2.6.1 Nguyên lý chung của kỹ thuật PCR
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn (Khuất Hữu Thanh, 2006):
- Giai đoạn biến tính: ở nhiệt độ cao 90-95oC, làm đứt các liên kết hydro của phân tử DNA, hai mạch phân tử DNA tách rời nhau. Đoạn DNA khuôn có các đoạn dài gồm nhiều nucleotide giống nhau, hoặc tỷ lệ G-C càng cao, có nhiệt độ biến tính (Tm) cao hơn. Do vậy cần căn cứ đặc điểm của DNA khuôn để lựa chọn nhiệt độ biến tính phù hợp. giai đoạn này kéo dài 1 phút đến 2 phút.
- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55-65oC để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’theo nguyên lí Chargaff. Giai đoạn này khoảng 30-60 giây. - Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ 70-72oC thích hợp với điều kiện hoạt động của enzyme DNA polymerase. Enzyme DNA polymerase xúc tác hoạt động tổng hợp gắn thêm các nucleotide vào cuối đoạn mồi, các đoạn mồi được kéo dài trên cơ sở bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lí Chargaff, tạo nên các mạch đơn DNA mới, giai đoạn này còn gọi là giai đoạn polymer hóa (polymerization). Thời gian giai đoạn này từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA.
Chu kỳ gồm ba bước này sẽ được lặp lại nhiều lần khoảng 25-40 (tùy vào ứng dụng chuyên biệt). Cuối cùng được kết thúc bằng một “extension” ở 72oC trong 5 phút, sau đó cho ngừng hẳn bằng cách tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 4oC
(tùy thuộc vào loại máy Thermal cycler được sử dụng) (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí
Một phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ liên tục, sản phẩm tạo ra ở chu kỳ trước được làm khuôn ở chu kỳ Kế tiếp, nên số lượng bản sao tạo thành tăng theo cấp số nhân. Một phản ứng PCR thường thực hiện 20-40 chu kỳ, từ mỗi đoạn DNA khuôn có thể tạo nên 220-240 bản sao DNA. Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, cần lưu ý ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng, lượng mồi và dNTP tự do giảm, enzyme DNA polymerase hoạt động yếu dần,… do đó cần tính toán hàm lượng mồi dNTP, enzyme để đảm bảo phản ứng PCR có kết quả tốt nhất.
2.6.2 Mồi (primer) sử dụng trong kỹ thuật PCR
Primer là các đoạn oligonucleotide ngắn khoảng 14-15 nucleotide, có vai trò quyết định thành công của phản ứng PCR. Một cặp mồi trong PCR gồm có mồi xuôi F và mồi ngược R.
- Mồi xuôi (sense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’→ 3’ - Mồi ngược (antisense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’→ 5’.
Điều kiện chủ yếu của bảo đảm hiệu quả mồi là:
- Mồi không quá ngắn (nhỏ hơn 8 nucleotide) hoặc quá dài (lớn hơn 50 nucleotide), mồi quá ngắn kết quả PCR không chính xác, mồi quá dài khó đảm bảo thành công của phản ứng PCR. Khi thiết kế mồi, nên để dư 1-3 nucleotide ở đầu 5’ của mồi, giúp cho đoạn DNA được nhân lên có trình tự nguyên vẹn.
- Trình tự của mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ có thể bắt cặp với đầu 3’ của mạch khuôn. Các mồi không được bắt cặp với nhau, hoặc bắt cặp ở giữa mạch khuôn.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi không được chênh lệch nhau quá lớn.
Hình 3: Mối liên hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ phản ứng PCR
(Nguồn http://voer.edu.vn/m/cac-phuong-phap-xac-dinh-su-hien-dien-va-bieu-hien-cua-gen-ngoai-
Khoảng cách tiến hóa giữa hai loài có thể đo được bằng sự khác biệt trong nucleotide hay acid amin của phân tử tương đồng từ hai loài bởi vì số lượng khác biệt trong chuỗi (sequence) trong một phân tử là một tỉ số không đổi cố định trong mã di truyền ở DNA. Chọn rRNA (Ribosomal RNAs) 16S hay 16S-23S để phân loại và xác định sự tiến hóa vì:
- Nó tham gia trong quá trình tổng hợp protein nên RNA của ribosome được chọn để nghiên cứu mối liên hệ tiến hóa trong sinh vật.
