Sau khi tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần.
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn
Nhỏ 15µl nước cất vô trùng lên lame
Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội
Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lame
Đậy lame lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lame tiếp xúc với lame một góc 450 rồi hạ lame xuống từ từ nhẹ nhàng sao cho mẫu vật không có bọt khí.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Tiến hành quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
3.3.4 Xác định đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh
Cấy kiểm tra tất cả những dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được trên 3 môi trường đặc (Burk’s không N, NBRIP và môi trường phân lập vi khuẩn không bổ sung
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
trường lựa chọn các dòng vi khuẩn biểu hiện dương tính mạnh nhất để tiến hành đo khả năng cố định đạm sinh học và hòa tan lân khó tan.
Khả năng cố định đạm
- Vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường không có đạm là vi khuẩn có khả năng cố định đạm vì vi khuẩn này có khả năng tổng hợp đạm từ không khí. Chọn những dòng vi khuẩn nội sinh cấy trên môi trường Burk’s không đạm đặc và ủ ở 300C, theo dõi sự phát triển của chúng từ 1 – 2 ngày. Dòng vi khuẩn nào phát triển được trong môi trường thì chúng có khả năng cố định đạm.
- Định lượng ammonium do vi khuẩn tạo ra
Nguyên tắc: xác định nồng độ NH4+, nhờ phản ứng giữa phenol và NH3 dưới sự
hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochloride trong môi trường kiềm tạo thành Indophenol có màu xanh. Sodium nitroprusside sẽ làm tăng hiệu quả phản ứng giữa NH3 và phenol (Page et al., 1982). Hàm lượng NH4+ được xác định bằng cách đo cường độ màu trên máy quang phổ tại bước sóng 636nm.
Hóa chất: (1) Dung dịch KCl 2M: Hòa tan 15g KCl trong 100ml nước cất. (2) Stock (NH4+): hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước, trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40ml stock (NH4+) để được 200ml, cuối cùng được dung dịch chứa 2µg/ml. (3) Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong 0,5 lít nước. (4) Hypocloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl với 5g NaOH trong 0,5 lít nước. (5) Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường lỏng LGI hoặc NFb với 15ml môi trường trong ống nghiệm.
Chủng vi khuẩn vào trong ống nghiệm chứa môi trường LGI hoặc NFb lỏng lắc trên máy lắc xoay vòng với tốc độ 120 vòng/phút.
Phương pháp định lượng
Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 5ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 0ml NH4+ Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 4ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 1ml NH4+ Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 3ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 2ml NH4+ Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 2ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 3ml NH4+ Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 1ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 4ml NH4+
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0ml H2O; 5ml buffer, 5ml thuốc thử và 5ml NH4+ Hút 2ml dịch vi khuẩn trong các ống facol cho vào các eppendorf
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút
Hút 2ml dịch vi khuẩn ở các thời điểm 2, 4, 6, 8, đem ly tâm và 4ml H2O; 5ml buffer; 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD
Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+ , đo phổ OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ đồ thị bằng chương trình Excel có thể tính ra được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
Khả năng hòa tan lân khó tan
- Dùng thuốc thử acid ascorbic–amoniummolybdate–potassium antinomonyltartrate để đánh giá lượng lân được vi khuẩn hòa tan trong dung dịch theo nguyên lý:
Chất lân sau khi được hòa tan trong môi trường sẽ tác dụng với amoniummolybdate trong môi trường acid tạo thành hợp chất phosphomolybdate màu vàng.
Dưới sự hiện diện của chất khử, Mo6+ bị khử thành Mo3+ hoặc Mo2+ làm dung
dịch có màu xanh. Cường độ màu xanh thay đổi theo hàm lượng lân có trong dịch huyền phù của vi khuẩn, pH và điều kiện khử của môi trường. Đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880nm.
Trong môi trường acid vừa phải, nồng độ molybdate dư thừa, lượng chất khử cố định, nồng độ lân nhỏ ở phạm vi nhất định thì mật độ quang học của màu xanh tỉ lệ thuận với làm lượng lân theo đúng định luật Bir Lambeg.
- Để đánh giá khả năng hòa tan lân khó tan của những dòng vi khuẩn nội sinh, thực hiện các thí nghiệm sau:
Chủng 500µl dịch huyền phù vi khuẩn đã nuôi vào các ống facol có chứa 50ml
môi trường NBRIP lỏng (Nautiyal., 1999), lắc trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Lấy mẫu ở ngày thứ 5, 10, 15, 20 ngày nuôi để xác định hàm lượng lân hòa tan bằng máy so màu theo phương pháp Oniani.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
Khảo sát khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)
+Chuẩn bị mẫu
Lấy dịch vi khuẩn gốc lần lượt chủng vào tuýp eppendorf 2 ml có chứa môi trường LGI và NFb lỏng không có bổ sung tryptophan, ủ trong tối. Mỗi nghiệm thức lập lại 3 lần.
Lấy tuýp eppendorf chứa mẫu được nuôi ở thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày để xác định hàm lượng IAA tổng hợp.
+Phương pháp đo IAA
Xây dựng đường chuẩn IAA:
Đường chuẩn 0 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 0µl IAA Đường chuẩn 1 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 2µl IAA Đường chuẩn 2 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 4µl IAA Đường chuẩn 3 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 6µl IAA Đường chuẩn 4 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 8µl IAA Đường chuẩn 5 ppm gồm có: 0,5ml H2O; 1ml thuốc thử và 10µl IAA
Trộn đều dung dịch trong các ống nghiệm bằng máy vortex và để ổn định ở nhiệt độ phòng, trong tối khoảng 15-20 phút.
Mẫu: các tuýp eppendorf được lấy ra, sau đó đem ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Chuẩn bị 1 ống nghiệm cho mỗi mẫu và lần lượt cho vào các thành phần sau: 0,5 ml dịch mẫu 1 ml dung dịch thuốc thử Salkowsky. Trộn đều dung dịch trong các ống nghiệm bằng máy vortex và để ở ổn định khoảng 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, trong tối (Cao Ngọc Điệp, 2011). Tiến hành đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu Salkowsky ở bước sóng 530 nm (OD530nm).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 – 2013 Trường ĐHCT
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN