vi khuẩn phân lập được khảo sát thì dòng TTN9 là dòng vi khuẩn vừa có khả năng cố định đạm và hòa tan lân, vừa có khả năng tổng hợp IAA đạt hàm lượng cao. Lượng NH4+ đạt (4,59 mg/l), P2O5 đạt (117,64 mg/l) và lượng IAA đạt (12,71 mg/l). Từ khóa: Cây bắp, cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT .......................................................................................................... LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................... TÓM LƯỢC ....................................................................................................................i MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................................iv DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................................... v CÁC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................................................vi CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU ............................................................................................ 1 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................................ 3 2.1 Sơ lược về cây bắp .................................................................................................3 2.2 Vi khuẩn nội sinh ...................................................................................................4 2.2.1 Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ ...........................................................................6 2.2.2 Vi khuẩn Azospirillum ....................................................................................6 2.2.3 Vi khuẩn Azotobacter......................................................................................7 2.2.4 Vi khuẩn Burkholderia....................................................................................7 2.2.5 Vi khuẩn Enterobacter ....................................................................................8 2.2.6 Vi khuẩn Gluconacetobacter .........................................................................8 2.2.7 Vi khuẩn Herbaspirillum ................................................................................9 2.2.8 Vi khuẩn Klebsiella ........................................................................................9 2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh .................................................................10 2.3.1 Khả năng cố định đạm ..................................................................................10 2.3.2 Khả năng hòa tan lân khó tan ........................................................................11 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam .................12 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 14 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện ...........................................................................14 3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm ......................................................................14 3.1.2.Thời gian thực hiện .......................................................................................14 3.2 Phương tiện nghiên cứu .......................................................................................14 3.2.1 Dụng cụ, thiết bị ............................................................................................ 14 Chuyên nghành Vi Sinh Vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.2.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................15 3.2.3 Hóa chất và môi trường .................................................................................15 3.3 Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................19 3.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh..19 3.3.2 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc .............................................20 3.3.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ........................20 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ...................................................................... 24 4.1 Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập .....................24 4.1.1 Phân lập vi khuẩn .......................................................................................... 24 4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập ...............................................27 4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập................................ 31 4.3 Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập ........................................35 4.4 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn đã phân lập .............................. 38 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 40 5.1 Kết luận ................................................................................................................40 5.2 Đề nghị .................................................................................................................40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 41 PHỤ LỤC ........................................................................................................................ Phụ lục. Kết quả 1. Bảng 1. Kết quả đo đạm (mg/l) 2. Bảng 2. Kết quả đo lân (mg/l) 3. Bảng 3. Kết quả đo IAA (mg/l) Chuyên nghành Vi Sinh Vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại hạt ........................................................ 4 Bảng 2. Công thức môi trường LGI (Cavalcante và Döbereiner, 1988) ...................... 16 Bảng 3. Công thức môi trường NFb (Krieg và Döbereiner, 1984) .............................. 17 Bảng 4. Công thức môi trường Burk’s không đạm (Park et al., 2005) ........................ 18 Bảng 5. Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal., 1999) ............................................ 18 Bảng 6. Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập ............................................... 24 Bảng 7. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập ................. 27 Bảng 8. Tỷ lệ (%) về các đặc điểm khuẩn lạc của dòng vi khuẩn đã phân lập ............ 29 Bảng 9. Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường Burk’s không đạm ............. 31 Bảng 10. Khả năng hòa tan P2O5 (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày nuôi trong môi trường NBRIP lỏng ................. 35 Bảng 11. Khả năng tổng hợp IAA (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 2 ngày, 4ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường LGI và NFb lỏng (không tryptophan) ......................................................................................... 38 Chuyên nghành Vi Sinh Vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Vi khuẩn sau 24 giờ nuôi trên môi trường bán đặc……………………... ...... 26 Hình 2. Đặc điểm một số dạng khuẩn lạc ………………..………………………... .. 30 Hình 3 . Đường chuẩn đo đạm.……………………………………………..……... .. 32 Chuyên nghành Vi Sinh Vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CÁC TỪ VIẾT TẮT IAA nif CV Df LSD MS SS VK DC : : : : : : : : : indole – 3 – acetic acid nitrogen fixation Coefficient of variation degree of freedom Least Significant Difference Mean Square Sum of Square Vi khuẩn Đối chứng Chuyên nghành Vi Sinh Vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU Nước ta là nước nông nghiệp với khoảng 2/3 dân số sống ở nông thôn vì vậy mà sản xuất lương thực được Đảng và nhà nước ta ưu tiên hàng đầu, là nhiệm vụ quan trọng trước mắt cũng như lâu dài trong chiến lược phát triển kinh tế-xã hội. Trong những năm gần đây sản xuất lương thực đã có những bước phát triển đáng kể trong đó bắp là cây màu lương thực đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế. Ngày nay cây bắp (hay còn gọi là cây ngô) đứng hàng thứ ba sau lúa nước và lúa mì, hàng năm có khỏng 139-141 triệu ha bắp được trồng trên toàn thế giới với nâng suất bình quân khoảng 3,8-4,5 tấn/ha. Bắp rất giàu dinh dưỡng như: lipid, protein, vitamin vì thế cây bắp được coi là nguồn năng lượng tốt. Bắp chính là cây lương thực có năng suất cao lại chứa hàm lượng dinh dưỡng quan trọng nên cây bắp mang nhiều giá trị sử dụng và giá trị kinh tế, có thể sử dụng bắp làm lương thực, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến, hoặc làm thức ăn cho gia súc, gia cầm. Ở Việt Nam cây bắp được trồng cách đây khoảng 300 năm, đến nay cây bắp được trồng trong tất cả các vùng miền trong cả nước, bắp là cây lương thực đứng hàng thứ hai sau lúa nước, giữ một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân nói chung và nền sản xuất nông nghiệp nói riêng. Từ năm 1990 trở lại đây diện tích và năng suất bắp được tăng lên đáng kể do việc đưa các giống bắp lai vào sản xuất. Năm 1990 diện tích trồng bắp lai ở nước ta là 0%, năm 2000 diện tích trồng bắp lai là 60% sản lượng tăng từ 0,65 triệu tấn lên hơn 2 triệu tấn, nhưng với số lượng lương thực như vậy không đáp ứng nổi nhu cầu lương thực nước ta hiện nay, năm 2001 nước ta nhập khẩu hơn 1 triệu tấn bắp, năm 2005 nhu cầu sử dụng bắp của nước ta là 4-5 triệu tấn, dự tính đến năm 2010 là 6-8 triệu tấn (Trần Hồng Uy, 1997). Nhờ thành tựu của việc lai tạo giống mới đã đưa ra nhiều loại giống mới có khả năng thích ứng rộng trên nhiều vùng sinh thái khác nhau, cho năng suất cao và có thời gian sinh trưởng phù hợp với mọi thời vụ và địa hình. Trong đó bắp lai đã đóng góp phần tích cực vào sự phát triển của cây bắp ở Việt Nam nói chung và tỉnh Tây Ninh nói riêng. Đất trồng bắp ở vùng này chủ yếu là đất xám. Đất xám có nguồn gốc từ đất phù sa cổ thành phần cơ giới nhẹ, thoát nước tốt, tuy hàm lượng mùn và dinh dưỡng Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT không cao nhưng độ ẩm cây héo thấp, đây cũng là loại đất thích hợp để trồng bắp nhưng cần bón nhiều phân NPK hơn đối với đất bazan. Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng rễ, thân, lá, quả của thực vật. Vùng rễ là nơi xuất phát nhiều vi khuẩn nội sinh chui vào rễ, thân, lá để sống nội sinh; sau khi xâm nhập vào cây chủ có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hoặc di chuyển đi khắp nơi trong cây đến các hệ mạch của rễ, thân, lá, hoa (Zinniel et al., 2002), thúc đẩy các quá trình chuyển hóa trong cây, sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ (Harari et al ., 1988). Hiện nay các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến những loài vi khuẩn nội sinh có đặc tính tốt như vi khuẩn có khả năng cố định nitơ trong không khí (Xu et al ., 1998), tổng hợp kích thích tố auxin (Barbieri et al., 1986), giúp loại bỏ các chất gây ô nhiễm môi trường (Rosenblueth và Martinez, 2006), tăng hàm lượng các chất khoáng, tăng khả năng kháng bệnh (Fahey et al ., 1991), hòa tan lân khó tan cho cây trồng hấp thụ tốt chất dinh dưỡng (Lăng Ngọc Dậu et al ., 2007). Đã có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong các loài cây ở Việt Nam như Nguyễn Thị Thu Hà et al. (2008) đã phân lập được vi khuẩn nội sinh trong một số loại cỏ chăn nuôi, Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi (2009), Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng (2010) phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An và huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang. Xu hướng mới trong sản xuất hiện nay là giảm lượng phân bón vô cơ, tăng cường phân sinh học góp phần giảm giá thành sản xuất, giảm sự phụ thuộc vào nguồn vật liệu hóa thạch, giảm ô nhiễm môi trường, giảm hàm lượng nitrate trong nông sản. Vì vậy việc nghiên cứu về “Phân lập vi khuẩn nội sinh thân cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh Tây Ninh” là cần thiết. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài :  Phân lập được những dòng vi khuẩn nội sinh thân cây bắp có khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) trồng ở các huyện Tân Biên, Châu Thành, Gò Dầu, Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 2 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây bắp Bắp hay còn gọi là Ngô (danh pháp khoa học: Zea mays L.), thuộc họ hoà thảo Poacea và tộc Tripsaceae, không giống những hoa hoàn chỉnh của hầu hết những loài hoà thảo, ngô có hoa đực và hoa cái tách biệt trên cùng một cây. Hoa đực ở đỉnh ngọn thường gọi là cờ ngô và hoa cái sinh ra ở bên trong những mầm phụ được gọi là bắp. Cấu tạo đó được coi là hoa đơn tính cùng gốc (hay đơn tính đồng chu). Bắp là một loại cây lương thực được thuần canh tại khu vực Trung Mỹ và sau đó lan tỏa ra khắp châu Mỹ. Bắp được gieo trồng ở phần còn lại của thế giới sau khi có tiếp xúc của người châu Âu với châu Mỹ vào cuối thế kỷ 15, đầu thế kỷ 16. Ở Việt Nam cây bắp vào nước ta theo hai hướng là Trung Quốc xuống và từ Inđônêxia và Miến Điện qua. Theo Lê Quý Đôn trong “Vân Đài loại ngữ “ hồi đầu đời Khang Hi (1662-1762), Trần Thế Vinh, người huyện Tiên Phong (Sơn Tây, phủ Quảng Oai) đi sứ sang Trung Quốc thấy loại cây mới này đã mang về trồng và gọi là “Bắp-ngọc mễ”. Khắp cả Sơn Tây đã dùng bắp thay cho lúa gạo. Từ đó bắp được phổ biến và phát triển ra khắp đất nước. Có nhiều loại bắp, thường được xếp vào các loại khác nhau về cả tính chất và công dụng như bắp nếp (hạt màu trắng, dẻo hạt), chủ yếu để ăn, bắp tẻ (hạt màu trắng hoặc vàng), cứng nhưng sản lượng cao nên dùng làm thức ăn cho gia súc. Hai loại là bắp đường (hạt màu vàng không đều), vị ngọt và bắp rau (bắp nhỏ, ít tinh bột) dùng để ăn. Bắp là cây lương thực được gieo trồng nhiều nhất tại châu Mỹ (chỉ riêng tại Hoa Kỳ thì sản lượng đã là khoảng 270 triệu tấn mỗi năm). Các giống bắp lai ghép được các nông dân ưa chuộng hơn so với các giống bắp thông thường do có năng suất cao vì có ưu thế giống lai. Trong khi một vài giống bắp có thể cao tới 7m tại một số nơi, thì các giống bắp thương phẩm đã được tạo ra với chiều cao chỉ khoảng 2,5m. Bắp ngọt (Zea mays var. rugosa hay Zea mays var. saccharata) thông thường thấp hơn so với các giống bắp khác. Các giống bắp nếp, bắp răng ngựa ở nước ta thì có hàm lượng tinh bột cao, lượng đường ít. Trong khi các giống bắp ở Mỹ và châu Âu thường được lai tạo để có lượng tinh bột rất ít, độ ngọt cao (họ vẫn gọi là sweetcorn). Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 3 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 1: Hàm lượng dinh dưỡng trong các loại hạt Đơn vị tính: Phần trăm (%) Hàmlượng Loại hạt Bắp Tinh bột Protein Lipit Xenluloza Tro Nước 69,2 10,6 4,3 2,0 1,4 12,5 Lúa 62,4 7,9 2,2 9,9 5,7 11,9 Lúa mì 63,8 16,8 2,0 2,0 1,8 13,6 Cao lương 71,7 12,7 3,2 1,5 1,6 9,9 Kê 59,0 11,3 3,8 8,9 3,6 13,0 (Nguồn: http://ngo.vaas.org.vn/nguongoccayngoovietnam.php, ngày 12/06/2013) Trong hạt bắp chứa khá đầy đủ các chất dinh dưỡng cho người và gia súc. Bột bắp chiếm 65-83% khối lượng hạt là nguyên liệu quan trọng trong công nghệ gia công bột. Cứ 100 kg ngô hạt cho khoảng 20-21 kg gluten, 73-75 kg bột, tách mầm và ép được 1,8-2,7 kg dầu ăn và gần 4 kg khô dầu. Phôi bắp chiếm khoảng 10% khối lượng hạt, trong phôi có các loại khoáng, vitamin và khoảng 30-45% dầu. 2.2 Vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria) được tìm thấy trong hầu hết ở các loài thực vật, chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộng sinh tương hỗ, công sinh dinh dưỡng, hội sinh …Hầu hết các dạng nội ký sinh này bắt đầu xuất hiện từ vùng rễ hay bề mặt lá, tuy nhiên, một số loại có thể ký sinh trên hạt.Vi khuẩn nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học. Vi khuẩn nội sinh sản xuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay công nghiệp. Ngoài ra nó còn có tiềm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử độc trên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trình photphat và cố định đạm. Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc phát triển các ứng dụng tiềm năng công nghệ sinh học của vi khuẩn nội sinh để phát triển các giống cây trồng có khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản xuất sinh khối và nhiên liệu sinh học. Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn mà vòng đời của nó chiếm phần lớn trong cây trồng (Quispel, 1992). Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ các Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 4 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT cách sau: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như Azotobacter, Bacillus, Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae (Klebsiella, Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich, 2007).Tuy nhiên vi khuẩn nội sinh này cũng có khả năng xâm nhập qua các vị trí bị tổn thương của lá hay các mô thông qua khí khẩu (Roos và Hattingh, 1983). Bằng những con đường đó vi khuẩn có thể tiến vào lục lạp của rễ. Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể thể tập trung tại vị ví xâm nhập hay phân tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng gian bào hay hệ mạch (Zinniel et al., 2002) và thúc đẩy quá trình sinh hóa trong cây. Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc vào chủ yếu ở loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, mặc khác chúng phụ thuộc vào điều kiện môi trường và giai đoạn phát triển của cây (Pillay và Nowak, 1997). Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ mà chúng còn có thể thúc đẩy sự sinh trưởng cho cây trồng bằng cách sản xuất ra chất kích thích sự sinh trưởng (auxin, gibberellin) của thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000). Vi khuẩn nội sinh cư trú trong hệ sinh thái thích hợp tương tự như các chồi mầm ở thực vật, điều này làm cho chúng trở thành các tác nhân kiểm soát sinh học (Berg et al., 2005). Thật vậy, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng vi khuẩn nội sinh có khả năng kiểm soát được mầm bệnh trên thực vật (Sturz & Matheson, 1996; Duif et al., 1997; Krishnamurthy & Gnanamanickam, 1997). Trong một số trường hợp chúng có thể đẩy mạnh tốc độ nảy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi (Chanway,1997) và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật (Bent & Chanway, 1998). Vi khuẩn nội sinh còn có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa và các hợp chất hữu cơ mới. Nghiên cứu cơ chế sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự đa dạng sinh học của vi khuẩn nội sinh có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel et al., 2004). Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 5 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.2.1 Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực và đất, là nơi lắng đọng các chất hữu cơ, và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ và các chất do rễ tiết ra (El-Shatnawi và Makhadmeh, 2001). Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974). Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira et al., 1983; Harari et al., 1988). Vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả cây bắp và cố định đạm sinh học cho cây bắp sử dụng. 2.2.2 Vi khuẩn Azospirillum Nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn được phân lập bởi Beijerinck vào năm 1923, và được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau. Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới, và được gọi là Azospirillum (Tarrand et al., 1978). Azospirillum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, có khả năng chuyển động và có dạng hình que ngắn; kích thước biến thiên trong khoảng 0,8-1,7µm chiều rộng và 1,43,7µm chiều dài (Nguyễn Hữu Hiệp et al., 2005). Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980). Trong những năm 1984 – 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986), trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000; Richardson, 2003), sản xuất kích thích tố thực vật (Vande Broek et al., 1999), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangarajan et al., 2003). Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 6 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 2.2.3 Vi khuẩn Azotobacter Năm 1966, loài Azotobacter paspali được Döbereiner phân lập từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra vi khuẩn A. paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Đây là loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên khi Brown (1976) theo dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspalum notatum cũng được cộng sinh với sự có mặt của A. paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspalum notatum chủ yếu là bằng việc tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm. 2.2.4 Vi khuẩn Burkholderia Vi khuẩn Burkholderia được Yabuuchi et al. tìm ra vào năm 1992, đến năm 2009, Spilker et al. đã phân loại được hơn 40 loài Burkholderia, chúng có mặt khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có Burkholderia cepacia complex (Bcc), với 17 loài phụ. Trong số hơn 40 loài Burkholderia, có nhiều loài được xác nhận có khả năng cố định đạm gồm: Burkholderia vietnamiensis, Burkholderia brasilensis (dòng 130), Burkholderia kururiensis, Burkholderia tuberum, Burkholderia phymatum, Burkholderia unamae, Burkholderia tropica/tropicalis, Burkholderia xenovorans, Burkholderia phytofirmans, và Burkholderia terrae (Goris et al, 2004; CaballeroMellado et al., 2004; Reis et al., 2004; Sessitsch et al., 2005). Người ta tìm thấy nhiều dòng Burkholderia từ nốt sần cây họ đậu, loài Burkholderia tropicalis được tìm thấy trong cây mía, bắp, khóm (Cruz et al., 2001; Reis, 2004). Ở Việt Nam, Burkholderia tropica/tropicalis cũng đã được tìm thấy nội sinh trong cây khóm (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi, 2009, Cao Ngọc Điệp et al., 2009). Estrada-De Los Santos et al. (2002) cho rằng, cố định đạm là đặc tính của giống Burkholderia và những dòng Burkholderia là những ứng viên đầy hứa hẹn cho ứng dụng trong ngành công nghệ sinh học (Caballero – Mellado et al., 2007). Một số vi khuẩn nội sinh còn phân giải lân và các nguyên tố dinh dưỡng khác trong đất (Rodriguez và Fraga, 1999), ngăn chặn mầm bệnh, tạo kháng sinh, phân hủy sinh học. Vi khuẩn Burkholderia thuộc nhóm vi khuẩn gram âm có hình dạng xoắn, đường kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu, có khả năng cố định đạm. Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 7 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT trong môi trường ít khí oxy thì sẽ phát triển tốt nhất. Đa số các dòng Burkholderia có khuẩn lạc màu trắng đục, dạng tròn, có độ nổi mô, bìa nguyên, mốt số khuẩn lạc có màu vàng, bìa răng cưa, kích thước khuẩn lạc từ 0,5-1,5mm (Nguyễn Thị Minh Thư, 2010). 2.2.5 Vi khuẩn Enterobacter Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm  – Proteobacteria, hầu hết là vi khuẩn gram âm có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng của thực vật. Hwangbo et al. (2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2-ketogluconic acid. 2.2.6 Vi khuẩn Gluconacetobacter Từ khi Cavalcante và Dobereiner (1988) phân lập một loài vi khuẩn có khả năng cố đị nh N mới ở bên trong rễ và trong thân nhiều giống mía đường trồng ở nhiều nơi khác nhau ở Brasil, đặt tên là Acetobacter diazotrophicus và sau đó đổi tên là Gluconacetobacter diazotrophicus. Điểm đặc biệt là vi khuẩn này có thể cố định N trong sự hiện diện của nitrat mà điều này chính là sự giới hạn của vi khuẩn nốt rễ cộng sinh với cây đậu và nó trở nên quan trọng về kinh tế hơn so với những vi khuẩn khác sống bên trong (nội sinh) cây mía. Vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus có sản xuất ra acid hữu cơ như acid oxalic, citric, gluconic… và nhờ đó chúng có thể hòa tan lân khó tan (Maheskkumar et al ., 1999). Vi khuẩn Gluconacetobacter thuộc họ Acetobacteraceae. Đây là vi khuẩn gram âm sinh trưởng tốt nhất ở môi trường hiếu khí, ở nhiệt độ 25 – 300C và pH từ 5,5 – 6,0. Có nhiều loài khác nhau, bằng cặp mồi AC – DI chuyên biệt, người ta đã phát hiện loài Gluconacetobacter diazotrophicus hiện diện rất nhiều trong mía và các loài cây hòa bản khác nhau (Nguồn: Rosenblueth và Matínez – Romero (2006), trang 828) như bắp, lúa hoang, cỏ voi, cà rốt, khóm, củ cải đường, cải bắp và cây cà phê với đặc tính Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 8 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT ưu việt như có khả năng cố định đạm, tổng hợp auxin và gibberellins, hòa tan kẽm và lân khó tan (Muthukumarasamy et al ., 2002; Madhaiyan et al., 2004). 