- RNA của ribosome là những phân tử cổ điển, chức năng cố định, đồng nhất và đặc trưng cho các loài.
- Kích thước của nó vừa phải, thuận lợi cho việc xếp hàng (align) để so sánh các chuỗi.
Bản chất ổn định của các chuỗi rRNA cũng dẫn đến sự phát triển các mẫu dò DNA, để nhận diện chi vi khuẩn. Các mẫu dò này được sử dụng để hình dung các thành phần chuyên biệt trong bộ gen DNA vi khuẩn cắt giới hạn, được tách riêng ra bởi điện di. Kết quả khuôn giới hạn gen rRNA được sử dụng cho sự khác nhau của các loài và các dòng bên dưới chi sinh ra, như một công cụ cho sự nhận diện vi khuẩn với biên độ rộng.
Trong mỗi ribosome có 3 phân tử RNA với loài sơ hạch có 5S, 16S và 23S trong đó 16S có khoảng 1500 nucleotide và 23S có khoảng 2900 nucleotide. 5S chứa khoảng 120 nucleotide (quá nhỏ) nên ít được nghiên cứu, 16S và 23S được nghiên cứu nhiều hơn, ở loài chân hạch dùng 18S để nghiên cứu.
Chuỗi trình tự 16S rRNA được sử dụng như là một công cụ mạnh mẽ để đánh giá
sự đa dạng di truyền của các vi khuẩn ở các mẫu môi trường (Barker et al., 2003).
2.6.3 Điện di gel agarose
2.6.3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật điện di
Dựa vào đặc tính cấu trúc của các acid nucleic. Các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên dưới sự tác động của một điện trường sẽ di chuyển về cực dương của điện trường (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Sau phản ứng PCR, các DNA của vi khuẩn được nhuộm với Ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của acid nucleic và dưới tác
dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Tiến hành điện di sản phẩm trên gel agarose và quan sát kết quả dưới tia UV có bước sóng 260nm.
Thang DNA (DNA ladder): “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” dùng để ước lượng kích thước các trình tự acid nucleic trong gel agarose, đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
2.6.3.2 Các kỹ thuật điện di chủ yếu a. Điện di trên gel agarose
Điện di trên gel agarose là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA sử dụng Agarose từ 0,3-2,0% làm bản gel, tùy theo kích thước của DNA. Nếu kích thước đoạn DNA nhỏ dưới 1kb, hàm lượng agarose sử dụng 1-2%, trong các phòng thí nghiệm thường sử dụng hàm lượng Agarose khoảng 0,7-0,8%.
b. Điện di trên gel polyacrylamide
Điện di trên gel polyacrylamide là kỹ thuật điện di để kiểm tra DNA hoặc protein, sử dụng bản polyacrylamide với nồng độ khoảng 3,5-20% làm bản gel, tùy theo kích thước đoạn DNA hoặc trọng lượng phân tử protein. Đoạn gel có kích thước càng nhỏ, protein có khối lượng phân tử nhỏ thì hàm lượng polyacrylamide sử dụng càng lớn, và ngược lại.
c. Phương pháp giải trình tự DNA
Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy
Nguyên tắc cơ bản là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotide không có nhóm 3’- OH phản ứng tổng hợp bị ngừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn oligonucleotide dài ngắn khác nhau một nucleotide.
Thực hiện bốn phản ứng trong 4 ống Eppendorf, mỗi ống có chứa DNA, mồi, bốn loại dNTP có một loại được đánh dấu phóng xạ (S35 – dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzyme và các điều kiện thích hợp. Ống A thêm 1% ddATP, ống G thêm 1% ddTTP, ống C thêm 1% ddCTP, ống T thêm 1% ddTTP. Sau khi khuếch đại DNA qua PCR khoảng 25-35 chu kỳ, điện di kết quả thu được trên gel polyacrylamide. Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được
các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình tự các nucleotide mạch đơn, có thể biết trình tự các nucleotide trong gen.
