phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá (houttuynia cordata t ) ở tỉnh cà mau

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ Houttuynia c

- -LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH

TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.)

Ở TỈNH CÀ MAU

PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP VÕ CHÍ MẢI

MSSV: 3113728 Lớp: Vi Sinh Vật Học K37

Cần Thơ, Tháng 7/2014

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- -LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

PHÂN LẬP CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH

TRONG CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata T.)

Ở TỈNH CÀ MAU

MSSV: 3113728 Lớp: Vi Sinh Vật Học K37

Cần Thơ, Tháng 7/2014

PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

(Ký tên) (Ký tên)

PHÊ DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2014

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(Ký tên)

Bốn năm học tập và nghiên cứu ở trường Đại học Cần Thơ, đây không phải là

thời gian quá dài trong cuộc đời nhưng nó là khoảng thời gian tôi không bao giờ quên

trong tâm trí của tôi Đến nay tôi đã hoàn thành Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên

ngành Vi Sinh Vật Học Trong thời gian học tập và nghiên cứu, tôi luôn được sự hỗ

trợ và động viên từ gia đình, quý Thầy Cô và bạn bè giúp tôi vượt qua những khó

khăn, hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Cha mẹ và gia đình của tôi, họ luôn là nguồn động viên, an ủi khi tôi gặp khó

khăn

Phó Giáo sư - Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh

học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học

Cần Thơ, Thầy hướng dẫn đề tài, đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm học tập

và nghiên cứu khoa học

Quý thầy cô của Viện NC & PT Công nghệ sinh học, đã truyền đạt những kiến

thức bổ ích cho việc hoàn thành luận văn và tìm kiếm việc làm sau này

Cán bộ quản lí phòng thí nghiệm vi sinh vật, các anh chị cao học K19, các em

sinh viên K38, tập thể lớp Vi sinh vật K37 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi để hoàn thành luận

văn thật tốt đẹp

Cuối cùng, xin gửi lời chúc sức khỏe đến cha mẹ, người thân, quý Thầy Cô và tất cả

bạn bè của tôi

Xin chân thành cảm ơn!

Cần thơ, ngày 17, tháng 11, năm 2014

Võ Chí Mải

Diếp cá là cây trồng phổ biến ở Việt Nam, chúng dùng như một loại rau hàng

ngày trong cuộc sống, một số nghiên cứu cho thấy cây Diếp cá có hoạt tính kháng

khuẩn và được ứng dụng để điều trị một số bệnh thông thường Tuy nhiên việc nghiên

cứu tập đoàn vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá chưa được nghiên cứu nhiều, vì vậy

đề tài phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá đã thực hiện Từ mẫu cây Diếp cá

được trồng tại Cà Mau, đã phân lập được 21 dòng vi khuẩn trên môi trường PDA

đặc Đa số các dòng vi khuẩn này có dạng hình que, gram âm và có khả năng chuyển

động, ngoài ra chúng còn có các đặc tính cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân

Kết quả khảo sát khả năng cố định ammonium và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy

các dòng vi khuẩn này có thể tổng hợp được một lượng ammonium cao nhất ở ngày 2

sau khi chủng và giảm ở ngày 4 và 6 Trong đó, dòng L1-DD1 có khả năng tổng hợp

lượng ammonium cao nhất (2,62 µg/mL) Nồng độ IAA được sinh ra nhiều nhất ở ngày

thứ 4 và giảm ở ngày thứ 6 là 4,49 µg/mL (do dòng L2-DD2 tổng hợp) Tám dòng vi

khuẩn có khả năng hòa tan lân khó tan, dòng R3-CM có khả năng hòa tan lân lớn nhất

lên đến 182,31% ở ngày thứ 6 Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn trên 2 chủng vi

khuẩn Escherichia coli và Aeromonas hydrophila cho thấy có 5 dòng có hoạt tính

kháng Escherichia coli, 4 dòng có tính kháng Aeromonas hydrophila và 2 dòng có khả

năng kháng được Escherichia coli và Aeromonas hydrophila là dòngL1-DD1 và

R1-DD2 Ba dòng vi khuẩn được nhận diện ở cấp độ loài bằng phương pháp giải trình tự

16S-rRNA Dòng L1-DD1 được nhận diện là Bacillus megaterium strain ATCC 14581 (ở mức độ là 98%) Dòng R1-DD2 được nhận diện là Bacillus amyloliquefaciens

subsp Plantarum strain FZB42 có độ tương đồng là 93% với và dòng T6-DD1 được

nhận diện là Bacillus aerius strain 24K có độ tương đồng 94%

Từ khóa: Bacillus megaterium, Bacillus amyloliquefaciens subsp Plantarum, Bacillus

aerius, cây Diếp cá, kháng khuẩn, tổng hợp amonium - IAA, vi khuẩn nội sinh

Trang

PHẦN KÝ DUYỆT ii

LỜI CẢM TẠ iii

TÓM TẮT iv

MỤC LỤC v

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH x

CÁC TỪ VIẾT TẮT xii

CHƯƠNG I:GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về Cà Mau 3

2.1.1 Vị trí địa lý 3

2.1.2 Điều kiện tự nhiên: 4

2.2 Tổng quan về cây Diếp cá 5

2.2.1 Tên gọi và phân loại 5

2.2.2 Mô tả: 6

2.2.3 Phân bố: 6

2.2.4 Thành phần hóa học: 6

2.2.5 Tác dụng dược lý: 7

2.2.6 Tính vị, công năng: 7

2.2.7 Công dụng: 7

2.3 Tổng quan về vi khuẩn nội sinh: 7

2.3.1 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp: 9

2.4 Một số vi khuẩn gây bệnh 15

2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli 15

2.4.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila 17

2.5 Tình hình nghiên cứu cây Diếp cá trong và ngoài nước 18

2.5.2 Ngoài nước 18

2.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 20

2.6.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR 20

2.6.2 Mồi (primer) sử dụng trong kỹ thuật PCR 21

2.6.3 Điện di gel agarose 22

2.6.4 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã 24

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

3.1 Phương tiện nghiên cứu 25

3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực hiện 25

3.1.2 Vật liệu 25

3.1.3 Dụng cụ - Thiết bị 25

3.1.4 Hóa chất 26

3.2 Phương pháp nghiên cứu 30

3.2.1 Thu thập và xử lý mẫu 30

3.2.2 Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá 30

3.2.3 Quan sát hình dạng, khả năng chuyển động và kích thước vi khuẩn… ….31

3.2.4 Nhuộm Gram vi khuẩn 33

3.2.5 Xác định khả năng tổng hợp NH4+ của một số dòng vi khuẩn đã phân lập được 34

2.3 Phương pháp xử lý số liệu: 41

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

4.1 Kết quả phân lập và đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn 42

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 42

4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập 43

4.1.3 Hình dạng và khả năng di chuyển của 21 dòng vi khuẩn: 46

4.2 Khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn đã phân lập dựa trên lượng NH4+ (ammonium) tổng hợp được 49

được từ rễ 50

4.2.2 So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân 51

4.2.3 So sánh khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn phân lập được từ lá 52

4.2.4 So sánh khả năng cố định đạm của 6 dòng vi khuẩn triển vọng sống nội sinh trong cây Diếp cá 53

4.3 Khả năng tổng hợp indol-3-acetic acid (IAA) của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá 55

4.3.1 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ rễ 55

4.3.2 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ thân 56

4.3.3 So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập được từ lá 58

4.3.4 So sánh khả năng tổng hợp IAA của 8 dòng vi khuẩn triển vọng nội sinh trong cây Diếp cá 59

4.4 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn phân lập được 62

4.5 Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn được phân lập: 64

4.5.1 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Escherichia coli 64

4.5.2 Khả năng kháng khuẩn với vi khuẩn Aeromonas hydrophila 66

4.6 Kết quả nhận diện một số dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR 69

CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

5.1 Kết luận 72

5.2 Đề nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

Tiếng việt: 73

Tiếng Anh 75

Trang web: 84

PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA 21 DÒNG VI KHUẨN

PHỤ LỤC 2: ĐƯỜNG CHUẨN NH4+ CỦA 3 NGÀY ĐO

PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ THỐNG KÊ HÀM LƯỢNG NH4+ CỦA 21 DÒNG VI

PHỤ LỤC 8: KẾT QUẢ HÀM LƯỢNG IAA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN

PHỤ LỤC 9: ĐƯỜNG CHUẨN IAA CỦA 3 NGÀY ĐO

PHỤ LỤC 10: KẾT QUẢ THỐNG KÊ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP IAA

PHỤ LỤC 17 : KẾT QUẢ THỐNG KÊ KHẢ NĂNG KHÁNG VI KHUẨN A

HYDROPHILA CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP

CÁ

PHỤ LỤC 18: KẾT QUẢ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE CỦA CÁC DÒNG VI

KHUẨN ĐỊNH DANH

Trang

Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR 30

Bảng 2: Môi trường PDA 30

Bảng 3: Môi trường NFb (g/l) (Kirchhof et al., 1997) 30

Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng 31

Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin 31

Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999) 31

Bảng 7: Môi trường LB (Lauria Betani) … 31

Bảng 8: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA ….…….…44

Bảng 9: Đặc tính khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA.… …… 45

Bảng 10: Hình dạng, kích thước, khả năng chuyển động cùa các dòng vi khuẩn 48

Bảng 11: Kết quả nhuộm Gram của 21 dòng vi khuẩn……… …49

Bảng 12: Kết quả giải trình tự của một số dòng triển vọng ……….………… 70

Trang

Hình 1: Bản đồ hành chính tỉnh Cà Mau 3

Hình 2: Cây Diếp cá (Houttuynia cordata T) 5

Hình 3: Mối liên hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ phản ứng PCR 23

Hình4: Phản ứng màu của đường chuẩn NH4+ ……… ………….……… 36

Hình 5: Phản ứng màu của đường chuẩn IAA………… ……….38

Hình 6: Sự phát triển của vi khuẩn tạo vòng pellicle trong môi trường NFb bán đặc

.……… ……… …43

Hình 7: Hình ảnh một số khuẩn lạc phát triển trên môi trường PDA ………… ….47

Hình 8: hình ảnh nhuộm Gram của các dòng vi khuẩn phân lập… ………50

Hình 9: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ……… 51

Hình 10: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân.…….53

Hình 11: Hàm lượng trung bình NH4 + của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá …… 54

Hình12: Hàm lượng trung bình NH4+ của các dòng vi khuẩn triển vọng …….……55

Hình 13: Hàm lượng trung bình IAAcủa các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ ….… 57

Hình 14: Hàm lượng trung bình IAAcủa các dòng vi khuẩn phân lập từ thân … 59

Hình 15: Hàm lượng trung bình IAAcủa các dòng vi khuẩn phân lập từ lá… … 60

Hình 16: Hàm lượng trung bình IAAcủa các dòng vi khuẩn triển vọng… ……….61

Hình 17: Vòng sáng halo của các dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường NBRIP

đặc……….……….63

Hình18: Hiệu suất hòa tan lân (E) của các dòng vi khuẩn nội sinh qua các ngày… 64

Hình 19: Khả năng kháng khuẩn của dòng T6-DD1 và R1-DD2 với vi khuẩn E

Coli………66

Hình 20: Khả năng của các dòng vi khuẩn phân lập được với E Coli …….….… 66

Hình 21: Khả năng kháng khuẩn của dòng R1-DD2 và L1-DD2 trên Aeromonas hydrophila ……….…….………….… 67

Hình 22: Khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn phân lập được với vi khuẩn Aeromonas hydrophila……….…….……68

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

DMSO Dimethyl sulfoxide

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP deoxyribonucleotide triphosphates

ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long

ĐK Đường kính

EAC Ehrlich Ascites Carcinoma

EAEC Enteroaggregative E coli

EHEC Enterohemorrhagic E coli

EIEC Enteroinvasive E coli

EPEC Enteropacthogenic E coli

ETEC Enterotoxigenic E coli

IAA Indole – 3 – Acetic Acid

LB Luria - Bertani

MEWC Methanolic Wedelia chinensis

NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate

Nfb nitrogen-free semisolid malate

OD Optical Density

PCR Polymerase Chain Reaction

PDA Potato dextrose agar

rRNA ribosomal ribonucleic acid

VKNS Vi khuẩn nội sinh

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Trong thiên nhiên có rất nhiều cây có chất kháng sinh và nguồn dược liệu của Việt Nam thì vô cùng phong phú, theo số liệu thống kê gần đây ở nước ta có hơn 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật Hàng năm cả nước sử dụng hơn 50.000 tấn cây dược liệu (htt://duoclieu.net/caythuocvn.html ngày 19/06/2014), trong đó có nhiều cây thuốc có tính kháng khuẩn đã được y học dân gian sử dụng từ lâu Chúng thường là những cây cỏ quen thuộc, mọc hoang dại hay trồng ngay trong vườn nhà