2.2.7 Vi khuẩn Herbaspirillum Vi khuẩn Herbaspirillum thuộc nhóm  – Proteobacteria, là vi khuẩn cố định đạm sống trong rễ của nhiều cây không phải là họ đậu, bao gồm các loại cây họ lúa có giá trị kinh tế. Các loài Herbaspirillum seropedicae và Herbaspirillum rubrisubalbicans đã được tìm thấy ở cây bắp, mía đường, cỏ, lúa hoang và lúa trồng (Baldani et al., 1986; Olivares et al., 1996); vi khuẩn này cũng được tìm thấy ở cây cỏ chăn nuôi và các cây trồng ở vùng nhiệt đới như khóm và chuối (Cruz et al., 2001). Gần đây, các nhà nghiên cứu đã phát hiện được loài Herbaspirillum frisingense mới được phân lập từ các cây cho sợi (Kirchhof et al., 2001). Herbaspirillum hầu hết các loài của chúng thuộc nhóm vi khuẩn nội sinh bắt buộc trong mô thực vật. Trong rễ chúng có khả năng cố định đạm mạnh mẽ (Baldani et al., 1986). Ngoài ra chúng còn phát tán đến cả những vùng thân và lá (Barraquio et al., 1997). 2.2.8 Vi khuẩn Klebsiella Vi khuẩn Klebsiella thuộc nhóm  – Proteobacteria, là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que, không hay ít chuyển động, kết nang, sống kỵ khí không bắt buộc. Có 2 loài quan trọng là Klebsiella pneumoniae và Klebsiella oxytoca.Vi khuẩn Klebsiella thường xuất hiện tự nhiên trong đất, một số xâm nhập vào cây trồng và sống nội sinh trong cây. Có khoảng 30% các dòng của 2 loài này có thể cố định đạm trong điều kiện kỵ khí.Theo ZX Lu (2000), vi khuẩn Klebsiella oxytoca dòng SG-11 được phân lập từ rễ lúa là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng của thực vật nhờ vào khả năng cố định đạm từ nitơ trong không khí và khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan theo lộ trình indole – 3 – pyruvic acid của chúng. Ở Ấn Độ, Jha và Kumar (2007) nghiên cứu vi khuẩn K. oxytoca dòng GR-3 được phân lập từ rễ và thân của cây cỏ đuôi mèo (Typha australis) thì nhận thấy chúng có mật số ở rễ là 6x106 CFUxg-1, khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan là 30 μg/mg trọng lượng khô, khả năng hòa tan lân khó tan là 31,5 μg/mg trọng lượng khô, và mức độ biểu hiện hoạt tính của phức hệ nitrogenase qua Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT phản ứng khử acetylene là khá cao (1.25 μmol C2H4/mg protein h-1). Sau đó, các nhà nghiên cứu sử dụng vi khuẩn K.oxytoca dòng GR-3 chủng cho giống lúa Malviya dhan-36 thì nhận thấy vi khuẩn này giúp gia tăng toàn bộ chiều dài cây và tăng hàm lượng chlorophyll-a có hiệu quả; đồng thời chúng còn kích thích sự thành lập rễ bên và rễ bất định cho cây. 2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là nhóm vi khuẩn tiền nhân được liên kết với thực vật, chúng hình thành sự liên hợp với cây chủ của chúng bằng cách hình thành tập đoàn của các mô bên trong. Đối với nông nghiệp, phần lớn vi khuẩn nội sinh không gây hại cho sinh vật chủ mà ngược lại chúng còn được xem là công cụ để cải tiến năng suất cây trồng nhờ vào các đặc tính sinh học của chúng (Muthukumarasamy et al., 2002) 2.3.1 Khả năng cố định đạm Đạm là chất căn bản của sự sống mọi tế bào. Đạm là chất dinh dưỡng có vai trò quan trọng hàng đầu đối với cây trồng. Hàm lượng của chúng trong đất rất ít, vì vậy cây trồng thường thiếu đạm. Một trong những phương pháp tăng cường lượng đạm cho đất được nhiều người quan tâm là sử dụng các loại vi sinh vật cố định nitơ từ không khí. Sự cố định đạm sinh học chỉ giới hạn ở sinh vật sơ hạch, chủ yếu là ở vi khuẩn và Archaea. Nhóm vi sinh vật này có thể sống tự dưỡng hay dị dưỡng và quá trình cố định đạm của chúng cần nguồn năng lượng, chủ yếu là nguồn carbohydrate do cây chủ cung cấp, do đó nguồn năng lượng càng dồi dào thì sản lượng đạm cố định càng cao. Trong quá trình cố đạm sinh học, khâu then chốt của toàn bộ chu trình nitơ là sự khử liên kết của N2 thành NH3 nhờ vào nguồn năng lượng ATP, sự hoạt động của phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase. Phức hợp enzyme nitrogenase và enzyme hydrogenase biến đổi N2 thành NH3 theo công thức sau: N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP + 16H2O 2NH3 + H2 + 16ADP +16Pi Ammonia (NH3) được tạo ra trong chu trình tiếp tục kết hợp với chuỗi carbon để đồng hóa thành những acid amin đầu tiên cung cấp trực tiếp cho cây trồng. Việc đánh Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 10 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT giá khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn được phân lập cũng là một khâu quan trọng để phân loại chúng. Theo Klucas (1991) để sự cố định đạm nội sinh có hiệu quả thì cần phải cung cấp đầy đủ các chất cần thiết từ cây chủ và các điều kiện môi trường thích hợp cho sự cố định đạm liên kết. Do đó, sự chứng minh phân tử về sự có mặt của hệ thống gen nif trong bộ gen của vi khuẩn điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase. Nitrogenase là hệ enzyme xúc tác cho phản ứng khử N2 thành NH3. Như vậy, hệ thống gen nif được xem là hệ thống gen điều khiển cho quá trình cố định đạm sinh học thường được xem là vật chỉ thị đáng tin cậy để phân loại vi khuẩn (Elmerich, 2007). Trong nhiều trường hợp, sự phát triển của vi khuẩn ở các môi trường nuôi cấy đặc, bán đặc hay môi trường lỏng không đạm thì không đủ bằng chứng cho hoạt tính cố định đạm của vi khuẩn. Các điều kiện sinh lý tương thích với hoạt tính nitrogenase và sự phát hiện về hoạt tính này bằng các thử nghiệm khử acetylene cũng có thể không đem lại kết quả như mong muốn hay thuyết phục (Postage, 1981). 2.3.2 Khả năng hòa tan lân khó tan Lân rất quan trọng đối với cây trồng. Tuy nhiên hiệu suất sử dụng lân bởi cây trồng không quá 25%, trong khi đó một lượng lớn bị cố định trong đất và chuyển thành dạng khó hấp thụ. Lượng dự trữ lân trong đất xấp xỉ 0,025 – 0,3% P2O5 nhưng chúng tồn tại trong đất ở dạng không tan trong nước cây khó hấp thụ. Thành phần lân dễ tan và khó tan trong đất được quyết định bởi tính chất đá mẹ , thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữu cơ quyết định.Theo Sepfe-Satsaben (1960) thì hàm lượng phosphate trung bình ở nhiều loại đất thường từ 0,02 – 0,08%. Do quá trình tích lũy sinh học, hàm lượng phosphate trong lớp đất mặt cao hơn ở lớp dưới. Trong các loại đất khoáng, tỉ lệ lân hữu cơ thường từ 25 – 65%. Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung cấp cho đất một nguồn phosphate quan trọng. Như vậy việc bổ sung chất hữu cơ vào đất giúp làm tăng cường hàm lượng lân cho đất. Vòng tuần hoàn của lân không giống như vòng tuần hoàn của nitơ. Trong khi nitơ luôn khan hiếm trong đất thì lân tồn tại nhiều trong đất ở dạng khó phân giải. Nitơ được đưa vào đất nhờ vi sinh vật cố định đạm từ không khí, còn đối với lân, chúng được các vi sinh vật phân giải từ các nguồn lân vô cơ và hữu cơ khác nhau. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 11 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Theo nghiên cứu của Đặng Thị Huỳnh Mai (2001) có nhiều vi sinh vật được phân lập từ các loại đất ở đồng bằng sông Cửu Long có khả năng hòa tan lân như là các nhóm vi khuẩn và nấm. Trong đó nhóm vi khuẩn nhiều hơn nấm nhưng nấm có độ hữu hiệu cao hơn. Các vi sinh vật hòa tan phosphate làm cho phosphate khó tan có thể thành dạng hòa tan bằng quá trình acid hóa và làm giảm pH do các acid hữu cơ do vi khuẩn tiết ra tạo ra nhiều ion H+ (Lin et al.,2006). Các acid hữu cơ được sản xuất từ vi khuẩn và nấm trong quá trình hòa tan lân khó tan chủ yếu là: citric, lactic, gluconic, oxalic, tartaric, acetic và 2-ketogluconic acid (Sperber, 1985; Duff, 1963). Theo nghiên cứu của Moghimi và Tate (1978) thì ngoài cơ chế acid hóa, các vi khuẩn còn có thể hòa tan lân khó tan bằng sự tạo phức và các phản ứng trao đổi ion. Trong đó phức cation có thể là cơ chế quan trọng trong các trường hợp hòa tan lân khó tan khi có cấu trúc acid hữu cơ thích hợp để tạo ra phức. 2.4 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh trên thế giới và ở Việt Nam Hiện nay, người ta đã tìm được nhiều giống vi khuẩn nội sinh như: Azoarcus, Enterobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Clavibacter, Brudyrhizobium, Azospirillum, Gluconacetobacter, Cellulomonas, Klebsiella, Corynebacterium, Burkholderia, Herbaspirillum...ở các cây lương thực, cây hoa màu, cây họ đậu và cây cỏ chăn nuôi... Năm 1958, các nhà khoa học đã tìm thấy Beijerinckia spp. ở vùng rễ cây mía. Sau đó Berg et al. (1980) đã nghiên cứu đặc tính sinh học của Azospirillum cộng sinh ở cây mía đã làm tăng cường hoạt tính của enzim nitrogenase từ đó làm tăng tỉ lệ tổng hợp đạm của cây. Năm 1988, Cavalcante và Döbereine đã phân lập được vi khuẩn cố đinh đạm trong rễ và thân cây mía trồng ở Brazil và đặt tên là Acetobacter diazotrophicus. Gần đây, các nhà nghiên cứu đã phát hiện loài vi khuẩn này có một số đặc tính: tổng hợp hormone tăng trưởng, tổng hợp auxin và gibberellin, làm giảm pH môi trường để hòa tan lân (Muthukumarasamy et al., 2002). Hiện nay người ta đã nghiên cứu và tìm thấy vi khuẩn này còn hiện diện ở cây cà phê, gari, khóm, lúa (Loganathan và Nair, 2003). Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 12 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Ớ Thụy Điển, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy ở vùng rễ của các loài ngũ cốc và cỏ chăn nuôi các vi khuẩn Enterobacter và Bacillus (Lindberg và Granhall, 1984). Ở Nhật, các nhà nghiên cứu đã xác định được các vi khuẩn nội sinh Herbaspirillum có khả năng cố định đạm ở các loài lúa hoang (Elbeltagy et al.,2001). Người ta cũng đã tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn Herbaspirillum seropedicae và giống Burkholderia vào cây lúa, kết quả các vi khuẩn có thể cố định đạm khoảng 19% tổng số đạm cần thiết cho cây (Verma et al.,2001). Ở Mỹ, mất hơn 6 năm nghiên cứu ở 4 loài cây nông nghiệp (bắp, lúa miến, đậu tương và lúa mì) và 27 loài cỏ tự nhiên khác nhau người ta đã xác định được 15 giống vi khuẩn nội sinh: Agrobacterium, Bacillus, Bradirhizobium, Erwinia, Cellulomonas, Clavibacter, Corynebacterium, Enterobacterium, Escherichia, Klebsiella, Microbacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Rothia và Xanthomonas (Zinniel et al.,2002), trong đó số vi khuẩn gram dương xấp xỉ bằng số vi khuẩn gram âm. Ở Ấn Độ, khi nghiên cứu ở 4 loài lúa trồng khác nhau, người ta đã xác định được vi khuẩn nội sinh Gluconacetobacter diazotrophicus cũng có khả năng cố định đạm nhờ vào gen nif (Muthukumarasamy et al., 2005). Ở Việt Nam, việc nghiên cứu các vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp kích thích tố IAA ở các cây nông nghiệp đã tiến hành khá nhiều trong những năm gần đây. Tại Viện Nghiên cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ, Cao Ngọc Điệp et al. (2007) đã phân lập và nhận diện các dòng Azospirillum bằng kỹ thuật PCR từ rễ và thân lúa trồng; Cao Ngọc Điệp (2005) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của các vi khuẩn nốt rễ (Sinorhizobium fredii) và vi khuẩn Pseudomonas sp. Trên cây đậu nành đã làm gia tăng số trái và giảm số trái lép trên cây. Gần đây, Nguyễn Hữu Hiệp et al. (2008) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus nội sinh ở rễ, thân và lá của các giống mía trồng ở huyện Cù Lao Dung và huyện Mỹ Tú, tỉnh Sóc Trăng. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 13 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Vi sinh vật môi trường thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ. 