3.3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu
Thân cây bắp được thu bằng cách nhổ ngẫu nhiên ở 5 địa điểm. Mỗi địa điểm từ 2 – 3 gốc cây bắp. Thân được thu ở những cây từ 40 – 60 ngày tuổi vì ở giai đoạn này thân của cây bắp sinh trưởng và phát triển tốt đồng thời mật số của những vi khuẩn nội sinh cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al., 2003).
Để loại trừ các vi sinh vật có khả năng còn bám ở bề mặt thân, mẫu sau khi thu thập được tiến hành xử lý như sau: rửa sạch phần thân, dưới vòi nước mạnh; tiếp tục rửa lại bằng nước cất vô trùng rồi cắt thân thành những đoạn nhỏ 1-2 cm, làm khô mẫu bằng giấy hút ẩm; sau đó lần lượt khử trùng mẫu thân bằng cồn 96% trong 3 phút, hydrogen peroxide 3% (H2O2) trong 3 phút và rửa lại với nước cất vô trùng 4 lần để tẩy rửa các loại hóa chất còn thừa.
Ngoài ra để kiểm tra khả năng các vi sinh vật còn xót lại trên bề mặt mẫu thân sau khi khử trùng, lấy 200µl nước cất vô trùng đã rửa mẫu ở lần thứ 4 (lần cuối) chủng lên các đĩa môi trường Tryptone – Yeast extract – glucose – agar và ủ ở 300C, nếu sau 24 giờ ủ các đĩa môi trường này không thấy xuất hiện các khuẩn lạc thì mẫu thân đã khử trùng đạt yêu cầu.
3.3.1.2 Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh từ thân cây bắp
Mẫu thân sau khi khử trùng đạt yêu cầu cho vào cối và thêm 1 - 2ml nước cất vô trùng rồi nghiền nát. Lấy 100µl dịch nghiền của thân chủng vào các ống nghiệm chứa 3ml môi trường LGI và NFb bán đặc và đậy nắp các ống nghiệm rồi đem ủ trong tủ ủ ở 300C trong 2 – 3 ngày.
Sau 2 – 3 ngày nuôi, quan sát thấy các ống nghiệm chứa các môi trường bán đặc LGI và NFb đã chủng dịch trích của mẫu xuất hiện một lớp màng mỏng (pellicle) cách bề mặt môi trường nuôi khoảng 0,5 cm chỉ thị có sự hiện diện của vi khuẩn nội sinh.
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ các vòng pellicle của các môi trường bán đặc LGI và NFb lần lượt cấy chuyển sang các đĩa môi trường LGI và NFb đặc để tách ròng các khuẩn lạc.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Sau vài lần cấy chuyển trên các môi trường LGI và NFb đặc, chọn các khuẩn lạc rời và đều nằm trên đường cấy quan sát dưới kính hiển vi. Khi thấy vi khuẩn đã ròng thì cấy vào ống nghiệm chứa môi trường đặc tương ứng trữ ở 40C và được xem như một dòng (isolate).