Tùy theo mục đích giữ mẫu, có thể sử dụng đồng vị phóng xạ S35 hoặc P32 đánh dấu phóng xạ đoạn mạch khuôn. Sử dụng S35 thời gian mất hoạt tính khoảng 3 tháng, còn P32 khoảng 14 ngày (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.6.4 Phần mềm phân tích trình tự DNA được giải mã
Trong những năm gần đây lượng thông tin liên quan đến trình tự DNA được xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã được quản lý dưới dạng ngân hàng dữ liệu (EMBL ở Châu Âu, GenBank ở Mỹ), có thể dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thông tin trên internet.
BLAST là một trong những chương trình được sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học. BLAST cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein xem đoạn mà ta quan tâm có tương cận với đoạn của sinh vật nào trong ngân hàng gen không, khi được cung cấp một thư viện hay dữ liệu các chuỗi đó. Để chạy BLAST cần đầu tư hai chuỗi: chuỗi đích và cơ sở dữ liệu chuỗi. Chuỗi đích nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu.
Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N, TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotide-Nucleotide BLAST) cho phép so sánh cấu trúc chuỗi nucleotide trong ngân hàng dữ liệu (Ken, 2002).
CHƯƠNG III
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian – Địa điểm thực hiện Thời gian: Tháng 6/2014 – 11/ 2014 Thời gian: Tháng 6/2014 – 11/ 2014
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Phòng Thí nghiệm Sinh hóa, Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2. Vật liệu
Toàn bộ rễ, thân, lá của cây Diếp cá trồng ở một số huyện thuộc tỉnh Cà Mau
Chủng vi khuẩn E. coli được cung cấp từ phòng thí nghiệm Sinh học phân tử -
Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học– Trường Đại học Cần Thơ.
Chủng vi khuẩn A. hydrophila được cung cấp từ bộ môn Bệnh học thủy
sản –Khoa Thủy sản – Trường Đại học Cần Thơ. 3.1.3. Dụng cụ - Thiết bị
- Đĩa petri, ống nghiệm. - Cối, chày.
- Eppendorf 2.0 ml, Eppendorf 1.5ml. - Ống đong 10ml, 100ml.
- Cốc thủy tinh 10ml, 100ml, 200ml. - Kẹp, kim cấy, que trãi mẫu, đèn cồn. - Lame, Lammelle – Duhan group (Đức). - Máy Vortex.
- Tủ cấy vi sinh vật – Biosafe II – ESCO (Singapore). - Tủ ủ vi sinh vật – Binder (Đức).
- Máy lắc mẫu – GFL3005 (Đức).
- Kính hiển vi – Meji (Nhật); Trắc vi thị kính – Olympus (Nhật). - Nồi khử trùng nhiệt ướt – Pbinternational (Đức).
- Cân điện tử - Startorius (Đức). - pH kế - Hanna (Mỹ).
3.1.4. Hóa chất
3.1.4.1.Hóa chất dung để xử lý mẫu - Cồn 70%.
- H2O2 3%.
- Nước cất vô trùng.
3.1.4.2.Hóa chất nhuộm Gram vi khuẩn - Crystal violet, iod.
- Fushin, ethanol 70%. - Nước cất vô trùng. 3.1.4.3.Hóa chất trích DNA - Ethanol 70%. - Môi trường LB. - Proteinase K. - Isopropanol. - Cloroform/Isoamyalchohol (24:1). - SDS. - 10% CTAB/0.7M NaCl. - Dung dịch TE pH 8. 3.1.4.4.Hóa chất thực hiện phản ứng PCR - Nước cất 2 lần đã khử trùng. - PCR buffer. - dNTPs ( dATP, dTTP, dGTP, dCTP). - Taq polymerase. - DNA vi khuẩn.
- Để nhận diện vi khuẩn nội sinh sống trong cây, sử dụng các đoạn mồi 16S rRNA (Lane,1991) được thiết kế với trình tự sau:
27F: 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC - 3’ 1492R: 5’ – TACGGTTACCTTGTTACGACT – 3’ Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng). (bảng 1) Bảng 1: Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (μl) Nước cất 2 lần 11,75 Buffer 10X 2,5 MgCl2 2,0 Mồi xuôi 27F 0,25 Mồi ngược 1492R 0,25 dNTPs 4,0
Taq polymerase (5U/μl) 0,25
DMSO 0,5
DNA vi khuẩn 2,0
Tổng thể tích 25
Ghi chú: thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng)
3.1.4.5.Môi trường phân lập vi khuẩn nội sinh Bảng 2: Môi trường PDA (Harold Eddleman., 1998)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Khoai tây 200
Dextrose 20
Agar 20
pH 6,5 ± 0,2
3.1.4.6. Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+
Bảng 3: Môi trường NFb (Kirchhof et al., 1997)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Acid malic 5 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 NaCl 0,1 CaCl2 0,02 KOH 4,5 Dung dịch vi lượng 2ml Dung dịch Vitamine 1ml Dung dịch FeEDTA 1,64% 4ml
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2ml
pH 6,8
Ghi chú: đối với môi trường bán đặc, bổ sung thêm 2g agar.
Bảng 4: Thành phần dung dịch vi lượng
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Na2MoO4.2H2O 1
MnSO4.H2O 1,5
H2BO3 1,4
CuSO4 0,4
ZnSO4.7H2O 0,12
Bảng 5: Thành phần dung dịch Vitamin
Hóa chất Liều lượng (mg/l)
Biotin 10
Pyridyoxyl – HCl 20
Thêm nước cất vào cho đủ 100ml
3.1.4.7.Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân Bảng 6: Môi trường NBRIP đặc (Nautiyal, 1999)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Glucose 10 MgSO4.7H2O 0,25 Ca3(PO4)2 5 MgCl2.6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 0,1
Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 3ml
Agar 20
pH 7,2
3.1.4.8.Môi trường khảo sát khả năng kháng khuẩn Bảng 7: Môi trường LB (Lauria Betani)
Hóa chất Liều lượng (g/l)
Tryptone 10,0
Yeast extract 5,0
NaCl 10,0
Agar 20,0
3.1.4 Phương pháp nghiên cứu 3.1.5. Thu thập và xử lý mẫu
Thu thập
Bốn mẫu Diếp cá được thu từ các vùng đất các huyện ở tỉnh Cà Mau, trong đó 3 mẫu lấy từ huyện Đầm Dơi, 1 mẫu lấy từ thành phố Cà Mau.
Dùng dao đào đất xung quanh cây Diếp cá để có thể thu được toàn bộ cây Diếp cá. Sau đó cho vào bọc nylon và mang về phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật để tiến hành xử lý mẫu và phân lập. Chú ý khi lấy mẫu xa nên bảo quản mẫu ở nhiệt độ lạnh tránh làm héo lá.
Xử lý mẫu
Tách phần đất bám xung quanh rễ. Ngâm phần đất vừa tách vào nước để dễ tách rễ ra
Cân 20 g mẫu đất quanh vùng rễ, hòa tan với 80 ml nước cất, để lắng cặn rồi đo pH, ghi nhận giá trị pH đo được.
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá dưới vòi nước chảy. Tách rời rễ, thân và lá cây Diếp cá (để ráo tự nhiên, để riêng từng bộ phận trong bọc nylon buộc chặt và bảo quản trong tủ lạnh (5°C) nếu chưa phân lập ngay).
Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm rồi làm khô chúng bằng giấy hút ẩm.
Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% (trong 30 giây), dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy trải lên môi trường PDA để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có khuẩn lạc phát triển thì cần phải xử lý khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật có trong đất.
3.1.6. Phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá
Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem giã nhuyễn trong cối đã khử trùng, sau đó cho thêm 1ml nước cất vô trùng vào mẫu và trộn đều.
Hút 100µl phần dịch trong cho vào 900µl nước cất đã chuẩn bị sẵn trong Eppendorf (đã được pha loãng 10 lần), đem vortex. Tiến hành pha loãng mẫu 100 lần,…
Mỗi bộ phận của cây, gồm có 3 tuýp ở độ pha loãng 100,101 va 102. Sau đó đem ly tâm lạnh ở 80C trong 5 phút.
Hút 200µl dung dịch mẫu gốc cho vào ống nghiệm chứa môi trường NFb bán đặc, đậy nắp lại rồi dùng tay se mạnh ống nghiệm cho phần dịch trích mẫu trộn đều xuống đáy ống nghiệm, đậy nắp ống nghiệm hơi lỏng, đem ủ ở 30°C để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 2 - 3 ngày ủ, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một vòng màu trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 2 - 6mm, hút 30µl dung dịch từ vòng pellicle cấy trải sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 300C để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Sau 1-2 ngày, chọn những khuẩn lạc rời, nhỏ, có kích thước, màu sắc, hình dạng