2.6.3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật điện di
Dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic. Các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên dưới sự tác động của một điện trường sẽ di chuyển về cực dương của điện trường (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Sau phản ứng PCR, các DNA của vi khuẩn được nhuộm với Ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác
dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Tiến hành điện di sản phẩm trên gel agarose và quan sát kết quả dưới tia UV có bước sóng 260nm.
Thang DNA (DNA ladder): “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” dùng để ước lượng kích thước các trình tự acid nucleic trong gel agarose, đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
2.6.3.2 Các kỹ thuật điện di chủ yếu a. Điện di trên gel agarose
Điện di trên gel agarose là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA sử dụng Agarose từ 0,3-2,0% làm bản gel, tùy theo kích thước của DNA. Nếu kích thước đoạn DNA nhỏ dưới 1kb, hàm lượng agarose sử dụng 1-2%, trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng hàm lượng Agarose khoảng 0,7-0,8%.
b. Điện di trên gel polyacrylamide
Điện di trên gel polyacrylamide là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA hoặc protein, sử dụng bản polyacrylamide với nồng độ khoảng 3,5-20% làm bản gel, tùy theo kích thước đoạn DNA hoặc trọng lượng phân tử protein. Đoạn gel có kích thước càng nhỏ, protein có khối lượng phân tử nhỏ thì hàm lượng polyacrylamide sử dụng càng lớn, và ngược lại.
c. Phương pháp giải trình tự DNA
Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy
Nguyên tắc cơ bản là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide không có nhóm 3’- OH phản ứng tổng hợp bị ngừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide.
Thực hiện bốn phản ứng trong 4 ống Eppendorf, mỗi ống có chứa DNA, mồi, bốn loại dNTP có một loại được đánh dấu phóng xạ (S35 – dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzyme và các điều kiện thích hợp. Ống A thêm 1% ddATP, ống G thêm 1% ddTTP, ống C thêm 1% ddCTP, ống T thêm 1% ddTTP. Sau khi khuếch đại DNA qua PCR khoảng 25-35 chu kỳ, điện di kết quả thu được trên gel polyacrylamide. Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được
các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình tự các nucleotide mạch đơn, có thể biết trình tự các nucleotide trong gen.
Tùy theo mục đích giữ mẫu, có thể sử dụng đồng vị phóng xạ S35 hoặc P32 đánh dấu phóng xạ đoạn mạch khuôn. Sử dụng S35 thời gian mất hoạt tính khoảng 3 tháng, còn P32 khoảng 14 ngày (Khuất Hữu Thanh, 2006).