3.1.2.Thời gian thực hiện Từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013 3.2 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ, thiết bị Sử dụng những thiết bị, phương tiện có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học – Đại học Cần Thơ. a) Thiết bị, dụng cụ để phân lập và khảo sát đặc tính của vi khuẩn - Đĩa Petri, ống nghiệm, ống đong, ống Falcon - Bình Erlenmeyer 50ml,100 ml - Que cấy, đèn cồn, lame và lammen - Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật) - Cân điện tử Sartorius (Đức ) - Nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi – international (Đức) - Tủ cấy vi sinh vật ( Pháp) - Tủ ủ vi sinh vật Inccucell 111 (Đức) - Tủ sấy EHRET (Đức) - Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức), máy Vortex - pH kế Orion 420A (Hoa Kì) - Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan) - Bộ micropipette Gibson P10, P20, P50, P200, P1000 Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 14 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT b) Thiết bị và dụng cụ khác dùng để phân lập và nhận diện vi khuẩn - Tủ lạnh Electrolux Confor Plus (Thụy Điển) - Tủ lạnh Akira (Việt Nam) - Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus 7,1 megapixel - Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu 3.2.2 Vật liệu thí nghiệm Bảy mẫu thân cây bắp lai được lấy ở các địa điểm: xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh; xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh; xã Cẩm Giang-Gò Dầu-Tây Ninh; Phạm Văn Mạnh ấp 4 xã Trà Vong và xã Thạnh Đông thuộc huyện Tân Biên tỉnh Tây Ninh. Chọn các bộ phận thân không có dấu hiệu bệnh. Cắt mẫu thành từng đoạn ngắn (3 - 4 cm); rửa thật sạch dưới vòi nước mạnh để loại bỏ đất, bụi bẩn; để ráo tự nhiên. Để riêng từng loại mẫu trong bọc nylon sạch có ghi nhãn, bảo quản trong tủ lạnh (4-5oC). 3.2.3 Hóa chất và môi trường a) Hóa chất dùng để khử trùng mẫu - Nước cất vô trùng - Ethanol (cồn) 96% - Hydrogen peroxide (H2O2) 10% Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 15 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT b) Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh  Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường LGI đặc và bán đặc. Theo Cavalcante và Döbereiner (1988) thì công thức của môi trường đặc và bán đặc được trình bày ở bảng 2 Bảng 2: Công thức môi trường LGI (Cavalcante và Döbereiner, 1988) Hóa chất Nồng độ Sucrose 10 g/l KH2PO4 0,6 g/l K2HPO4 0,2 g/l MgSO4. 7H2O 0,2 g/l CaCl2 0,02 g/l FeCl3 0,01 g/l Na2MoO4. 2H2O 0,002 g/l Bromothymol blue 0.5% trong KOH 0,2N Agar 5 ml/l Môi trường đặc 20 g/l, môi trường bán đặc 2 g/l pH Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 5,5 16 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT  Hóa chất dùng để phân lập vi khuẩn nội sinh trên môi trường NFb đặc và bán đặc. Theo Krieg và Döbereiner (1984) thì công thức của môi trường đặc và bán đặc gồm các thành phần hóa chất sau : Bảng 3: Công thức môi trường NFb (Krieg và Döbereiner, 1984) Hóa chất Nồng độ Malic acid 5 g/l K2HPO4 5 g/l MgSO4. 7H2O 0,2 g/l CaCl2 0,02 g/l NaCl 0,1 g/l KOH 4,5 g/l FeEDTA (1,64%) 4 ml/l Dung dịch nguyên tố vi lượng(a) 2 ml/l Dung dịch vitamin(b) 1 ml/l Bromothymol blue 0.5% trong KOH 0,2N 2 ml/l Môi trường đặc 20 g/l, môi Agar trường bán đặc 2 g/l 6,8 pH (a) Dung dịch nguyên tố vi lượng gồm: 0,4 g/l CuSO4; 0,12 g/l ZnSO4. 7H2O; 1,4 g/l H3BO3; 1,5 g/l MnSO4. H2O và 1 g/l Na2MoO4. 2H2O (b) Dung dịch vitamin gồm: 1 mg/l biotin (vitamin H) và 2 mg/l pyridoxine-HCl. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 17 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT  Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng cố định đạm của vi khuẩn nội sinh đã phân lập Bảng 4: Công thức môi trường Burk’s không đạm (Park et al., 2005) Hóa chất Nồng độ Sucrose 10 g/l K2HPO4 0,52 g/l MgSO4. 7H2O 0,1 g/l CaCl2 0,2 g/l KH2PO4 0,41 g/l KOH 4,5 g/l FeSO4 .7H2O 0,005 g/l Na2MoO4 .2H2O 0,0025 g/l Na2SO4 0,05 g/l Môi trường đặc 20 g/l, môi trường Agar lỏng 0 g/l 7,0 pH  Hóa chất dùng để kiểm tra khả năng hòa tan lân của vi khuẩn nội sinh đã phân lập Bảng 5: Công thức môi trường NBRIP (Nautiyal., 1999) Hóa chất Nồng độ Sucrose 10 g/l (Ca3PO4 )2 5 g/l MgSO4. 7H2O 0,25 g/l KCl 0,2 g/l MgCl2.6H2O 5 g/l (NH4)2SO4 0,1 g/l pH Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 7,0 18 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh 3.3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu Thân cây bắp được thu bằng cách nhổ ngẫu nhiên ở 5 địa điểm. Mỗi địa điểm từ 2 – 3 gốc cây bắp. Thân được thu ở những cây từ 40 – 60 ngày tuổi vì ở giai đoạn này thân của cây bắp sinh trưởng và phát triển tốt đồng thời mật số của những vi khuẩn nội sinh cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al., 2003). Để loại trừ các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt thân, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, dưới vòi nước mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt thân thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm; sau đó lần lượt khử trùng mẫu thân bằng cồn 96% trong 3 phút, hydrogen peroxide 3% (H2O2) trong 3 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa. Ngoài ra để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn xót lại trên bề mặt mẫu thân sau khi khử trùng, lấy 200µl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần thứ 4 (lần cuối) chủng lên các đĩa môi trường Tryptone – Yeast extract – glucose – agar và ủ ở 300C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này không thấy xuất hiện các khuẩn lạc thì mẫu thân đã khử trùng đạt yêu cầu. 3.3.1.2 Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh từ thân cây bắp Mẫu thân sau khi khử trùng đạt yêu cầu cho vào cối và thêm 1 - 2ml nước cất vô trùng rồi nghiền nát. Lấy 100µl dịch nghiền của thân chủng vào các ống nghiệm chứa 3ml môi trường LGI và NFb bán đặc và đậy nắp các ống nghiệm rồi đem ủ trong tủ ủ ở 300C trong 2 – 3 ngày. Sau 2 – 3 ngày nuôi, quan sát thấy các ống nghiệm chứa các môi trường bán đặc LGI và NFb đã chủng dịch trích của mẫu xuất hiện một lớp màng mỏng (pellicle) cách bề mặt môi trường nuôi khoảng 0,5 cm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh. Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ các vòng pellicle của các môi trường bán đặc LGI và NFb lần lượt cấy chuyển sang các đĩa môi trường LGI và NFb đặc để tách ròng các khuẩn lạc. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 19 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Sau vài lần cấy chuyển trên các môi trường LGI và NFb đặc, chọn các khuẩn lạc rời và đều nằm trên đường cấy quan sát dưới kính hiển vi. Khi thấy vi khuẩn đã ròng thì cấy vào ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng trữ ở 4 0C và được xem như một dòng (isolate). 3.3.2 Quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc, đồng thời tiến hành đo kích thước và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thường. Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì có thể quan sát bằng kính lúp. Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng milimet (mm). 3.3.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn Sau khi tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần.  Chuẩn bị mẫu vi khuẩn Nhỏ 15µl nước cất vô trùng lên lame Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lame Đậy lame lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lame tiếp xúc với lame một góc 450 rồi hạ lame xuống từ từ nhẹ nhàng sao cho mẫu vật không có bọt khí.  Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn Tiến hành quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn. 3.3.4 Xác định đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh Cấy kiểm tra tất cả những dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được trên 3 môi trường đặc (Burk’s không N, NBRIP và môi trường phân lập vi khuẩn không bổ sung Tryptophan) để ghi nhận mức độ sinh trưởng của những dòng vi khuẩn này. Mỗi môi Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 20 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT trường lựa chọn các dòng vi khuẩn biểu hiện dương tính mạnh nhất để tiến hành đo khả năng cố định đạm sinh học và hòa tan lân khó tan. Khả năng cố định đạm - Vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường không có đạm là vi khuẩn có khả năng cố định đạm vì vi khuẩn này có khả năng tổng hợp đạm từ không khí. Chọn những dòng vi khuẩn nội sinh cấy trên môi trường Burk’s không đạm đặc và ủ ở 300C, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1 – 2 ngày. Dòng vi khuẩn nào phát triển được trong môi trường thì chúng có khả năng cố định đạm. - Định lượng ammonium do vi khuẩn tạo ra  Nguyên tắc: xác định nồng độ NH4+, nhờ phản ứng giữa phenol và NH3 dưới sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochloride trong môi trường kiềm tạo thành Indophenol có màu xanh. Sodium nitroprusside sẽ làm tăng hiệu quả phản ứng giữa NH3 và phenol (Page et al., 1982). Hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo cường độ màu trên máy quang phổ tại bước sóng 636nm.  Hóa chất: (1) Dung dịch KCl 2M: Hòa tan 15g KCl trong 100ml nước cất. (2) Stock (NH4+): hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước, trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40ml stock (NH4+) để được 200ml, cuối cùng được dung dịch chứa 2µg/ml. (3) Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong 0,5 lít nước. (4) Hypocloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl với 5g NaOH trong 0,5 lít nước. (5) Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường lỏng LGI hoặc NFb với 15ml môi trường trong ống nghiệm. Chủng vi khuẩn vào trong ống nghiệm chứa môi trường LGI hoặc NFb lỏng lắc trên máy lắc xoay vòng với tốc độ 120 vòng/phút.  Phương pháp định lượng Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 0ml NH4+ Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 1ml NH4+ Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 2ml NH4+ Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 3ml NH4+ Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 4ml NH4+ Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 21 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 5ml NH4+ Hút 2ml dịch vi khuẩn trong các ống facol cho vào các eppendorf Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút Hút 2ml dịch vi khuẩn ở các thời điểm 2, 4, 6, 8, đem ly tâm và 4ml H2O; 5ml buffer; 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+ , đo phổ OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ đồ thị bằng chương trình Excel có thể tính ra được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.  Khả năng hòa tan lân khó tan Dùng - thuốc thử acid ascorbic–amoniummolybdate–potassium antinomonyltartrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩn hòa tan trong dung dịch theo nguyên lý:  Chất lân sau khi được hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với amoniummolybdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolybdate màu vàng. H2PO4 - + NH4 + MoO42+ + 2H+ (NH4 )3 [P(MoO10 )4]  Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+ bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm dung dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch huyền phù của vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880nm.  Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molybdate dư thừa, lượng chất khử cố định, nồng độ lân nhỏ ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ thuận với làm lượng lân theo đúng định luật Bir Lambeg. - Để đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan của những dòng vi khuẩn nội sinh, thực hiện các thí nghiệm sau:  Chủng 500µl dịch huyền phù vi khuẩn đã nuôi vào các ống facol có chứa 50ml môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal., 1999), lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.  Lấy mẫu ở ngày thứ 5, 10, 15, 20 ngày nuôi để xác định hàm lượng lân hòa tan bằng máy so màu theo phương pháp Oniani. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 22 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT  Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) + Chuẩn bị mẫu Lấy dịch vi khuẩn gốc lần lượt chủng vào tuýp eppendorf 2 ml có chứa môi trường LGI và NFb lỏng không có bổ sung tryptophan, ủ trong tối. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần. Lấy tuýp eppendorf chứa mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng IAA tổng hợp. + Phương pháp đo IAA Xây dựng đường chuẩn IAA: Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 0µl IAA Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 2µl IAA Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 4µl IAA Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 6µl IAA Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 8µl IAA Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 10µl IAA Trộn đều dung dịch trong các ống nghiệm bằng máy vortex và để ổn định ở nhiệt độ phòng, trong tối khoảng 15-20 phút. Mẫu: các tuýp eppendorf được lấy ra, sau đó đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau: 0,5 ml dịch mẫu 1 ml dung dịch thuốc thử Salkowsky. Trộn đều dung dịch trong các ống nghiệm bằng máy vortex và để ở ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, trong tối (Cao Ngọc Điệp, 2011). Tiến hành đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm (OD530 nm). Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 23 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập 4.1.1 Phân lập vi khuẩn Từ bảy mẫu thân cây bắp được lấy ở các địa điểm: xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh; xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh; xã Cẩm Giang-Gò Dầu-Tây Ninh; Phạm Văn Mạnh ấp 4 xã Trà Vong và xã Thạnh Đông thuộc huyện Tân Biên tỉnh Tây Ninh đã phân lập được 51 dòng vi khuẩn. Trong số 51 dòng vi khuẩn đã phân lập có 36 dòng trên môi trường NFb và 15 dòng trên môi trường LGI. Bảng 6: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập STT Vi khuẩn Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Môi trường 1 TTN1a Xã Trà Vong-Tân Biên- Tây Ninh NFb 2 TTN1b Xã Trà Vong-Tân Biên- Tây Ninh NFb 3 TTN2 Xã Trà Vong-Tân Biên- Tây Ninh NFb 4 TTN3a Xã Trà Vong-Tân Biên- Tây Ninh NFb 5 TTN3b Xã Trà Vong-Tân Biên- Tây Ninh NFb 6 TTN3c Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 7 TTN4a Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 8 TTN4b Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 9 TTN4c Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 10 TTN5a Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 11 TTN5b Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 12 TTN6a Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 13 TTN6b Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 14 TTN7a Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 15 TTN7b Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 16 TTN7c Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 17 TTN8a Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh NFb 18 TTL7 Xã Trà Vong-Tân Biên- Tây Ninh LGI 19 TTL8a Xã Trà Vong-Tân Biên- Tây Ninh LGI 20 TTL8b Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh LGI 21 TTL9 Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh LGI 22 TTL10 Xã Thạnh Đông -Tân Biên- Tây Ninh LGI 23 TTN8b Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 24 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 24 TTN9 Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 25 TTN10a Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 26 TTN10b Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 27 TTN10c Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 28 TTN11a Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 29 TTN11b Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 30 TTN11c Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 31 TTN11d Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 32 TTN12a Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh NFb 33 TTL3a Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh LGI 34 TTL3b Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh LGI 35 TTL5a Xã Gia Bình-Trảng Bàng-Tây Ninh LGI 36 TTL1a Xã Cẩm Giang-Gò Dầu-Tây Ninh LGI 37 TTL1b Xã Cẩm Giang-Gò Dầu-Tây Ninh LGI 38 TTL2a Xã Cẩm Giang-Gò Dầu-Tây Ninh LGI 39 TTL2b Xã Cẩm Giang-Gò Dầu-Tây Ninh LGI 40 TTN12b Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 41 TTN12c Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 42 TTN13a Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 43 TTN13b Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 44 TTN14 Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 45 TTN15 Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 46 TTN16a Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 47 TTN16b Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 48 TTN17 Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh NFb 49 TTL5b Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh LGI 50 TTL6a Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh LGI 51 TTL6b Xã Đồng Khởi-Châu Thành-Tây Ninh LGI 25 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên nghành Vi Sinh Vật học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Hình thái, màu sắc và hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn nội sinh ở thân cây bắp rất đa dạng và phong phú. Các dòng vi khuẩn đều có đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí trong các môi trường bán đặc, chúng phát triển thành màng mỏng (pellicle) cách mặt môi trường khoảng 0,5 cm như mô tả. Màng mỏng pellicle (NFb) (LGI) Hình 1. Vi khuẩn sau 24 giờ nuôi trên môi trường bán đặc (ngày 22/6/2013) Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 26 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.1.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn đã phân lập Bảng 7: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập Đặc điểm vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc Số TT Dòng vi khuẩn Hình dạng Chuyển động Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Độ nổi ĐK (mm) 1 TTN1a Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 1,5 2 TTN1b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Lài 1 3 TTN2 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 2 4 TTN3a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Răng cưa Mô 1 5 TTN3b Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 1,5 6 TTN3c Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Răng cưa Lài 0,5 7 TTN4a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 0,5 8 TTN4b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1 9 TTN4c Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 1,5 10 TTN5a Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 2 11 TTN5b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Răng cưa Lài 1 12 TTN6a Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 2 13 TTN6b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 2 14 TTN7a Que ngắn + Trắng trong Không đều Nguyên Lài 1 15 TTN7b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Răng cưa Mô 1 16 TTN7c Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1 17 TTN8a Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 2 18 TTN8b Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 19 TTN9 Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 20 TTN10a Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 21 TTN10b Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 22 TTN10c Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 2 23 TTN11a Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 24 TTN11b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 2 25 TTN11c Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 2 26 TTN11d Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 27 TTN12a Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 1 Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 27 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 28 TTN12b Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Lài 1 29 TTN12c Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Lài 0.5 30 TTN13a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Lài 0.5 31 TTN13b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Lài 1 32 TTN14 Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 33 TTN15 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1 34 TTN16a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1 35 TTN16b Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 1 36 TTN17 Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 37 TTL1a Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 38 TTL1b Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 2 39 TTL2a Que ngắn + Trắng trong Tròn đều Nguyên Mô 2 40 TTL2b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1 41 TTL3a Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 42 TTL3b Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 43 TTL5a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 2 44 TTL5b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Răng cưa Mô 1 45 TTL6a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Răng cưa Mô 1 46 TTL6b Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1 47 TTL7 Que ngắn + Trắng đục Không đều Răng cưa Mô 1 48 TTL8a Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1 49 TTL8b Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Nguyên Mô 1 50 TTL9 Que ngắn + Trắng đục Tròn đều Răng cưa Mô 1 51 TTL10 Que ngắn + Trắng đục Không đều Nguyên Mô 1 (+) có khả năng chuyển động ĐK: Đường kính khuẩn lạc của vi khuẩn sau 24 giờ cấy trên môi trường phân lập Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 28 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.1.2.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập Bảng 8: Tỷ lệ (%) về các đặc điểm khuẩn lạc của dòng vi khuẩn đã phân lập Đặc điểm khuẩn lạc Hình dạng Màu sắc Dạng bìa Độ nổi Số lượng Tỷ lệ % Tròn đều 27 52,9 Không đều 24 47,1 Trắng đục 46 90,2 Trắng trong 5 9,8 Răng cưa 15 29,4 Nguyên 36 70,6 Mô 38 74,5 Lài 13 25,5 Hình dạng khuẩn lạc: Khuẩn lạc của vi khuẩn phần lớn có dạng hình tròn và không đều. Trong số 51 dòng vi khuẩn đã phân lập dòng vi khuẩn có khuẩn lạc hình tròn đều chiếm cao nhất 27/51 dòng vi khuẩn (chiếm tỷ lệ 52,9%) và khuẩn lạc có dạng không đều chiếm 24/51 (chiếm tỷ lệ 47,1%). Màu sắc khuẩn lạc: Đa số các dòng vi khuẩn đã phân lập có màu trắng đục 45/51 (chiếm tỷ lệ 90,2%) và một số khuẩn lạc có màu trắng trong 6/51 (chiếm tỷ lệ 9,8%). Dạng bìa khuẩn lạc: Phần lớn các dòng vi khuẩn phân lập được đều có khuẩn lạc dạng bìa nguyên còn lại là khuẩn lạc có dạng bìa răng cưa. Trong số 51 dòng vi khuẩn phân lập được thì 36/51 dòng vi khuẩn có dạng bìa nguyên chiếm tỷ lệ 70,6%; và 15/51 dòng vi khuẩn có dạng bìa răng cưa chiếm tỷ lệ 29,4%. Độ nổi khuẩn lạc: Trong tổng số 51 dòng vi khuẩn phân lập được thì dòng vi khuẩn với độ nổi mô chiếm đa số với 38 dòng vi khuẩn chiếm tỷ lệ 74,5%; còn lại 13 dòng với độ nổi lài chiếm tỷ lệ 25,5%. Đường kính khuẩn lạc: Đường kính khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được dao động từ 0,5-2 mm sau khi cấy trên môi trường đặc và ủ ở 300C trong 24 giờ. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 29 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Khuẩn lạc (A) (C) (C) Hình 2. Đặc điểm một số dạng khuẩn lạc, (ngày 21/7/2013) (A) Khuẩn lạc có màu trắng trong, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (B) Khuẩn lạc có màu trắng đục, dạng tròn, bìa nguyên, độ nổi mô (C) Khuẩn lạc có màu trắng đục, không đều, bìa răng cưa, độ nổi lài 4.1.2.2 Đặc điểm của tế bào vi khuẩn Tất cả các dòng vi khuẩn đều có dạng que ngắn (chiếm 100%) và có khả năng chuyển động. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập Để đánh giá chính xác khả năng cố định đạm của từng dòng vi khuẩn cần tiến hành định lượng lượng NH4+ do những dòng vi khuẩn này tạo ra bằng phương pháp phenol-nitropruside. Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua mức hấp thụ quang phổ của các mẫu đo. Những mẫu có màu xanh càng đậm thì mức hấp thụ quang phổ càng lớn và khả năng tổng hợp đạm càng cao. Hình 3 . Đường chuẩn đo đạm ( ngày 22/10/2013) Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Bảng 9: Khả năng tổng hợp NH4+ (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường Burk’s không đạm Nghiệm thức Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 DC 0,21g’ 0,52e’ 0,69h’ 0,79u TTN1a 0,58x 1,20u 1,43qrs 1,84i TTN1b 0,42k 1,15w’ 1,21xyza’ 2,67c TTN2 0,36 c 4,32e 1,63mn 2,53d TTN3a 0,43r 1,09xy 1,36stuv 2,03gh TTN3b 0,38e’ 1,26s’ 1,93h 1,63lm TTN3c 0,42t 1,01a’ 0,83g' 2,00h TTN4a 0,35i 1,05yza’ 1,33stuvw 4,09a TTN4b 0,47b 1,88m 1,53nopq 2,01h TTN4c 1,22h 3,60g 3,14f 2,78b TTN5a 1,02 s 4,56c 1,38stuv 2,12g TTN5b 0,44c’ 1,41r 0,95e’f’ 2,02h TTN6a 0,31b 3,38i 3,75c 2,34e TTN6b 0,34c 1,01a’ 0,92f’g’ 0,87t TTN7a 1,02 n 3,97f 0,91afag 2,23f TTN7b 0,35f 0,85ac 0,99adaeaf 0,50w TTN7c 0,30op 0,94ab 0,90f’g’ 0,79u TTN8a 0,27d 1,41r 0,93f’g’ 0,43x TTL7 1,08q 3,42hi 1,20xyza’ 2,68c TTL8a 0,58w 1,20u 1,63mno 1,73jk TTL8b 0,61b’ 0,92b’ 1,39rstu 1,21r TTL9 0,5a’ 1,11wx 1,88hij 1,33pq TTL10 TTN8b 0,63y 0,40r 1,02a’ 1,66o 1,50pqr 1,28uvwxy 1,5no 0,51w TTN9 1,14n 4,80b 4,95a 2,12g TTN10a 0,42e 1,22tu 1,13za’b’ 0,66v TTN10b 0,41m 1,09xy 0,93afag 0,52w TTN10c 0,41e 1,07xyz 1,16yza’b’ 0,74uv TTN11a 0,33f 1,03z’a’ 1,10a’b’c’d’ 0,98s TTN11b 0,41h 2,74j 3,29e 1,54mn TTN11c 0,28z 1,00a’ 1,12za’b’c’ 0,69v TTN11d 0,24a 1,18u 1,23wxyz 0,74uv Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TTN12a 0,46 kl 1,68o 1,30tuvwx 1,32q TTL3a 0,25x 0,74d’ 1,57nop 1,48no TTL3b 0,32o 1,87m 1,77jkl 1,69kl TTL5a 0,43q 1,65op 1,86hijk 1,72jkl TTL1a 0,42f’ 1,40r 1,50opqr 0,52w TTL1b 0,32i 1,75n 1,74klm 1,20r TTL2a 0,26t 2,26k 2,39g 1,03s TTL2b 0,36s 1,50q 1,4qrst 1,43o TTN12b 0,45s 1,31s 0,89f’g’ 1,00s TTN12c 0,41v 0,94b’ 1,72lm 1,68kl TTN13a 0,25p 1,43r 1,95h 1,81ij TTN13b 0,79j 4,44d 1,78Ijkl 2,08gh TTN14 0,57u 1,39r 1,89hi 1,67kl TTN15 0,42g 1,52q 1,13za’b’c’ 1,69kl TTN16a 1,19j 2,00l 1,26vwxy 1,83i TTN16b 0,98z 3,45h 1,07b’c’d’e’ 1,42op TTN17 1,16qr 4,59c 3,44d 1,83i TTL5b 0,87d’ 5,83a 1,01c’d’e’f’ 0,86s TTL6a 0,76i 1,60p 1,30tuvwx 1,83i TTL6b 1,11n 4,31e 4,23b 1,72jkl CV(%) 7,24 0.75 2,16 1,79 LSD 0,08 0,03 0,07 0,06  DC : đối chứng Chú thích: Những số theo sau cùng một chữ không có khác biệt về thống kê ở mức ý nghĩa 1% tính theo cùng 1 ngày. Sau hai ngày chủng vi khuẩn, 51 dòng vi khuẩn được khảo sát đều có khả năng tổng hợp lượng NH4+ nhưng nồng độ còn thấp. Sau đó, các dòng vi khuẩn bắt đầu tăng hoạt động cố định đạm, lượng NH4+ được tổng hợp tiếp tục tăng dần và đạt nồng độ cao nhất vào ngày thứ 4 và giảm dần ở những ngày nuôi tiếp theo. Vì khi vi khuẩn tổng hợp đạm nếu lượng đạm mà vi khuẩn tổng hợp được trong môi trường quá nhiều thì lượng đạm đó sẽ ức chế lại vi khuẩn phát triển trong thời gian ngưng tổng hợp đạm vi khuẩn sẽ sử dụng lượng đạm tổng hợp được và đến khi lượng đạm trong môi trường không còn ức chế lại vi khuẩn thì vi khuẩn sẽ tiếp tục tổng hợp đạm. Đối với vi khuẩn Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT nội sinh thực vật có khả năng cố định đạm khi ở trong cây vi khuẩn sẽ sử dụng một lượng nhỏ phần đạm tổng hợp được phần còn lại được thực vật sử dụng. Trong 51 dòng vi khuẩn phân lập được khảo sát, có dòng TTL5b (5,83 mg/l) được phân lập ở huyện Châu Thành tỉnh Tây Ninh tổng hợp NH4+ cao nhất ở ngày thứ 4; dòng TTN9 (4,95 mg/l) được phân lập ở huyện Trảng Bàng tỉnh Tây Ninh và dòng TTL2a (2,39 mg/l) được phân lập ở huyện Gò Dầu tỉnh Tây Ninh tổng hợp NH4+ tăng ổn định và đạt lượng cao ở ngày 6; dòng TTN4a được phân lập ở huyện Tân Biên tỉnh Tây Ninh tổng hợp NH4+ tăng dần theo thời gian và đạt lượng cao ở ngày 8 (4,09 mg/l); khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% qua kiểm định (Bảng 9) so với các dòng còn lại. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.3 Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập Cấy những dòng vi khuẩn phân lập được vào môi trường NBRIP lỏng để định lượng lượng P2O5 do những dòng vi khuẩn này hòa tan được bằng phương pháp Oniani. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua mức hấp thụ quang phổ của các mẫu đo. Những mẫu có màu càng xanh mức hấp thụ quang phổ càng lớn và khả năng hòa tan lân càng cao. Sau 3 lần lặp tính giá trị trung bình của mỗi mẫu đo sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày nuôi vi khuẩn trong môi trường NBRIP lỏng kết quả thu được như sau: Bảng 10: Khả năng hòa tan P2O5 (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày và 20 ngày nuôi trong môi trường NBRIP lỏng Nghiệm thức Ngày 5 Ngày 10 Ngày 15 Ngày 20 DC 0,84k’ 0,87p’ 2,01v 3,69g’ TTN1a 54,72p 58,12w 52,52ghij 34,34x TTN1b 43,17t 42,49b’ 41,75klmno 45,24k TTN2 59,14l 90,56e 81,82a 58,69c TTN3a 43,83s 58,90uv 52,95ghij 39,40r TTN3b 55,27o 57,19x 48,41hijkl 20,81e’ TTN3c 58,21m 64,77r 56,51efgh 37,91t TTN4a 49,55r 51,36z 46,36jklmn 48,78i TTN4b 59,74k 86,31g 66,57cd 60,25b TTN4c 63,65fg 71,14m 53,82fghij 50,82h TTN5a 42,20u 44,39a’ 46,16jklmn 38,59s TTN5b 60,48j 64,67r 62,13de 28,37c’ TTN6a 63,76f 136,44a 71,82bc 60,00b TTN6b 55,70o 60,02t 61,29def 58,51c TTN7a 36,21w 61,04s 46,56jklmn 42,80n TTN7b 52,91q 69,92o 49,74hijk 53,53f TTN7c 62,68hi 64,66r 59,08defg 41,72op TTN8a 59,05l 93,59d 51,92ghij 57,40d TTL7 34,06 x 64,59r 45,85jklmn 40,22q TTL8a 41,29v 56,25y 32,65pqrst 35,19w TTL8b 17,30g’h’ 37,61f’ 31,55qrst 29,69b’ TTL9 9,48j’ 30,89i’ 36,47opqr 30,21a’ Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 35 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TTL10 17,10h’ 29,69k’ 32,53pqrst 33,02y TTL3a 26,42e’ 28,38l’ 29,31rst 34,56x TTL3b 32,94y 39,29d’ 40,11mnop 42,07o TTL5a 28,72c’ 38,10e’ 39,29nopq 40,11q TTN8b 59,04l 87,51f 61,38def 39,59r TTN9 63,11gh 117,64b 75,56ab 42,67n TTN10a 63,24fg 70,59n 55,36efghi 54,76e TTN10b 72,95a 58,74v 39,60nopq 43,54m TTN10c 66,31d 69,43 p 62,78de 55,06e TTN11a 42,98t 71,39 m 40,55lmnop 53,93f TTN11b 68,62c 96,77 c 62,25de 50,62h TTN11c 62,57hi 64,66 r 45,72jklmn 30,71z TTN11d 56,29n 59,11 u 53,03ghij 65,29a TTN12a 65,66e 77,15 k 70,94bc 44,80kl TTL1a 14,44i’ 27,52m’ 15,94u 14,56f’ TTL1b 27,86d’ 29,97k’ 46,14jklmn 48,34i TTL2a 23,11f’ 30,36j’ 32,40pqrst 38,06t TTL2b 17,67g’ 22,79o’ 25,69t 38,69s TTN12b 54,47p 59,98 t 51,23ghij 38,58s TTN12c 23,52f’ 26,22n’ 27,95st 35,81v TTN13a 28,81c’ 36,08g’ 37,36opqr 41,35p TTN13b 23,09f’ 82,48h 46,52jklmn 46,37j TTN14 30,84a’ 33,65h’ 34,43opqrs 36,51u TTN15 49,24r 79,25j 39,08nopq 52,86g TTN16a 30,00b’ 40,75c’ 33,63opqrst 46,72j TTN16b 32,37z 80,26i 34,37opqrs 31,13z TTN17 62,15i 65,30q 52,41ghij 39,80qr TTL5b 27,55d’ 74,28l 35,07opqrs 25,37d’ TTL6a 27,54d’ 65,22q 48,25ijklm 44,74l TTL6b 72,04b 70,64n 53,68fghij 42,93n CV% 0,37 0,18 5,18 0,50 LSD 0,34 0,23 5,07 0,44  DC : đối chứng Chú thích: những số theo sau cùng một chữ không có khác biệt về thống kê ở mức ý nghĩa 1% tính theo cùng 1 ngày. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 36 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Kết quả cho thấy tất cả 51 dòng vi khuẩn đều có khả năng hòa tan P2O5. Khả năng hòa tan P2O5 của các dòng vi khuẩn nhìn chung hòa tan đạt lượng cao vào ngày thứ 5, 10 và sau đó giảm dần vào ngày thứ 15, 20 do môi trường nuôi không còn nhiều dinh dưỡng. Các dòng vi khuẩn hòa tan P2O5 còn thấp ở ngày 5. Khả năng hòa tan P2O5 của các dòng vi khuẩn tăng mạnh rõ rệt vào ngày thứ 10. Trong đó 3 dòng TTN6a (136,44 mg/l ) được phân lập ở huyện Tân Biên; dòng TTN9 (117,64 mg/l) được phân lập ở huyện Trảng Bảng và dòng TTN13b (82,48 mg/l) được phân lập ở huyện Châu Thành tỉnh Tây Ninh hòa tan P2O5 cao (trên 60 mg/l ở ngày 10) khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% qua kiểm định, so với các dòng vi khuẩn còn lại. Tuy nhiên, dòng TTL1b được phân lập ở huyện Gò Dầu tỉnh Tây Ninh có khả năng hòa tan P2O5 tăng đều qua các ngày với lượng P2O5 hòa tan là 48,34 mg/l ở ngày thứ 20 sau chủng. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 37 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT 4.4 Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn đã phân lập Cấy những dòng vi khuẩn phân lập được vào môi trường phân lập lỏng để định lượng lượng IAA do những dòng vi khuẩn này tổng hợp được bằng phương pháp Salkowsky. Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được thể hiện qua mức hấp thụ quang phổ của các mẫu đo Bảng 11: Khả năng tổng hợp IAA (mg/l) của các dòng vi khuẩn sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày và 8 ngày nuôi trong môi trường LGI và NFb lỏng (không tryptophan) Nghiệm thức Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Ngày 8 DC TTN1a TTN1b TTN2 TTN3a TTN3b TTN3c TTN4a TTN4b TTN4c TTN5a TTN5b TTN6a TTN6b TTN7a TTN7b TTN7c TTN8a TTL7 TTL8a TTL8b TTL9 TTL10 TTL3a TTL3b TTL5a TTN8b TTN9 TTN10a TTN10b TTN10c 1,92v 2,13rstuv 2,17qrstuv 2,42lmnopq 2,46klmnop 2,83defgh 2,88cdefg 2,50jklmnop 2,17qrstuv 2,63ghijklm 2,88cdefg 3,04abcde 3,13abc 2,50jklmnop 2,25pqrstu 2,08stuv 2,00uv 2,71fghijk 2,25pqrstu 2,46klmnop 2,75fghij 3,20ab 3,13abc 2,29opqrst 2,04tuv 2,33nopqrs 2,42lmnopq 1,96 v 2,17qrstuv 2,96bcdef 2,88cdefg 2,95e’ 4,86yza’ 7,33o 5,24w 5,71stu 4,90xyz 4,95xyz 5,10wxy 6,14r 6,14r 5,76stu 5,14wx 5,90rst 5,7stu 4,62a’b’ 4,90xyz 7,00 p 5,90rst 9,81i 11,38f 14,67a 13,14c 9,52j 11,33f 9,14k 13,43b 4,05c’d’ 12,71d 6,48 q 5,90 rst 5,24w 3,13 m 4,67hijkl 4,38hijklm 4,83ghijkl 3,71klm 4,38hijklm 3,83jklm 4,13ijklm 5,00ghijk 4,00ijklm 4,58hijkl 4,83ghijkl 4,13ijklm 4,88ghijkl 4,17ijklm 3,54lm 4,92ghijk 5,08ghij 8,71ab 6,88cd 8,13bc 6,63de 4,38hijklm 8,79ab 8,13bc 8,13bc 4,92ghijk 8,79ab 4,13ijklm 3,79jklm 4,00ijklm 3,38a 2,08de 0,14r 0,42opqr 0,88klmno 1,62efgh 1,06ijklmn 0,79lmnop 0,14r 1,16hijklm 1,34fghijk 1,81ef 0,23qr 1,16hijklm 0,69mnopq 1,34fghijk 0,60nopqr 0,32pqr 3,10ab 0,14r 1,62efgh 0,88klmno 2,36cd 0,42opqr 1,34fghijk 2,73bc 1,06ijklmn 0,97jklmn 0,97jklmn 3,29a 1,53fghi Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 38 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TTN11a TTN11b 2,79efghi 2,00uv 4,81za’b’ 5,57uv 3,83jklm 4,88ghijkl 0,60nopqr 0,42opqr TTN11c 2,83defgh 6,67q 4,58hijkl 1,81ef TTN11d TTN12a TTL1a TTL1b TTL2a TTL2b TTN12b TTN12c TTN13a TTN13b TTN14 TTN15 TTN16a TTN16b TTN17 TTL5b TTL6a TTL6b CV(%) LSD 2,79efghi 3,04abcde 2,38mnopqr 2,29opqrst 3,17ab 3,08abcd 2,13rstuv 3,17ab 3,25a 3,21ab 2,67ghijkl 3,29a 3,17ab 2,04tuv 2,54ijklmno 2,58hijklmn 2,46klmnop 2,67ghijkl 2,96 0,16 5,67tu 4,19c’ 7,71n 8,71l 8,10 m 9,62Ij 8,00 m 5,10wxy 5,33vw 6,10r 5,10wxy 4,71hijkl 5,04ghijk 5,63defgh 6,46def 5,25fghi 9,88a 4,79hijkl 4,83ghijkl 4,50hijkl 4,08ijklm 4,96ghijk 4,54hijkl 4,46hijklm 6,17defg 5,29efghi 3,88jklm 9,79a 6,63de 7,61 0,85 1,44fghij 1,62efgh 1,44fghij 0,42opqr 1,71efg 0,42opqr 1,06ijklmn 2,92ab 1,06ijklmn 1,16hijklm 1,62efgh 1,53fghi 0,14r 1,25ghijkl 2,36cd 1,34fghijk 0,60nopqr 0,14r 11,60 0,3 4,57b’ 5,95rs 4,29c’ 3,81d’ 10,14h 11,05g 11,71e 1,05 0,16  DC : đối chứng Chú thích: những số theo sau cùng một chữ không có khác biệt về thống kê ở mức ý nghĩa 1% tính theo cùng 1 ngày. Sau khi chủng 2 ngày thì tất cả các dòng vi khuẩn đã phân lập đều tổng hợp IAA nhưng lượng IAA không cao. Nhưng đến ngày 4 thì khả năng tổng hợp IAA tăng cao và có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% qua kiểm định (Bảng 11). Dòng vi khuẩn TTN9, TTL5a, TTL8b, TTL9 có khả năng tổng hợp IAA cao nhất vào ngày thứ 4 với lượng IAA lần lượt là 12,71 mg/l; 13,43 mg/l; 14,67 mg/l; 13,14 mg/l. Vào ngày thứ 6 và ngày thứ 8 do môi trường nuôi không còn nhiều chất dinh dưỡng nên khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn này bị giảm.. Như vậy, 4 dòng vi khuẩn TTN9 và TTL5a được phân lập ở huyện Trảng Bàng; TTL8 và TTL9 được phân lập ở huyện Tân Biên tỉnh Tây Ninh; có khả năng tổng hợp IAA mạnh nhất trong các dòng vi khuẩn được khảo sát vào ngày thứ 4. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 39 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ 7 mẫu thân của cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh Tây Ninh đã phân lập được 51 dòng vi khuẩn. Trong đó 36 dòng vi khuẩn trên môi trường NFb, 15 dòng vi khuẩn trên môi trường LGI. Tất cả các dòng vi khuẩn phân lập được khảo sát đều có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA. Trong 51 dòng vi khuẩn phân lập đã khảo sát thì dòng vi khuẩn tổng hợp NH4+ đạt lượng cao là: TTL5b (5,83 mg/l); TTN9 (4,95 mg/l); TTN4a (4,09 mg/l); TTL2a (2,39 mg/l). Các dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan lân tốt là: TTL1b (48,34 mg/l); TTN13b (82,48 mg/l); TTN9 (117,64 mg/l) và TTN6a (136,44 mg/l). Và các dòng vi khuẩn tổng hợp được IAA đạt lượng cao là: TTN9 (12,71 mg/l), TTL5a (13,43 mg/l), TTL8b (14,67 mg/l) và TTL9 (13,14 mg/l). Như vậy, dòng TTN9 là dòng vi khuẩn vừa có khả năng cố định đạm và hòa tan lân, vừa có khả năng tổng hợp IAA đạt hàm lượng cao có triển vọng hướng tới sản xuất phân sinh học cho cây bắp (ngô). 5.2 Đề nghị Giải trình tự gen 16S rRNA để định danh dòng vi khuẩn TTN9. Tiến hành đánh giá dòng vi khuẩn trên bằng thí nghiệm ngoài đồng. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 40 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Được. 2004. Hiệu quả phân lân sinh học trên đậu nành và bắp lai trồng trên đất phù sa huyện Tân Hiệp, tỉnh Kiên Giang. Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ 1, 98-104. Cao Ngọc Điệp. 2005. Hiệu quả của chủng vi khuẩn nốt thân (Sinorhizobium fredii) và vi khuẩn Pseudomomnas spp. trên đậu nành. Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ, Trường Đại học Cần Thơ 3, tr.40-48. Cao Ngọc Điệp và Bùi Thị Kiều Oanh. 2006. Hiệu quả của vi khuẩn Pseudomonas ssp trên năng suất và tổng trữ đường trong mía đường (Saccharum officinarum. L) trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An. Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ 6, 69-76, NXB Đại học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp, Phạm Khánh Vân và Lăng Ngọc Dậu. 2007. Phát hiện vi khuẩn Azospirillum lipoferum nội sinh trong cây lúa mùa đặc sản (Oryza sativa L.) trồng ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Những vấn đề cơ bản trong khoa học sự sống, tr.456-459. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thanh Tùng, Võ Văn Phước Quệ và Nguyễn Văn Anh. 2011. Hiệu quả của vi khuẩn cố định đạm Gluconacetobacter diazotrophicus và vi khuẩn hòa tan lân Pseudomonas stutzeri trên cây mía đường(Saccharum officinalis L. ) trồng trên đất phèn tỉnh Long An. Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ 18, 29-30, NXB Đại học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp. 2008. Giáo trình vi sinh chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp. 2010. Sách chuyên khảo vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria), Trường Đại học Cần Thơ. Đặng Thị Huỳnh Mai. 2001. Phân lập vi sinh vật hòa tan lân khó tan. Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ 4, tr.353-357. Nguyễn Hữu Hiệp. 2008. Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất phân vi sinh ở qui mô thí nghiệm cho cây mía trồng tại Tỉnh Sóc Trăng. Tạp chí ngiên cứu khoa học Cần Thơ 8, tr.149-157. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 41 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp. 2009. Phân lập và khảo sát đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi. Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2), tr.241-250. Tiếng anh Bremner J. M. 1996. Chemical methods (Part 3). Methods of soil Analysis, Published by Soil Science Society of Agronomy, Inc. Madison, Wisconsin, USA, pp. 85128. Barbieri, Zanelli, Enrica Galli and Giuliana Zanetti. 1986. Wheat inoculation with Azospirillum brasilense sp. And some mutants altered in nitrogen fixation and indole-3-acetic acid production. FEMS Microbiology Letters 36, pp. 87-90. Bandara, W. M. M. S., Gamini Seneviratne and S A Kulasooriya. 2006. Interactions among endophytic bacteria and fungi: effects and potentials. J. Biosci 31, pp. 645-650 Carreño-López, R., N. Campos-Reales, C. Elmerich and B. E. Baca. 2000. Physiological evidence for differently regulated tryptophan-dependent pathways for indole-3-acetic acid synthesis in Azospirillum brasilense. Mol. Gen. Genet 264, pp. 521-530. Cavalcante, Vladimir A. and J. Döbereiner. 1988. A new acid-tolerant nitrogen-fixing bacterium associated with sugarcane. Plant and Soil 108, pp.23-31. Döbereiner, J. 1974. Nitrogen-fixing bacteria in the rhizosphere. In The biology of nitrogen fixation, ed. A. Quispel, Amsterdam, The Netherlands: North Holland Publishing Company, pp.86-120. Döbereiner, J. 1992. History and new perspectives of diazotrophs in association with non-leguminous plants. Symbiosis 13, pp.1-13. Elmerich, C. 2007. Historical perspective: From bacterization to endophytes. Goldstein, A. H. 1986. Bacteria solubilization of mineral phosphates: Historycal perspective and future prospects. American Journal of Alternative Agriculture. Volume 1, issure 2, pp. 51-57. Hamdia, H. M. H. M. El-Komy, M. Shaddad. and A. M. Hetta. 2005. Effect off molybdenum of nitrogenase activities of wheat inoculated with Azospirillrum brasillense growth under drought stress. Gen Appl Plant Physiology 31: 43-54. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 42 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Illmer, P. and F. Schinner. 1995. Solubilization of inorganic phosphates by microorganisms isolated from forest soil. Soil Biology and Biochemistry. 24, pp. 389-395. Krau, A. et al. 2006. Complete genome of the mutualistic, N(2)-fixing grass endophyte Azoarcus sp. strain BH72. Nat. biotechnol. 24: 1385-1391. Kobayashi, D. Y. and J. D. Palumbo. 2000. Bacterial endophytes and their effects on plants and uses in agriculture. Microbial Endophytes, pp.199-213. Krieg N. R., Döbereiner J. 1984. Genus Azospirillum In: Bergey’s manual of systematic bacteriology 1, Murray et al. (eds), pp. 94-103. Lind Berg. and Granhall U. L. F. 1984. Isharolation and characterization of dinitrogen – fixing bacteria from the rhizosphere of temperate cereals and forage grasses, Appl. Environ Microbiol. 48, pp. 683 – 689. Muthukumarasamy R., G. Revathi, S. Seshadri and C. Laskshminarsimhan, (2002), « Gluconacetobacter diazotrophicus (Syn. Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte intropics », Curr Sci, 83, pp. 137-145. Nautiyal, C. S., (1999), “An efficient microbiological growth medium for screening phosphate solubilizing microorganisms” FEMS Microbiology Letters, 170, pp. 265-270. Pillay, V. K. and J. Nowak, (1997), “Inoculum density, temperature and genotype effects on invitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato. (Lycopersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a Pseudomonad bacterium”, Can J. Microbiol, 43, pp. 354-361. Quispel, A., (1992), “A search of signals in endophytic microorganisms”, In: Molecular signals in plant- microble communications, pp. 471-491. Tan, Z., T. Hurek and B. Reinhold-Hurek, (2003), “Effect of N-ferlitization, plant genotype and eviromental conditions on nifH gên pools in roots of rice” Environ. Microbiol, 5, pp. 1009-1015. Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 43 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT Trang web http://ngo.vaas.org.vn/nguongoccayngoovietnam.php, (25/6/2013) http://vi.wikipedia.org/wiki/Ng%C3%B4_(h%E1%BB%8D), (25/6/2013) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12541509.htm, (25/6/2013) http://duybiotech.wordpress.com/, (ngày 27/6/2013) http://luanvan.co/default.aspx, Chuyên nghành Vi Sinh Vật học (ngày 44 27/6/2013) Viện NC&PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục: Kết quả Bảng 1: Kết quả đo đạm (mg/l) Nghiệm thức DC TTN1a TTN1b TTN2 TTN3a TTN3b TTN3c TTN4a TTN4b TTN4c TTN5a TTN5b TTN6a TTN6b TTN7a TTN7b TTN7c TTN8a TTN8b TTN9 TTN10a TTN10b TTN10c TTN11a TTN11b TTN11c TTN11d TTN12a TTN12b TTN12c TTN13a TTN13b TTN14 TTN15 TTN16a TTN16b TTN17 TTL1a TTL1b TTL2a TTL2b TTL3a TTL3b TTL5a TTL5b TTL6a TTL6b TTL7 TTL8a TTL8b TTL9 TTL10 lần I 0,20 0,57 0,41 0,36 0,43 0,38 0,41 0,36 0,47 1,22 1,02 0,46 0,31 0,33 1,03 0,35 0,31 0,27 0,40 1,14 0,41 0,41 0,41 0,33 0,73 0,28 0,24 0,45 0,45 0,41 0,26 0,79 0,57 0,44 1,19 0,98 1,16 0,41 0,32 0,26 0,36 0,24 0,33 0,41 0,89 0,77 1,11 1,07 0,57 0,61 0,51 0,64 Ngày 2 lần II 0,21 0,57 0,41 0,36 0,43 0,37 0,41 0,35 0,47 1,21 1,02 0,46 0,31 0,34 1,02 0,35 0,31 0,28 0,39 1,14 0,41 0,41 0,40 0,33 0,26 0,29 0,24 0,47 0,45 0,41 0,26 0,79 0,57 0,41 1,19 0,98 1,16 0,44 0,32 0,26 0,36 0,24 0,32 0,44 0,84 0,77 1,11 1,09 0,59 0,61 0,52 0,63 lần III 0,22 0,59 0,43 0,36 0,44 0,38 0,44 0,35 0,47 1,22 1,03 0,41 0,31 0,34 1,02 0,36 0,31 0,27 0,39 1,14 0,43 0,41 0,4 0,33 0,26 0,29 0,24 0,47 0,45 0,41 0,24 0,79 0,56 0,41 1,19 0,98 1,17 0,41 0,31 0,27 0,36 0,27 0,31 0,43 0,87 0,76 1,13 1,09 0,57 0,61 0,51 0,63 lần I 0,50 1,20 1,16 4,31 1,06 1,25 1,01 1,06 1,88 3,63 4,55 1,40 3,39 1,03 3,97 0,86 0,94 1,40 1,64 4,80 1,20 1,08 1,06 1,03 2,76 0,99 1,16 1,69 1,33 0,91 1,45 4,46 1,37 1,52 2,00 3,46 4,60 1,40 1,76 2,27 1,52 0,74 1,86 1,64 5,84 1,62 4,31 3,44 1,20 0,91 1,11 1,01 Ngày 4 lần II 0,52 1,20 1,16 4,31 1,11 1,28 1,01 1,06 1,88 3,58 4,55 1,42 3,39 0,99 3,95 0,84 0,94 1,42 1,64 4,80 1,23 1,08 1,08 1,01 2,73 1,01 1,20 1,69 1,30 0,94 1,42 4,43 1,40 1,52 2,00 3,46 4,58 1,40 1,74 2,25 1,50 0,74 1,88 1,64 5,82 1,59 4,31 3,41 1,20 0,91 1,11 1,01 lần III 0,52 1,20 1,13 4,33 1,11 1,25 1,01 1,03 1,88 3,58 4,58 1,40 3,36 1,01 4,00 0,84 0,94 1,40 1,69 4,80 1,23 1,11 1,08 1,06 2,73 1,01 1,18 1,67 1,30 0,96 1,42 4,43 1,40 1,52 2,00 3,44 4,58 1,40 1,74 2,25 1,50 0,74 1,86 1,67 5,84 1,59 4,31 3,41 1,20 0,94 1,13 1,03 lần I 0,68 1,43 1,20 1,65 1,38 1,93 0,83 1,33 1,53 3,25 1,38 0,95 3,75 0,93 0,95 0,98 0,90 0,93 1,25 4,95 1,13 0,93 1,15 1,10 3,28 1,10 1,23 1,30 0,88 1,73 1,95 1,80 1,90 1,13 1,25 1,00 3,43 1,50 1,73 2,40 1,40 1,58 1,75 1,88 1,08 1,38 4,23 1,20 1,63 1,40 1,90 1,48 Ngày 6 lần II 0,68 1,43 1,23 1,63 1,35 1,93 0,80 1,35 1,53 3,25 1,38 0,95 3,75 0,93 0,88 1,00 0,90 0,93 1,28 4,95 1,15 0,93 1,18 1,10 3,30 1,13 1,23 1,30 0,90 1,73 1,95 1,78 1,90 1,13 1,25 1,15 3,45 1,50 1,75 2,38 1,43 1,58 1,75 1,88 1,00 1,25 4,23 1,25 1,63 1,40 1,90 1,50 lần III 0,73 1,45 1,20 1,63 1,35 1,93 0,85 1,33 1,53 2,93 1,38 0,95 3,75 0,90 0,90 1,00 0,90 0,95 1,30 4,95 1,13 0,95 1,15 1,10 3,30 1,13 1,25 1,30 0,90 1,70 1,95 1,75 1,88 1,13 1,28 1,05 3,45 1,53 1,75 2,40 1,40 1,55 1,80 1,83 0,95 1,28 4,23 1,15 1,63 1,38 1,85 1,53 lần I 0,80 1,83 2,67 2,53 2,03 1,63 2,00 4,10 2,03 2,77 2,10 2,00 2,33 0,87 2,27 0,50 0,80 0,43 0,50 2,17 0,63 0,50 0,73 0,97 1,50 0,67 0,73 1,33 0,97 1,67 1,80 2,07 1,63 1,70 1,80 1,40 1,83 0,50 1,17 1,03 1,43 1,50 1,70 1,70 0,83 1,83 1,70 2,70 1,73 1,20 1,33 1,53 Ngày 8 lần II 0,77 1,87 2,67 2,53 2,03 1,63 2,00 4,07 2,00 2,77 2,13 2,03 2,37 0,90 2,20 0,50 0,80 0,43 0,53 2,00 0,67 0,50 0,77 0,97 1,53 0,67 0,77 1,30 1,00 1,67 1,83 2,10 1,70 1,70 1,83 1,43 1,83 0,50 1,20 1,00 1,40 1,50 1,67 1,77 0,87 1,83 1,73 2,67 1,73 1,20 1,33 1,50 lần III 0,80 1,83 2,67 2,53 2,03 1,63 2,00 4,10 2,00 2,80 2,13 2,03 2,33 0,83 2,23 0,50 0,77 0,43 0,50 2,20 0,67 0,57 0,73 1,00 1,60 0,73 0,73 1,33 1,03 1,70 1,80 2,07 1,67 1,67 1,87 1,43 1,83 0,57 1,23 1,07 1,47 1,43 1,70 1,70 0,87 1,83 1,73 2,67 1,73 1,23 1,33 1,50 Số liệu xử lý thống kê đạm theo từng ngày: ANOVA (ngày 2) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 13.17734 0.159802 13.33714 MS 0.258379 0.001537 F tính 168.1543 F bảng 0.05 1.22 0.01 1.32 ANOVA (ngày 4) Nguồn NT Sai số df 51 104 SS 270.7048 0.023565 MS 5.307937 0.000227 F tính 23425.69 F bảng 0.05 1.22 0.01 1.32 ANOVA (ngày 6) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 121.3879 0.12875 121.5166 MS 2.380154 0.001238 F tính 1922.61 F bảng 0.05 1.22 0.01 1.32 ANOVA (ngày 8) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 79.41878 0.08 79.49878 MS 1.557231 0.000769 F tính 2024.401 F bảng 0.05 1.22 0.01 1.32 Bảng 2: Kết quả đo lân (mg/l) Nghiệm thức DC TTN1a TTN1b TTN2 TTN3a TTN3b TTN3c TTN4a TTN4b TTN4c TTN5a TTN5b TTN6a TTN6b TTN7a TTN7b TTN7c TTN8a TTN8b TTN9 TTN10a TTN10b TTN10c TTN11a TTN11b TTN11c TTN11d TTN12a TTN12b TTN12c TTN13a TTN13b TTN14 TTN15 TTN16a TTN16b TTN17 TTL1a TTL1b TTL2a TTL2b TTL3a TTL3b TTL5a TTL5b TTL6a TTL6b TTL7 TTL8a TTL8b TTL9 TTL10 lần I 0,74 54,63 43,14 59,00 43,86 55,25 58,05 49,50 59,71 63,62 42,16 60,36 64,00 55,70 36,12 52,89 62,75 59,14 59,13 63,29 63,22 72,79 66,24 43,07 68,57 62,55 56,31 65,57 54,50 23,52 28,83 23,09 30,80 49,36 30,00 32,17 62,08 14,44 27,84 23,09 17,65 26,42 32,96 28,77 27,57 27,24 72,04 34,01 41,57 17,07 9,71 17,14 Ngày 5 lần II 0,84 54,77 43,00 58,57 43,79 55,31 58,12 49,50 60,00 63,76 42,22 60,14 63,64 55,64 36,18 52,89 62,62 58,93 58,93 63,02 63,15 72,79 66,38 42,86 68,64 62,62 56,11 65,64 54,63 23,52 28,77 23,03 30,86 49,14 30,00 32,50 62,21 14,44 27,84 23,15 17,72 26,42 32,90 28,70 27,50 27,70 72,04 34,01 41,14 17,33 9,29 17,07 lần III 0,94 54,77 43,36 59,86 43,86 55,25 58,46 49,64 59,50 63,56 42,22 60,93 63,64 55,77 36,32 52,95 62,68 59,07 59,06 63,02 63,36 73,29 66,31 43,00 68,64 62,55 56,44 65,77 54,30 23,52 28,83 23,16 30,86 49,21 30,00 32,43 62,15 14,44 27,90 23,09 17,65 26,42 32,96 28,70 27,57 27,70 72,04 34,14 41,14 17,50 9,43 17,07 lần I 0.78 58.16 42.46 90.46 58.92 57.13 64.68 51.46 86.23 71.14 44.41 64.62 136.38 60.00 61.00 69.94 64.68 93.46 87.53 117.85 