So sánh với kháng sinh tổng hợp, có thể thấy các cây thuốc dược liệu có chất kháng sinh nhưng hiệu lực kháng khuẩn không mạnh bằng kháng sinh tổng hợp Tuy vậy chất kháng sinh từ cây dược liệu có những ưu điểm mà chất kháng sinh tổng hợp không có Một trong những vấn đề đó là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình trạng sử dụng chất kháng sinh bị lạm dụng, tuy nhiên chất kháng sinh có nguồn gốc từ thực vật thì các nhà khoa học chưa thấy điều này Kháng sinh từ thực vật rất bền vững và dễ hòa tan trong nước, nên có thể dung dưới dạng thuốc sắc là dạng bào chế đơn giản và thông dụng nhất Chính vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều đến kháng sinh thực vật và có xu hướng trở lại với cây thuốc hoặc sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên

Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất

(Wedelia chinensis M.), cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.), cây Diệp Hạ Châu (Phyllanthus urinaria L.)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng

khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyde và các dẫn xuất ceton như methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal Nhóm terpen bao gồm các chất α pinen,

camphen,… Có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus

aureus, Shigella, Salmonella, E coli (Đỗ Tất Lợi, 2004; Shu-Chen et al., 2008)

Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh ở cây dược liệu chưa được quan tâm nhiều Do đó việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay

1.2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và khảo sát được một số đặc tính tốt như tính kháng khuẩn, khả năng tổng hợp đạm, IAA và hòa tan lân của các dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Diếp

cá ở tỉnh Cà Mau

CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

3 nước như Thái Lan, Malaysia, Indonesia và là trung tâm vùng biển của thế giới ở Đông Nam Á

Diện tích tự nhiên của tỉnh Cà Mau là 5.329 km2 chiếm 15,3% diện tích cả nước, dân số trên 17 triệu người, đây là vùng giàu tiềm năng phát triển

Theo: http://www.mdec.vn/index.php?option=com_content&view=article&id=1160&Itemid=92 (truy cập 29/05/2014)

http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A0_Mau (truy cập 29/05/2104)

Hình 1: Bảng đồ tỉnh Cà Mau

(Nguồn:http://www.geology.hcmus.edu.vn/vietnamese/thuvien/map, ngày 17/06/2014)

2.1.2 Điều kiện tự nhiên:

Cà Mau là vùng đất thấp thường xuyên bị ngập nước, khí hậu của Cà Mau đặc trưng của khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với nền nhiệt độ cao vào loại trung bình trong các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, nhiệt độ trung bình hàng năm là 26,5oC

Cà Mau có hai mùa rõ rệt là mùa mưa và mùa khô, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô từ tháng 12 đến tháng 4 năm sau, lượng mưa trung bình là 165 ngày mưa/năm với 2.360 mml, độ ẩm trung bình hàng năm là 85,6%

Chế độ thủy triều ở khu vực tỉnh Cà Mau chịu tác động trực tiếp của chế độ bán nhật triều không đều ở biển Đông và chế độ bán nhật triều không đều ở biển Tây, biên

độ triều ở biển Đông tương đối lớn khoảng 300-350 cm vào các ngày triều cường

Chế độ thủy văn của hệ thống kênh rạch chịu ảnh hưởng của chế độ thủy triều quanh năm, Cà Mau có hệ thống kênh rạch dày đặc, tổng chiều dài của hệ thống kênh rạch lên tới 7000km chiếm 4% diện tích tự nhiên của tỉnh

Tài nguyên đất đai, Cà Mau có các nhóm đất chính sau:

Nhóm đất mặn có diện tích 208,496 ha chiếm 40% diện tích đất tự nhiên, đất mặn phân bố chủ yếu các huyện Đầm Dơi, U Minh, Trần Văn Thời, Tp Cà Mau, Cái Nước, Ngọc Hiển,Thới Bình Do đây là vùng đất mặn cùng với hiện tượng biển lấn nên các vùng bị nhiễm mặn chủ yếu là nuôi trồng thủy sản, một số vùng như U Minh, Trần Văn Thời có thể kết hợp một vụ lúa một vụ tôm khi mùa mưa tới

Đất phèn có diện tích 271,926 ha chiếm 52,18% đất tự nhiên, phân bố chủ yếu các huyện Thới Bình, U Minh, Trần Văn Thời

Nhóm đất phèn nhiễm mặn phân bố chủ yếu ở những vùng ven biển

Ngoài các loại đất trên còn có nhóm đất than bùn, với diện tích khoảng 8.000 ha phân bố U Minh, Trần Văn Thời và nhóm đất bãi bồi với diện tích 15.488 ha phân bố các huyện Ngọc Hiển và Cái Nước

Theo;http://www.chinhphu.vn/portal/page/portal/chinhphu/cactinhvathanhpho/tinhcamau/thongtintinhth anh?view=introduction&provinceId=1341 (truy cập 01/06/2014)

2.2 Tổng quan về cây Diếp cá

2.2.1 Tên gọi và phân loại

- Cây Diếp cá còn có tên là cây Giấp cá, Lá giấp, Ngư tinh thảo

- Tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb Saururaceae

- Tên tiếng Anh là heartleaf (lá hình tim) hay lizardtail (đuôi thằn lằn) (Võ Văn

- Chi Diếp Cá (Houttuynia Thunb.)

- Diếp Cá (Houttuynia cordata Thunb.) (Nguồn: Phạm Thành Hộ, 1999)



Hình 2: Diếp cá (Houttuynia cordata T)

(Hình chụp, ngày 07/06/2014)

Chi Houttuynia Thunb, chỉ có một vài loài diếp cá, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới châu Á, từ Nhật Bản, Trung Quốc đến Việt Nam, Lào, Ấn Độ và các nước Đông Nam Á khác Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở các tỉnh miền núi, trung du và đồng bằng Độ cao đến 1500 mét (Sa Pa) Cây còn trồng được nhiều nơi để làm rau và làm thuốc

Diếp cá thuộc loại ưa ẩm và hơi chịu bóng, thường mọc ở đất ẩm, cây sinh trưởng gần như quanh năm, mạnh nhất là mùa xuân hè, có hoa quả hàng năm trên những cây không bị ngắt ngọn và hái lá thường xuyên, có khả năng tái sinh mạnh từ thân rễ Ở vùng thị trấn Tam Đảo và núi Ngọc Linh, diếp cá mọc nhiều đến mức ảnh hưởng tới cây trồng

2.2.4 Thành phần hóa học:

Toàn thân cây Diếp cá có chứa tinh dầu Thành phần chủ yếu là: Nhóm aldehyl và các dẫn xuất ceton như methyl-n-nonyl ceton, 1-decanal, 1-dodecanal là những chất không có tác dụng kháng khuẩn, chất có tác dụng kháng khuẩn là 3-oxododecanal Nhóm terpen bao gồm các chất: α-pinen, camphen, myrcen limonene, linalool, bornyl, acetate, geraniol và caryophylen Ngoài ra tinh dầu còn chứa acid caprinic, laurinaldehyd, benzamid, acid hexadecanoic, acid decanoic, acid palmitic, acid linoleic, acid oleic, acid stearic, aldehyd capric, acid clorogenic, lipid và vitamin K

Từ lá diếp cá người ta đã phân lập được β – sitosterol, một alkaloid gọi là cordalin

và các flavonoid như afzelin, hyperin, rutin, isoquercitrin và quercitrin (Đỗ Tất Lợi, 2004)

2.2.5 Tác dụng dược lý:

Theo Zhang Y et al., (2008) Diếp cá có khả năng diệt được Gonococcus (gây bệnh lậu mủ) và ngăn cản sự phát triển của các siêu vi khuẩn cúm Còn theo Kim et al., (2010) cây Diếp cá còn có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn E Coli O157-H7

Hoạt chất quercitrin có trong diếp cá có tác dụng lợi tiểu mạnh Một số hoạt chất có tác dụng điều trị loét dạ dày được phân lập từ cây diếp cá Một chất sterol, tương tự

sitosterol phân lập từ thân rễ, kích thích tiết các chất kháng sinh từ một chủng Bacillus

tạo bào tử Gram dương

2.3 Tổng quan về vi khuẩn nội sinh:

Vi khuẩn nội sinh là vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trong cây trồng (Quispel, 1992) Chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật ký chủ, qua đó hình thành mối quan hệ giữa vi khuẩn nội sinh với thực vật khác nhau như cộng sinh, hội sinh…

Từ vùng rễ, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo 3 cách là: bám ở

bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên (lateral roots), thông qua lông hút,

giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống nội sinh như: Azotobacter, Bacillus,

Beijerinckia, Derxia, Enterobacteriaeae (Klebsiella, Enterobacter, Pantonae), Pseudomonas, Alcaligenes, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum Gluconacetobacter, và Paenibacillus (Elmerich, 2007)

Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí bị tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983).Sau khi xâm nhập vào cây chủ, các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị ví xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, đi vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel

et al., 2002) Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu

vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ; nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn

phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997; Tan et al.,

2003) Mặc dù vi khuẩn nội sinh tập trung hay tiếp cận các địa điểm mà chúng có khả năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật số tương đối thấp chỉ từ 1000 đến

100000 tế bào/gam mô thực vật (Hallmann, 2001), và chúng bắt buộc phải sinh sản một

số lượng lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật Hurek et al, (1994) cho rằng sự phân cắt hay sinh sản của vi khuẩn Azoarcus sp, được tìm thấy bên ngoài và bên

trong mô rễ lúa và cỏ Kallar

Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh cho cây chủ, mà trái lại chúng có thể thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích

thích sự sinh trưởng thực vật và sự cố định đạm từ không khí (Sturz et al., 2000), còn theo Kloepper et al (1989), các giống Azospirillum, Gluconacetobacter và

Pseudomonas là những vi khuẩn cố định đạm nhưng nhờ vào khả năng tổng hợp auxin

của chúng nên cũng được xem là là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng Hơn nữa,

một số dòng vi khuẩn nội sinh có thể cải thiện sự phát triển bệnh (Benhamou et al.,

1996) và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với sự tác động của các nhân tố vô

sinh và hữu sinh (Hallmann et al., 1997)

Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng động các chất hữu cơ,

và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh vật đất Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thu các chất dinh dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra (El-Shatnawi và Makhadmeh, 2001) Đặc tính quan trọng của các dịch rễ là có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Döbereiner, 1974) Ngược lại,

vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động

của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira

et al., 1983; Harari et al., 1988) Nhờ sự đa dạng của cây trồng và sự đa dạng của vùng

rễ nên các nhà khoa học đã khám phá được nhiều nhóm vi khuẩn nội sinh khác nhau từ các loại cây khác nhau

Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất

trong các cây còn non (Rovira et al., 1983) Azospirillum brasilense đã thúc đẩy sự phát triển lông rễ một cách mạnh mẽ và giảm sự kéo dài rễ ở Panicum miliaceum (Harari et al., 1988) Còn theo các nghiên cứu của Hiệp et al (2005) cho thấy khi sử dụng vi khuẩn Azospirillum lipoferum chủng cho cây bắp dài hơn cây đối chứng không

chủng vi khuẩn nhờ đó mà cây có thể hấp thu dưỡng chất trong đất tốt hơn, đồng thời có khả năng kháng hạn tốt hơn Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa giúp cây hấp thu nhiều

nitơ, lân, kali và sắt tăng từ 10 – 64% (Biswas et al., 2000) Chaintreuil et al (2000) đã phát hiện những vi khuẩn nốt rễ còn sống trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) ở vùng Châu Phi và chúng có nguồn gốc từ những cây điên điển (Sesbania sp.) mọc chen

lẫn với cây lúa hoang

Như vậy vi khuẩn nốt rễ không những nội sinh ở cây họ đậu mà còn xâm nhiễm vào cả cây hòa bản và cố định đạm sinh học cho cây

