Sau khi tiến hành sát khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân khó tan và khả năng kháng khuẩn của 21 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được từ cây Diếp cá, chọn 3 dòng vi khuẩn triển vọng đó là dòng R1-DD2, dòng L1-DD1 và dòng T6-DD1
(có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân khó tan, kháng được vi khuẩn E.
coli và A. hydrophila) thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1492R. Phổ điện di
trên gel agarose cho thấy cả 3 dòng vi khuẩn đều có băng (band) ở vị trí 1500bp so với thang chuẩn (Hình 23).
Hình 23: Phổ điện di các dòng vi khuẩn với cặp mồi 16S-rRNA
*Ghi chú: Giếng D: Thang chuẩn 100bp. Giếng A (R1-DD2), B (L1-DD1), C (T6-DD1) Kích thước mẫu là 1500 bp.
Sau khi đã khuếch đại DNA của các dòng vi khuẩn, 3 dòng vi khuẩn này được gửi giải trình tự và định danh tại Công ty Macrogen, Hàn Quốc.
Sử dụng công cụ BLAST N của NCBI để so sánh trình tự tương đồng với các trình tự trên ngân hàng gen (bảng 12).
Bảng 12: Kết quả giải trình tự của một số dòng triển vọng:
STT Tên dòng vi
khuẩn Kết quả định danh trên NCBI Độ đồng hình (%) 1 R1-DD2 Bacillus amyloliquefaciens subbsp.
plantrum Strain FZB42 93
2 L1-DD1 Bacillus megaterium strain ATCC 14581 98
3 T6-DD1 Bacillus aerius strain 24K 94
1500 bp
B A C D
Một số kết quả nghiên cứu về các dòng vi khuẩn:
Bacillus amyloliquefaciens subbsp. plantrum Strain FZB42
B. amyloliquefaciens FZB42 được coi là PGPR do kiểm soát sinh học và sản xuất
IAA thúc đẩy tăng trưởng thực vật (Chen et al., 2007). Bacillus amyloliquefaciens được
tìm thấy để sản xuất hỗn hợp của acid lactic, isovaleric, isobutyric, acid acetic và cũng
được báo cáo là có khả năng hòa tan lân (Idriss et al., 2002). Sushil et al. (2013) cho rằng dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật và ảnh
hưởng trên đất vùng rễ của đậu nành. Mẫu phân lập được xác định dựa vào trình tự gen
16S - rRNA cho thấy 98,7% tương đồng với dòng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens
(AY 932.823) chúng có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng ở cây đậu nành như: sản xuất siderophore, indole -3- acetic acid, deaminase ACC, phosphatases, phytase, HCN, cellulase, hòa tan kẽm và đối kháng với các mầm bệnh trong đất gây ra. Nghiên cứu này
cho thấy rằng dòng vi khuẩn B. Amyloliquefaciens cải thiện hầu hết các thuộc tính vùng
rễ, cây tăng trưởng, đồng hóa các chất dinh dưỡng và năng suất của đậu nành.
Theo nghiên cứu của Artidtaya et al (2012) trên cây Phyllodium pulchellum, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt E. coli, Pseudomonas
aeruginosa.
Bacillus amyloliquefaciens được phân lập từ lá dâu tằm (MulberryLeaves) có khả
năng kháng lại nấm và vi khuẩn như: Rosellinia necatrix, Pyriculariaoryzae,
Agrobacterium tumefaciens, và Xanthomonas campestris pv.Campestris. (Yoshida et al., 2001).
Theo Liming Wu et al., 2014 sử dụng chủng Bacillus amyloliquefaciens FZB42 cho thấy hoạt tính diệt khuẩn mạnh nhất chống lại Microcystis aeruginosa với tỉ lệ lên
đến 98,78%.
Ngoài ra dòng R1-DD2 có tỷ lệ đồng hình lên tới 93% với Bacillus amyloliquefaciens subbsp. plantrum Strain FZB42 phân lập từ cây Diếp cá có khả năng
cố định đạm và kháng lại vi khuẩn gây bệnh trên cá A. Hydrophila và E. coli.
Dòng R1-DD2 là một dòng vi khuẩn triển vọng có thể ứng dụng phục vụ trong trồng trọt, trong y dược và trong thuỷ sản và có thể trở thành một loại kháng sinh vi sinh vật tiềm năng, có thể thay thế một số loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh.
Bacillus megaterium strain ATCC 14581
Theo nghiên cứu của I. A. Malanicheva et al., 2012, Bacillus megaterium có khả năng tổng hợp methicillin tiêu diệt Staphylococcus aureus INA 00761,
Leuconostoc mesenteroides VKPM B-4177, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
và Escherichia coli ATCC 25922.
Wei Sheng Wu Xue Bao (1998) đã phân lập và nhận diện được dòng vi khuẩn
Bacillus megaterium, có khả năng cố định đạm ở vùng rễ cây gạo.
Năm 2013, Souza et al đã phân lập được các dòng vi khuẩn B. megaterium, nội sinh trong rễ chuối Musa spp. có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA và hòa tan lân
khó tan .
Ngoài ra dòng L1-DD1 có độ đồng hình với Bacillus megaterium lên đến 98% có khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh trên cá A. hydrophila và E. coli.
Điều này chứng tỏ dòng L1-DD1 là một dòng vi khuẩn triển vọng có thể ứng dụng phục vụ trong trồng trọt, trong y dược và trong thuỷ sản và có thể trở thành một loại kháng sinh vi sinh vật tiềm năng, có thể thay thế một số loại thuốc kháng sinh tổng hợp trong việc chống lại các tác nhân gây bệnh, đặc biệt là các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản.
Bacillus aerius strain 24K
Bacillus aerius được nhà khoa học Shivaji et al tìm ra vào năm 2006. Tuy nhiên
cho đến nay Bacillus aerius chưa được nghiên cứu nhiều, đặt biệt là khả năng cố định
đạm, hòa tan lân, tính kháng khuẩn. Công trình nghiên cứu gần đây là:
Theo Sanjay Arora et al., 2014 cho thấy Bacillus aerius có khả năng tổng hợp đạm.
Dòng T6-DD1 có khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, có tính kháng khuẩn với
E. coli và có tỷ lệ đồng hình 94% Bacillus aerius, điều này chứng tỏ dòng T6-DD1 là
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