70.51 58.62 69.43 71.50 96.62 64.68 59.05 77.15 59.94 26.20 36.08 82.35 33.61 79.33 40.77 80.24 65.32 27.50 29.97 30.40 22.81 28.43 39.29 38.06 74.35 65.11 70.62 64.62 56.25 37.67 30.92 29.58 Ngày 10 lần II 0.87 58.04 42.92 90.62 58.92 57.19 64.81 51.38 86.38 71.14 44.41 64.62 136.38 60.06 61.11 69.87 64.68 93.54 87.47 117.85 70.63 58.77 69.43 71.42 96.77 64.68 59.11 77.09 60.06 26.27 36.08 82.57 33.67 79.17 40.71 80.19 65.32 27.50 29.97 30.34 22.81 28.36 39.29 38.12 74.30 65.32 70.73 64.68 56.08 37.67 30.92 29.83 lần III 0.97 58.16 42.08 90.62 58.85 57.25 64.81 51.23 86.31 71.14 44.35 64.77 136.54 60.00 61.00 69.94 64.62 93.77 87.53 117.22 70.63 58.85 69.43 71.25 96.92 64.62 59.18 77.22 59.94 26.20 36.08 82.51 33.67 79.25 40.77 80.35 65.25 27.56 29.97 30.34 22.75 28.36 39.29 38.12 74.19 65.22 70.57 64.46 56.42 37.50 30.83 29.67 lần I 2,28 52,52 41,74 81,67 52,80 48,36 56,55 46,44 56,52 53,76 46,20 62,11 71,89 61,34 46,64 49,72 59,10 51,89 61,40 75,50 55,34 39,24 62,76 40,53 62,35 45,31 53,01 70,96 51,21 27,99 37,38 46,49 34,41 39,18 33,61 34,28 52,39 15,90 46,14 32,38 25,71 29,29 40,15 39,29 35,05 48,28 53,72 45,87 32,59 32,18 36,65 32,47 Ngày 15 lần II 2,15 52,52 41,08 81,82 53,18 48,43 56,55 46,21 56,59 53,82 46,08 62,18 71,74 61,27 46,49 49,78 59,04 51,82 61,40 75,62 55,40 39,77 62,89 40,59 62,27 45,93 53,01 70,90 51,27 27,93 37,38 46,59 34,48 39,06 33,61 34,44 52,45 15,96 46,14 32,38 25,65 29,35 40,15 39,29 35,05 48,28 53,67 45,87 32,71 31,35 36,29 32,41 lần III 1,61 52,52 42,42 81,97 52,88 48,43 56,43 46,44 86,59 53,88 46,20 62,11 71,82 61,27 46,54 49,72 59,10 52,05 61,34 75,56 55,34 39,77 62,70 40,53 62,12 45,93 53,07 70,96 51,21 27,93 37,31 46,49 34,41 39,00 33,67 34,38 52,39 15,96 46,14 32,44 25,71 29,29 40,03 39,29 35,10 48,18 53,67 45,82 32,65 31,12 36,47 32,71 lần I 3,89 34,34 45,31 58,55 38,83 20,83 37,88 48,21 60,34 50,87 38,55 29,03 60,07 58,58 42,72 53,58 41,70 57,59 39,62 42,67 54,76 43,52 55,03 53,79 50,97 30,66 65,24 44,83 38,65 35,83 41,33 46,44 36,57 52,93 46,70 31,17 39,83 14,54 48,36 38,06 38,73 34,54 42,07 40,09 25,28 44,67 42,89 40,22 35,07 29,93 30,29 33,00 Ngày 20 lần II 3,89 34,34 45,03 59,10 39,72 20,83 37,88 48,34 60,34 50,80 38,55 28,07 60,14 58,44 42,89 53,51 41,77 57,24 39,62 42,67 54,76 43,66 55,10 54,00 50,90 30,73 65,31 44,76 38,51 35,83 41,33 46,39 36,51 52,79 46,64 31,06 39,76 14,60 48,36 38,06 38,67 34,60 42,07 40,09 25,39 44,72 43,00 40,17 35,14 29,50 30,36 33,14 lần III 3,30 34,34 45,38 58,41 39,66 20,77 37,95 49,79 60,07 50,80 38,67 28,00 59,79 58,51 42,78 53,51 41,70 57,38 39,55 42,67 54,76 43,45 55,03 54,00 50,00 30,73 65,31 44,83 38,58 35,77 41,39 46,28 36,45 52,86 46,82 31,17 39,83 14,54 48,30 38,06 38,67 34,54 42,07 40,15 25,44 44,83 42,89 40,28 35,36 29,64 30,00 32,93 Số liệu xử lý thống kê lân theo từng ngày: ANOVA (ngày 5) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 52912 2.7173 52914 MS 1037.5 0.0261 F tính 39707 F bảng 0.05 1.22 0.01 1.32 F tính 157211 F bảng 0.05 1.22 0.01 1.32 ANOVA (ngày 10) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 95876 1.2436 95877 MS 1879.9 0.012 ANOVA (ngày 15) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 34261 604.26 34865 MS 671.79 5.8102 F bảng F tính 5% 115.62 1.22 1% 1.32 ANOVA (ngày 20) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS MS 21264 416.95 4.5229 0.0435 21269 F bảng F tính 0.05 9587.4 1.22 0.01 1.32 Bảng 3: Kết quả đo IAA (mg/l) Nghiệm thức DC TTN1a TTN1b TTN2 TTN3a TTN3b TTN3c TTN4a TTN4b TTN4c TTN5a TTN5b TTN6a TTN6b TTN7a TTN7b TTN7c TTN8a TTN8b TTN9 TTN10a TTN10b TTN10c TTN11a TTN11b TTN11c TTN11d TTN12a TTN12b TTN12c TTN13a TTN13b TTN14 TTN15 TTN16a TTN16b TTN17 TTL1a TTL1b TTL2a TTL2b TTL3a TTL3b TTL5a TTL5b TTL6a TTL6b TTL7 TTL8a TTL8b TTL9 TTL10 lần I 1,88 2,13 2,25 2,50 2,50 2,88 2,88 2,50 2,13 2,75 2,88 3,00 3,13 2,50 2,25 2,13 2,00 2,75 2,38 2,00 2,13 3,00 2,75 2,88 2,13 3,00 2,75 3,00 2,13 3,00 3,38 3,13 2,75 3,25 3,25 2,13 2,50 2,38 2,38 3,13 3,00 2,25 2,00 2,25 2,63 2,38 2,63 2,25 2,50 2,75 3,25 3,13 Ngày 2 lần II 1,88 2,13 2,13 2,38 2,50 2,88 2,88 2,50 2,13 2,63 2,88 3,00 3,13 2,50 2,25 2,00 2,00 2,75 2,50 2,00 2,25 2,88 2,88 2,75 1,88 2,75 2,88 3,00 2,13 3,13 3,13 3,13 2,63 3,25 3,13 2,00 2,50 2,38 2,25 3,13 3,13 2,25 2,13 2,38 2,63 2,5 2,75 2,25 2,38 2,75 3,25 3,13 lần III 2,00 2,13 2,13 2,38 2,38 2,75 2,88 2,50 2,25 2,50 2,88 3,13 3,13 2,500 2,25 2,13 2,00 2,63 2,38 1,88 2,13 3,00 3,00 2,75 2,00 2,75 2,75 3,13 2,13 3,38 3,25 3,38 2,63 3,38 3,13 2,00 2,63 2,38 2,25 3,25 3,13 2,38 2,00 2,38 2,5 2,5 2,63 2,25 2,5 2,75 3,13 3,13 lần I 2,86 4,86 7,29 5,29 5,71 4,86 4,86 5,14 6,14 6,14 5,71 5,14 5,86 5,71 4,57 5,00 7,00 6,00 4,00 12,7 6,57 6,00 5,14 4,86 5,43 6,71 5,71 4,29 8,00 5,14 5,29 6,00 5,00 4,57 5,86 4,29 3,71 7,71 8,71 8,14 9,71 11,30 9,00 13,40 10,10 11,10 11,60 9,86 11,3 14,7 13,1 9,57 Ngày 4 lần II 3,00 4,86 7,43 5,29 5,71 5,00 5,00 5,00 6,14 6,14 5,71 5,14 6,00 5,71 4,57 4,86 7,00 5,86 4,00 12,7 6,43 5,86 5,29 4,71 5,57 6,57 5,71 4,14 8,00 5,00 5,29 6,14 5,14 4,57 6,00 4,29 3,86 7,71 8,71 8,14 9,57 11,40 9,29 13,40 10,10 11,00 11,70 9,86 11,40 14,6 13,10 9,43 lần III 3,00 4,86 7,29 5,14 5,71 4,86 5,00 5,14 6,14 6,14 5,86 5,14 5,86 5,71 4,71 4,86 7,00 5,86 4,14 12,7 6,43 5,86 5,29 4,86 5,71 6,71 5,57 4,14 8,00 5,14 5,43 6,14 5,14 4,57 6,00 4,29 3,86 7,71 8,71 8,00 9,57 11,30 9,14 13,40 10,10 11,00 11,90 9,71 11,40 14,70 13,10 9,57 lần I 3,13 4,63 4,38 4,88 3,63 4,38 3,88 4,13 5,00 4,00 4,63 4,88 4,13 4,88 4,25 3,50 4,88 5,13 4,75 8,88 4,13 3,88 4,00 3,88 4,75 4,50 4,63 5,00 5,00 4,88 4,38 4,25 4,88 4,63 4,38 6,13 5,25 5,63 6,50 5,50 13,00 8,75 8,00 8,13 3,88 9,88 6,5 8,75 6,88 8,13 6,63 4,38 Ngày 6 lần II 3,13 4,63 4,38 4,75 3,75 4,38 3,88 4,13 5,13 4,00 4,63 4,88 4,13 4,88 4,13 3,63 4,88 5,00 5,00 8,88 4,13 3,75 4,00 3,75 4,88 4,63 4,75 5,13 4,75 4,88 4,5 4,00 5,00 4,63 4,5 6,25 5,25 5,63 6,50 5,00 9,25 8,88 8,25 8,13 3,88 9,75 6,63 8,75 6,88 8,13 6,63 4,38 lần III 3,13 4,75 4,38 4,88 3,75 4,38 3,75 4,13 4,88 4,00 4,50 4,75 4,13 4,88 4,13 3,5 5,00 5,13 5,00 8,63 4,13 3,75 4,00 3,88 5,00 4,63 4,75 5,00 4,63 4,75 4,63 4,00 5,00 4,38 4,5 6,13 5,38 5,63 6,38 5,25 7,38 8,75 8,13 8,13 3,88 9,75 6,75 8,63 6,88 8,13 6,63 4,38 lần I 3,47 2,08 0,14 0,42 0,97 1,53 1,25 0,69 0,14 0,97 1,25 1,81 0,14 0,97 0,69 0,97 0,42 0,42 1,25 0,97 0,97 3,19 1,53 0,42 0,42 1,81 1,53 1,53 1,25 2,92 0,97 1,25 1,81 1,53 0,14 1,25 2,36 1,25 0,42 1,53 0,42 0,42 1,53 2,64 1,53 0,42 0,14 2,92 0,14 1,81 0,69 2,36 Ngày 8 lần II 3,47 2,08 0,14 0,42 0,69 1,53 0,97 0,69 0,14 1,53 1,25 1,81 0,14 1,25 0,69 1,53 0,69 0,42 1,25 0,97 0,97 3,47 1,53 0,69 0,42 1,81 1,53 1,81 0,97 2,92 0,97 1,25 1,53 1,53 0,14 1,25 2,36 1,53 0,14 1,81 0,42 0,42 1,25 2,64 1,25 0,69 0,14 3,19 0,14 1,53 0,97 2,36 lần III 3,19 2,08 0,14 0,42 0,97 1,81 0,97 0,97 0,14 0,97 1,53 1,81 0,42 1,25 0,69 1,53 0,69 0,14 0,69 0,97 0,97 3,19 1,53 0,69 0,42 1,81 1,25 1,53 0,97 2,92 1,25 0,97 1,53 1,53 0,14 1,25 2,36 1,53 0,69 1,81 0,42 0,42 1,25 2,92 1,25 0,69 0,14 3,19 0,14 1,53 0,97 2,36 Số liệu xử lý thống kê IAA theo từng ngày: ANOVA (NGÀY 2) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 25.716 0.6146 26.33 MS 0.5042 0.0059 F tính 85.326 F bảng 0.05 1.22 0.01 1.32 0.01 ANOVA (NGÀY 4) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 1236.1 0.5714 1236.7 MS F tính F bảng 0.05 24.23709 4411.15 1.22 1.32 F bảng 0.05 0.01 1.22 1.32 F bảng 0.05 0.01 1.22 1.32 0.0055 ANOVA (NGÀY 6) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 439.68 17.177 456.86 MS 8.6213 0.1652 F tính 52.19814 ANOVA (NGÀY 8) Nguồn NT Sai số Tổng df 51 104 155 SS 107.4 2.1605 109.56 MS 2.1059 0.0208 F tính 101.3707 [...]... bón vô cơ, tăng cường phân sinh học góp phần giảm giá thành sản xuất, giảm sự phụ thuộc vào nguồn vật liệu hóa thạch, giảm ô nhiễm môi trường, giảm hàm lượng nitrate trong nông sản Vì vậy vi c nghiên cứu về Phân lập vi khuẩn nội sinh thân cây bắp trồng trên đất xám ở tỉnh Tây Ninh là cần thiết Mục tiêu nghiên cứu của đề tài :  Phân lập được những dòng vi khuẩn nội sinh thân cây bắp có khả năng cố định... màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm (OD530 nm) Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 23 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh đã phân lập 4.1.1 Phân lập vi khuẩn Từ bảy mẫu thân cây bắp được lấy ở các địa điểm: xã Gia Bình-Trảng Bàng -Tây Ninh; xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh; xã Cẩm... khả năng chuyển động của vi khuẩn 3.3.4 Xác định đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh Cấy kiểm tra tất cả những dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được trên 3 môi trường đặc (Burk’s không N, NBRIP và môi trường phân lập vi khuẩn không bổ sung Tryptophan) để ghi nhận mức độ sinh trưởng của những dòng vi khuẩn này Mỗi môi Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 20 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp... xã Cẩm Giang-Gò Dầu -Tây Ninh; Phạm Văn Mạnh ấp 4 xã Trà Vong và xã Thạnh Đông thuộc huyện Tân Biên tỉnh Tây Ninh đã phân lập được 51 dòng vi khuẩn Trong số 51 dòng vi khuẩn đã phân lập có 36 dòng trên môi trường NFb và 15 dòng trên môi trường LGI Bảng 6: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn đã phân lập STT Vi khuẩn Nguồn gốc các dòng vi khuẩn Môi trường 1 TTN1a Xã Trà Vong-Tân Biên- Tây Ninh NFb 2 TTN1b Xã... lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh 3.3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu Thân cây bắp được thu bằng cách nhổ ngẫu nhiên ở 5 địa điểm Mỗi địa điểm từ 2 – 3 gốc cây bắp Thân được thu ở những cây từ 40 – 60 ngày tuổi vì ở giai đoạn này thân của cây bắp sinh trưởng và phát triển tốt đồng thời mật số của những vi khuẩn nội sinh cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây và các điều kiện môi trường... nội sinh trong các loài cây ở Vi t Nam như Nguyễn Thị Thu Hà et al (2008) đã phân lập được vi khuẩn nội sinh trong một số loại cỏ chăn nuôi, Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Ái Chi (2009), Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Thành Dũng (2010) phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây khóm trồng trên đất phèn huyện Bến Lức, tỉnh Long An và huyện Vĩnh Thuận, tỉnh Kiên Giang Xu hướng mới trong sản xuất hiện nay là giảm lượng phân. .. Dầu -Tây Ninh LGI 37 TTL1b Xã Cẩm Giang-Gò Dầu -Tây Ninh LGI 38 TTL2a Xã Cẩm Giang-Gò Dầu -Tây Ninh LGI 39 TTL2b Xã Cẩm Giang-Gò Dầu -Tây Ninh LGI 40 TTN12b Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 41 TTN12c Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 42 TTN13a Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 43 TTN13b Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 44 TTN14 Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 45 TTN15 Xã Đồng Khởi-Châu... TTN15 Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 46 TTN16a Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 47 TTN16b Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 48 TTN17 Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh NFb 49 TTL5b Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh LGI 50 TTL6a Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh LGI 51 TTL6b Xã Đồng Khởi-Châu Thành -Tây Ninh LGI 25 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Chuyên nghành Vi Sinh Vật học Luận văn tốt nghiệp... tựu của vi c lai tạo giống mới đã đưa ra nhiều loại giống mới có khả năng thích ứng rộng trên nhiều vùng sinh thái khác nhau, cho năng suất cao và có thời gian sinh trưởng phù hợp với mọi thời vụ và địa hình Trong đó bắp lai đã đóng góp phần tích cực vào sự phát triển của cây bắp ở Vi t Nam nói chung và tỉnh Tây Ninh nói riêng Đất trồng bắp ở vùng này chủ yếu là đất xám Đất xám có nguồn gốc từ đất phù... Chuyên nghành Vi Sinh Vật học 1 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT không cao nhưng độ ẩm cây héo thấp, đây cũng là loại đất thích hợp để trồng bắp nhưng cần bón nhiều phân NPK hơn đối với đất bazan Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn sống trong mô thực vật được tìm thấy ở vùng rễ, thân, lá, quả của thực vật Vùng rễ là nơi xuất phát nhiều vi khuẩn nội sinh chui