Trong các nhóm vi khuẩn nội sinh, các nhà khoa học chú ý đến hai đặc điểm: khả năng cố định đạm và khả năng chống lại bệnh hại, cả hai đặc điểm này có vai trò quan

trọng trong sản xuất nông nghiệp Rediers et al.(2003) xác định một vài gen trong vi khuẩn nội sinh cố định đạm Pseudomonas stutzeri A15 mà họ cho rằng có liên quan đến

việc quần tụ (colonization) của vi khuẩn chung quanh rễ lúa Ngoài việc vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, các nhà khoa học còn nhận thấy chúng cũng có khả năng

chống lại dịch hại, ví dụ vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả năng sản xuất độc tố có

thể giết chết ấu trùng của nhiều loại côn trùng

2.3.1 Một số nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp:

Hơn 300.000 loại thực vật được biết trên trái đất, mỗi loài có một hay nhiều loài

vi khuẩn nội sinh (Strobel et al., 2004) Tuy nhiên một số ít đươc nghiên cứu trước đây,

ngày nay các nhà khoa học đã phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn nội sinh trong cây trồng

và cây hoang dại, bao gồm những nhóm sau:

2.3.1.1 Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí

hoặc kỵ khí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động

bằng tiêm mao Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa, nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ, Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30oC -45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC

Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH=7, một số phù hợp với pH= 9-10 như Bacillus

alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH=2-6 như Bacillus acidocaldrius Bacillus có

khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, …

Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, …

Một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên:

 Bacillus subtilis

Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand

Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 Chúng được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân

bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô

Chúng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật Chúng

không sinh trưởng trên thực phẩm có tính acid ở điều kiện tối ưu Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì

Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các

vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis

Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 – 5) x 0,6 µm Chúng phát triển riêng rẻ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi Khuẩn lạc khô, không màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên

bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch

Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36°C –50°C, tối đa khoảng 60°C Là loại

ưa nhiệt cao Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao Bào tử hình bầu

dục, kích thước 0,6–0,9µm Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm Chúng phát tán rộng rãi Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200-300 năm

Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính

tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid

amin, subtilisin Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV) Đặc biệt, B

subtilisđược sử dụng trong lên men Natto của Nhật –một thực phẩm chức năng rất bổ dưỡng cho sức khỏe (Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà, 2007)

 Bacillus cereus

Đây là loại có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus

mycoides, Bacillus thuringiensis Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không

khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh

Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1 - 1,5) x (3 - 5)µm, có khi dài hơn, chúng

đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2 - 1,5)µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào (Lương Đức Phẩm, 2007) Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm (Nguyễn Lân Dũng, 1983)

Theo nghiên cứu của Swetha Sunkar và C Valli Nachiyar (2011) trên cây bứa

mủ vàng (Garcinia xanthochymus), Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các

chủng vi khuẩn E coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella

typhi và Klebsiella pneumonia

 Bacillus amyloliquefaciens

Bacillus amyloliquefaciens là một trực khuẩn gram dương có liên quan chặt chẽ

với các loài Bacillus subtilis Hai loài này có nhiều gen tương đồng và xuất hiện tương

tự nhau không thể phân biệt được chúng một cách trực quan (Friest et al., 1987)

Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn Gram dương, hình que, di động, kích

thước 0,7 - 0,9 x1,8 - 3m, nội bào tử (0,6 - 0,8 x 1 - 1,4m), là vi khuẩn hiếu khí hay

kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH = 7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng Nhiệt độ giới hạn 15-50oC, nhiệt độ tối ưu 30 - 40oC (http://www.tgw1916.net/Bacillus/ amyloliquefaciens.html, ngày 2/7/2014) Nó cũng tổng hợp protein barnase là một loại kháng sinh tự nhiên (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_amyloliquefaciens, ngày 2/7/2014)

B amyloliquefaciens FZB42 được coi là PGPR do kiểm soát sinh học và sản xuất

IAA thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Chen et al., 2007) Bacillus amyloliquefaciens được

tìm thấy để sản xuất hỗn hợp của acid lactic, isovaleric, isobutyric, acid acetic và cũng

được báo cáo là có khả năng hòa tan lân (Idriss et al., 2002) Sushil et al (2013) cho rằng dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sks_bnj_1 thúc đẩy sự tăng trưởng thực

vật và ảnh hưởng trên đất vùng rễ của đậu tương Mẫu phân lập được xác định dựa vào

trình tự gen 16S - rRNA cho thấy 98,7% tương đồng với dòng vi khuẩn Bacillus

amyloliquefaciens sks_bnj_1 (AY 932.823) chúng có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng

ở cây đậu tương như: sản xuất siderophore, indole -3- acetic acid, deaminase ACC, phosphatases, phytase, HCN, cellulase, hòa tan kẽm và đối kháng với các mầm bệnh

trong đất gây ra Nghiên cứu này cho thấy rằng dòng vi khuẩn B Amyloliquefaciens

sks_bnj_1 cải thiện hầu hết các thuộc tính vùng rễ, cây tăng trưởng, đồng hóa các chất dinh dưỡng và năng suất của đậu tương

 Bacillus polymyxa

Bacillus polymyxa là vi khuẩn Gram dương, có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi,

trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy Tế bào của Bacillus polymyxa

có kích thước (0,6 - 1) x (2 - 7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh (Nguyễn Lân Dũng, 1983) Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao

Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng 1,7 - 2,6 µm, nằm giữa tế bào Loại

vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccharide trong cây Chúng còn có khả năng cố định đạm Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm Môi trường kem và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược (http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus, ngày 2/8/2014)

3.2.1.3 Vi khuẩn Pseudomonas

Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường Sự biến dưỡng

dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác

nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật Trong số những loài Pseudomonas

này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học

Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử Các đặc điểm sinh lí là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen

Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin (IAA), cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh

dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens,

Pseudomonas syringae (Glickmann et al., 1998; Suzuki et al., 2003; Xie et al., 1996)

Khả năng phân giải phosphat Trong rác ủ, phospho tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác nhau Phospho được tích luỹ trong rác khi động thực vật chết đi, những hợp chất phospho hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất phospho vô cơ khó tan Do đó phospho tồn tại ở hai dạng: phospho hữu cơ và phospho vô cơ Vi sinh vật phân giải lân hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi: Bacillus và Pseudomonas Các loài có

khả năng phân giải mạnh là B megatherium, B mycoides và Pseudomonas sp

Trong số các loài Pseudomonas spp., P fluorescens là được chú ý nghiên cứu

hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004)

 Pseudomonas fluorescens

Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram âm, có đơn hoặc trùng

mao, sống hiếu khí bắt buộc nhưng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào Chúng có cơ chế trao đổi chất cực kỳ linh hoạt giúp chúng sống được cả trong đất và trong nước Nhiệt

độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25-30°C

Đến nay, người ta vẫn chưa biết được chính xác cơ chế kiểm soát sinh

học của Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết được đưa ra như sau: thứ nhất

người ta cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh sắt (Fe) Và cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn như các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide

Theo Sivamani et al., 1987 cho rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể được dùng như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây bệnh héo xanh và vi khuẩn Xanthomonas campestris

3.2.1.4 Vi khuẩn Azospirillum

Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có dạng hình que

ngắn, cong hoặc hình chữ S (như Azospirillum lipoferum) Đây là vi khuẩn có khả năng

tổng hợp IAA, khả năng cố định đạm, phân giải lân và một số chất dinh dưỡng khác Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn

và đã được Becking (1963) phát hiện lại Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về

sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau Sau

đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum (Tarrand

et al., 1978) Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và

được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980)

Trong những năm 1984 – 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống

Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca) (Reinhold et al., 1986)

Trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa

tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al., 2000), sản

xuất kích thích tố thực vật hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng

(Rangarajan et al., 2003)

3.2.1.5 Vi khuẩn Burkholderia

Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kính khoảng 1m, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu (Caballero-

Mellado et al., 2004) Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kị khí hoặc hiếu

khí, trong môi trường ít khí oxi thì phát triển tốt nhất Trong môi trường nuôi cấy, chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2-4 mm, tròn,

phẳng hoặc lài (Caballero -Mellado et al., 2004; 2007) Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu nhiệt đới (Mounlin et al., 2001) Vi

khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp,

mía, cà phê, lúa (Scarpella et al., 2003) Hiện nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia (Martinez - Aguilar et al., 2008) bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất,

rễ cây, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây (Coenye và VDNAamme, 2003;

Osullivan và Mahenthiralingam, 2005)

2.4 Một số vi khuẩn gây bệnh

2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli

 Sơ lược về E coli

E coli là trực khuẩn hình que ngắn, gram âm bắt màu hồng, kích thước dài hay

ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, trung bình 2 - 3μm x 0,5μm, hai đầu tròn, có lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành nha bào Trong bệnh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực hai đầu

E coli còn có tên gọi là Bacteriam coli commue được ông Escherich phát hiện

năm 1885 trong trường hợp tiêu chảy ở trẻ em

Theo P.J.Quinn (1994), E coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp

hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nước, ngoài tự nhiên Hầu hết chúng không gây hại cho người và động vật, giúp ổn định sinh lý đường ruột Tuy nhiên cho đến nay đã phát hiện được 5 dòng có khả năng gây hại cho người và động vật là:

EAEC (Enteroaggregative E coli), E coli kết tạp ở ruột

EHEC (Enterohemorrhagic E coli), E coli gây xuất huyết ở ruột

EPEC (Enteropacthogenic E coli), E coli gây bệnh đường ruột

ETEC (Enterotoxigenic E coli), E coli sinh độc tố ruột

EIEC (Enteroinvasive E coli), E coli xâm lấn niêm mạc ruột

 Đặc điểm, cơ chế gây bệnh và các triệu chứng:

Đặc điểm: Chúng tiết ra các độc tố tế bào, các dòng vi khuẩn này có một

plasmid có thể giúp chúng bám dính vào màng nhầy của ruột, gây tiêu chảy không có hoặc có máu và các hội chứng khác ở người

Cơ chế gây bệnh: Để gây bệnh trước hết vi khuẩn phải bám dính vào tế bào

nhung mao ruột bằng các nhân tố xâm nhập, vi khuẩn bám dính vào lớp tế bào biểu mô của thành ruột Ở đây, chúng phát triển và nhân lên làm phá hủy các lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột Đồng thời sinh sản độc tố đường ruột enterotoxin gồm yếu tố chịu nhiệt làm tăng tính thấm xuất của tế bào thành ruột và phá hủy tế bào, yếu tố không chịu nhiệt sẽ tác động vào quá trình trao đổi muối, nước làm rối loạn chu trình này Nước từ cơ thể chảy vào ống ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác động cơ học làm nhu động ruột đẩy nước và thức ăn gây nên hiện tượng tiêu chảy Sau khi đã phát triển ở thành ruột, chúng vào hệ bạch huyết, đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu, chúng nhanh chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu Từ hệ thống tuần hoàn chúng theo các vi quản đến các tổ chức, cơ quan, ở đây chúng lại phát triển nhân lên lần thứ hai Chúng phá hủy tế bào tổ chức gây viêm và sản sinh độc tố toxogenic và verotocin phá hủy tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết

Triệu chứng: Sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm E coli thì trong vòng 24 –

48h sẽ có các triệu chứng như đau bụng, đi ngoài phân lỏng từ 5 – 15 lần/ngày có lẫn

máu Trong phân, đôi khi có buồn nôn, nếu không được cấp cứu, xử trí kịp thời sẽ bị mất nước, điện giải, rối loạn thân nhiệt, hạ huyết áp và có thể tử vong

2.4.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila

 Sơ lược về A hydrophila

Vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, Aeromonas là vi khuẩn Gram

âm, di động, hình que, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, oxidase dương tính

 Trong giống Aeromonas có hai nhóm:

Nhóm 1: Aeromonas không di động (A salmonicida) thường gây bệnh ở

Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu hay

bệnh sởi… Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A hydrophila gây ra (Bergey, 1957)

 Một số nghiên cứu về A hydrophila

Groberg (1978) khi gây cảm nhiễm A hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận

tỷ lệ chết thường cao ở 20,50C và 170C, tỷ lệ chết thấp hơn ở 150C và 120C, còn ở 90C hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không chết (Roselynn and Stevenson, 1988)

Theo báo cáo của Rahman et al., (2000) thí nghiệm gây cảm nhiễm A hydrophila trên cá vàng (Carassius auratus) bằng 4 cách: tiêm ở bụng (mật độ vi khuẩn

3.104-3.108 CFU/ml), tiêm dưới da (8,5x104-8,5x108 CFU/ml), tiêm ở cơ (8x1048x108 CFU/ml), và ngâm vi khuẩn (4,6x104-4,6x108 CFU/ml), sau khi so sánh kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới da độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD50 là 106,4 CFU/ml

-Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) đã thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng A

hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 103 đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn

độc lực mạnh có giá trị LD50 lần lược là 3,68x106 CFU/ml, 2,64x106 đến 4,52x106CFU/ml và 1,96x106 đến 1,45x107 CFU/ml

2.5 Tình hình nghiên cứu cây Diếp cá trong và ngoài nước

2.5.2 Ngoài nước

Hiện nay thế giới đang nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật sống nội sinh trong cây dược liệu, đặc biệt các cây dược liệu sống ở các vùng nhiệt đới, như cây Diếp Cá, cây Sài Đất

(Wedelia chinensis M), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L)…

Gon et al., (2012) khi nghiên cứu công dụng của cây Diếp cá (Houttuynia cordata T.) cho biết dịch chiết của cây này có khả năng diệt khuẩn Salmonella Jee et al.,

(2010) cũng cho biết cây diếp cá có khả năng kháng khuẩn cũng nhờ kháng viêm Ngoài ra, các dịch chiết cây diếp cá còn có thể giúp gia tăng số lượng tế bào lympho

nhanh chóng giúp tăng tính miễn dịch của người (Busarawan et al., 2007)

Sheng Qin và Jie Li (2009) đã phân lập ra một số vi khuẩn mới như

Saccharopolyspora, Dietzia, Blastococcus, Dactylosporangium, Promicromonospora, Oerskovia, Actinocorallia, và Jiangella có khả năng kháng lại Candida albicans, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, trong cây dược liệu

trong rừng nhiệt đới Xishuangbanna ở Trung Quốc

Cleidson Valgas, et al (2006) Đã sang lọc các hoạt tính kháng khuẩn từ hợp chất tự

nhiên, tuy nhiên ông cũng cho rằng các vi sinh cũng tiết ra một số chất kháng lại vi sinh

vật, trong trường hợp này ông đề cập việc kháng lại Staphylococcus aureus ATCC

25923 và Escherichia coli ATCC 25922

Renato Fani et al., (1989) cho biết một số vi khuẩn nội sinh với các cây trồng như Lavandula officinalis, Echinacea purperea và Echinacea angustifolia có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn gây các bệnh như Cysitic Fibrosis (CF)

Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng E coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi và Klebsiella pneumonia

(Swetha Sunkar, C Valli Nachiyar, 2012)

Bacillus polymyxa nội sinh trên cây Arabidopsis thaliana có khả năng tổng hợp kháng sinh polymyxin kháng lại cả nấm và vi khuẩn (Salme Timmusk et al.,

Theo nghiên cứu của Artidtaya Bhoonobtong et al., (2012) trên cây Phyllodium

pulchellum, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt E coli, Pseudomonas aeruginosa

Theo Merina Paul Das et al., (2013) Dịch trích ethanol trong lá cây Sài đất (Wedelia calendulacea) có tác dụng kháng khuẩn đáng kể với bốn vi khuẩn gram dương (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Micrococcus

luteus) và bốn vi khuẩn gram âm (Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli) Xét nghiệm kháng nấm cũng đã

được thực hiện chống lại bốn loại nấm (Aspergillus niger, Aspergillus flavus,

Candida albicans, Alternaria alternata),… và tất cả các thử nghiệm trên đều cho kết

quả tốt…

2.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)

2.6.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn (Khuất Hữu Thanh, 2006):

- Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90-95oC, làm đứt các liên kết hydro của phân

tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau Đoạn DNA khuôn có các đoạn dài gồm nhiều nucleotide giống nhau, hoặc tỷ lệ G-C càng cao, có nhiệt độ biến tính (Tm) cao hơn Do vậy cần căn cứ đặc điểm của DNA khuôn để lựa chọn nhiệt độ biến tính phù hợp giai đoạn này kéo dài 1 phút đến 2 phút

- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55-65oC để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’theo nguyên lí Chargaff Giai đoạn này khoảng 30-60 giây

- Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70-72oC thích hợp với điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lí Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymer hóa (polymerization) Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA

Chu kỳ gồm ba bước này sẽ được lặp lại nhiều lần khoảng 25-40 (tùy vào ứng dụng chuyên biệt) Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72oC trong 5 phút, sau đó cho ngừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4oC

(tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí

Bửu, 2005)

Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kỳ trước được làm khuôn ở chu kỳ

Kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân Một phản ứng PCR thường thực hiện 20-40 chu kỳ, từ mỗi đoạn DNA khuôn có thể tạo nên 220-240 bản sao DNA Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng, lượng mồi và dNTP tự do giảm, enzyme DNA polymerase hoạt động yếu dần,… do đó cần tính toán hàm lượng mồi dNTP, enzyme để đảm bảo phản ứng PCR có kết quả tốt nhất

2.6.2 Mồi (primer) sử dụng trong kỹ thuật PCR

Primer là các đoạn oligonucleotide ngắn khoảng 14-15 nucleotide, có vai trò quyết định thành công của phản ứng PCR Một cặp mồi trong PCR gồm có mồi xuôi F

và mồi ngược R

- Mồi xuôi (sense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’→ 3’

- Mồi ngược (antisense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’→ 5’ Điều kiện chủ yếu của bảo đảm hiệu quả mồi là:

- Mồi không quá ngắn (nhỏ hơn 8 nucleotide) hoặc quá dài (lớn hơn 50 nucleotide), mồi quá ngắn kết quả PCR không chính xác, mồi quá dài khó đảm bảo thành công của phản ứng PCR Khi thiết kế mồi, nên để dư 1-3 nucleotide ở đầu 5’ của mồi, giúp cho đoạn DNA được nhân lên có trình tự nguyên vẹn

- Trình tự của mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ có thể bắt cặp với đầu 3’ của mạch khuôn Các mồi không được bắt cặp với nhau, hoặc bắt cặp ở giữa mạch khuôn

- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi không được chênh lệch nhau quá lớn

Hình 3: Mối liên hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ phản ứng PCR

(Nguồn

http://voer.edu.vn/m/cac-phuong-phap-xac-dinh-su-hien-dien-va-bieu-hien-cua-gen-ngoai-lai/952c041b ngày 22/06/2014)

Khoảng cách tiến hóa giữa hai loài có thể đo được bằng sự khác biệt trong nucleotide hay acid amin của phân tử tương đồng từ hai loài bởi vì số lượng khác biệt trong chuỗi (sequence) trong một phân tử là một tỉ số không đổi cố định trong mã di truyền ở DNA Chọn rRNA (Ribosomal RNAs) 16S hay 16S-23S để phân loại và xác định sự tiến hóa vì:

