Primer là các đoạn oligonucleotide ngắn khoảng 14-15 nucleotide, có vai trò quyết định thành công của phản ứng PCR. Một cặp mồi trong PCR gồm có mồi xuôi F và mồi ngược R.
- Mồi xuôi (sense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’→ 3’ - Mồi ngược (antisense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’→ 5’.
Điều kiện chủ yếu của bảo đảm hiệu quả mồi là:
- Mồi không quá ngắn (nhỏ hơn 8 nucleotide) hoặc quá dài (lớn hơn 50 nucleotide), mồi quá ngắn kết quả PCR không chính xác, mồi quá dài khó đảm bảo thành công của phản ứng PCR. Khi thiết kế mồi, nên để dư 1-3 nucleotide ở đầu 5’ của mồi, giúp cho đoạn DNA được nhân lên có trình tự nguyên vẹn.
- Trình tự của mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ có thể bắt cặp với đầu 3’ của mạch khuôn. Các mồi không được bắt cặp với nhau, hoặc bắt cặp ở giữa mạch khuôn.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi không được chênh lệch nhau quá lớn.
Hình 3: Mối liên hệ giữa thời gian và nhiệt độ trong một chu kỳ phản ứng PCR
(Nguồn http://voer.edu.vn/m/cac-phuong-phap-xac-dinh-su-hien-dien-va-bieu-hien-cua-gen-ngoai-
Khoảng cách tiến hóa giữa hai loài có thể đo được bằng sự khác biệt trong nucleotide hay acid amin của phân tử tương đồng từ hai loài bởi vì số lượng khác biệt trong chuỗi (sequence) trong một phân tử là một tỉ số không đổi cố định trong mã di truyền ở DNA. Chọn rRNA (Ribosomal RNAs) 16S hay 16S-23S để phân loại và xác định sự tiến hóa vì:
- Nó tham gia trong quá trình tổng hợp protein nên RNA của ribosome được chọn để nghiên cứu mối liên hệ tiến hóa trong sinh vật.
- RNA của ribosome là những phân tử cổ điển, chức năng cố định, đồng nhất và đặc trưng cho các loài.
- Kích thước của nó vừa phải, thuận lợi cho việc xếp hàng (align) để so sánh các chuỗi.
Bản chất ổn định của các chuỗi rRNA cũng dẫn đến sự phát triển các mẫu dò DNA, để nhận diện chi vi khuẩn. Các mẫu dò này được sử dụng để hình dung các thành phần chuyên biệt trong bộ gen DNA vi khuẩn cắt giới hạn, được tách riêng ra bởi điện di. Kết quả khuôn giới hạn gen rRNA được sử dụng cho sự khác nhau của các loài và các dòng bên dưới chi sinh ra, như một công cụ cho sự nhận diện vi khuẩn với biên độ rộng.
Trong mỗi ribosome có 3 phân tử RNA với loài sơ hạch có 5S, 16S và 23S trong đó 16S có khoảng 1500 nucleotide và 23S có khoảng 2900 nucleotide. 5S chứa khoảng 120 nucleotide (quá nhỏ) nên ít được nghiên cứu, 16S và 23S được nghiên cứu nhiều hơn, ở loài chân hạch dùng 18S để nghiên cứu.
Chuỗi trình tự 16S rRNA được sử dụng như là một công cụ mạnh mẽ để đánh giá
sự đa dạng di truyền của các vi khuẩn ở các mẫu môi trường (Barker et al., 2003).