- Nó tham gia trong quá trình tổng hợp protein nên RNA của ribosome được chọn

để nghiên cứu mối liên hệ tiến hóa trong sinh vật

- RNA của ribosome là những phân tử cổ điển, chức năng cố định, đồng nhất và đặc trưng cho các loài

- Kích thước của nó vừa phải, thuận lợi cho việc xếp hàng (align) để so sánh các chuỗi

Bản chất ổn định của các chuỗi rRNA cũng dẫn đến sự phát triển các mẫu dò DNA, để nhận diện chi vi khuẩn Các mẫu dò này được sử dụng để hình dung các thành phần chuyên biệt trong bộ gen DNA vi khuẩn cắt giới hạn, được tách riêng ra bởi điện

di Kết quả khuôn giới hạn gen rRNA được sử dụng cho sự khác nhau của các loài và các dòng bên dưới chi sinh ra, như một công cụ cho sự nhận diện vi khuẩn với biên độ rộng

Trong mỗi ribosome có 3 phân tử RNA với loài sơ hạch có 5S, 16S và 23S trong

đó 16S có khoảng 1500 nucleotide và 23S có khoảng 2900 nucleotide 5S chứa khoảng

120 nucleotide (quá nhỏ) nên ít được nghiên cứu, 16S và 23S được nghiên cứu nhiều hơn, ở loài chân hạch dùng 18S để nghiên cứu

Chuỗi trình tự 16S rRNA được sử dụng như là một công cụ mạnh mẽ để đánh giá

sự đa dạng di truyền của các vi khuẩn ở các mẫu môi trường (Barker et al., 2003)

2.6.3 Điện di gel agarose

2.6.3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật điện di

Dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic Các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên dưới sự tác động của một điện trường sẽ di chuyển về cực dương của điện trường (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

Sau phản ứng PCR, các DNA của vi khuẩn được nhuộm với Ethidium bromide (EtBr) Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác

dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang Tiến hành điện di sản phẩm trên gel agarose

và quan sát kết quả dưới tia UV có bước sóng 260nm

Thang DNA (DNA ladder): “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” dùng để ước lượng kích thước các trình tự acid nucleic trong gel agarose, đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002)

2.6.3.2 Các kỹ thuật điện di chủ yếu

a Điện di trên gel agarose

Điện di trên gel agarose là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA sử dụng Agarose từ 0,3-2,0% làm bản gel, tùy theo kích thước của DNA Nếu kích thước đoạn DNA nhỏ dưới 1kb, hàm lượng agarose sử dụng 1-2%, trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng hàm lượng Agarose khoảng 0,7-0,8%

b Điện di trên gel polyacrylamide

Điện di trên gel polyacrylamide là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA hoặc protein, sử dụng bản polyacrylamide với nồng độ khoảng 3,5-20% làm bản gel, tùy theo kích thước đoạn DNA hoặc trọng lượng phân tử protein Đoạn gel có kích thước càng nhỏ, protein có khối lượng phân tử nhỏ thì hàm lượng polyacrylamide sử dụng càng lớn,

và ngược lại

c Phương pháp giải trình tự DNA

 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy

Nguyên tắc cơ bản là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide không có nhóm 3’-

OH phản ứng tổng hợp bị ngừng lại Kết quả tạo ra các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide

Thực hiện bốn phản ứng trong 4 ống Eppendorf, mỗi ống có chứa DNA, mồi, bốn loại dNTP có một loại được đánh dấu phóng xạ (S35 – dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzyme và các điều kiện thích hợp Ống A thêm 1% ddATP, ống G thêm 1% ddTTP, ống C thêm 1% ddCTP, ống T thêm 1% ddTTP Sau khi khuếch đại DNA qua PCR khoảng 25-35 chu kỳ, điện di kết quả thu được trên gel polyacrylamide Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được

các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình tự các nucleotide mạch đơn, có thể biết trình tự các nucleotide trong gen

Tùy theo mục đích giữ mẫu, có thể sử dụng đồng vị phóng xạ S35 hoặc P32 đánh dấu phóng xạ đoạn mạch khuôn Sử dụng S35 thời gian mất hoạt tính khoảng 3 tháng, còn P32 khoảng 14 ngày (Khuất Hữu Thanh, 2006)

2.6.4 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã

Trong những năm gần đây lượng thông tin liên quan đến trình tự DNA được xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lý dưới dạng ngân hàng dữ liệu (EMBL

ở Châu Âu, GenBank ở Mỹ), có thể dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thông tin trên internet

BLAST là một trong những chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học BLAST cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein xem đoạn mà ta quan tâm có tương cận với đoạn của sinh vật nào trong ngân hàng gen không, khi được cung cấp một thư viện hay dữ liệu các chuỗi đó Để chạy BLAST cần đầu tư hai chuỗi: chuỗi đích và cơ sở dữ liệu chuỗi Chuỗi đích nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu

Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N, TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide-Nucleotide BLAST) cho phép so sánh cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu (Ken, 2002)

CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Thời gian – Địa điểm thực hiện

Thời gian: Tháng 6/2014 – 11/ 2014

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Phòng Thí nghiệm Sinh hóa, Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.2 Vật liệu

Toàn bộ rễ, thân, lá của cây Diếp cá trồng ở một số huyện thuộc tỉnh Cà Mau

Chủng vi khuẩn E coli được cung cấp từ phòng thí nghiệm Sinh học phân tử -

Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học– Trường Đại học Cần Thơ

Chủng vi khuẩn A hydrophila được cung cấp từ bộ môn Bệnh học thủy

sản –Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ

- Kẹp, kim cấy, que trãi mẫu, đèn cồn

- Lame, Lammelle – Duhan group (Đức)

- Máy Vortex

- Tủ cấy vi sinh vật – Biosafe II – ESCO (Singapore)

- Tủ ủ vi sinh vật – Binder (Đức)

- Máy lắc mẫu – GFL3005 (Đức)

- Kính hiển vi – Meji (Nhật); Trắc vi thị kính – Olympus (Nhật)

- Nồi khử trùng nhiệt ướt – Pbinternational (Đức)

- Cân điện tử - Startorius (Đức)

3.1.4.2 Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn

- Crystal violet, iod

3.1.4.5 Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh

Bảng 2: Môi trường PDA (Harold Eddleman., 1998)