phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây diếp cá (houttuynia cordata t.) trồng ở tỉnh hậu giang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA T.) TRỒNG Ở TỈNH HẬU GIANG CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS.TS NGUYỄN HỮU HIỆP SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN HỮU THIÊN PHÚC MSSV: 3108499 Lớp: VSV K36 Cần Thơ, tháng 12 / 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY DIẾP CÁ (HOUTTUYNIA CORDATA T.) TRỒNG Ở TỈNH HẬU GIANG Cần Thơ, tháng 12 / 2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN PGS.TS Nguyễn Hữu Hiệp Nguyễn Hữu Thiên Phúc DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………… Cần Thơ, ngày …… tháng …… năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp ở Trường Đại học Cần Thơ, bên cạnh những thuận lợi còn có nhiều khó khăn, thất bại. Không những bản thân cố gắng, tìm tòi nghiên cứu mà còn nhờ vào sự động viên, khích lệ của gia đình, sự hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, bạn bè đó là nguồn động lực rất lớn giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Quý Thầy Cô Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn. Phó Giáo sư- Tiến sĩ Nguyễn Hữu Hiệp, Phó Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học Vi sinh vật, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, Thầy hướng dẫn đề tài, đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm học tập và nghiên cứu khoa học. Các bạn cùng lớp Vi Sinh Vật Học K36, cán bộ phòng thí nghiệm, các anh chị cao học và các em sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật đã giúp đỡ, động viên và chia sẻ những khó khăn giúp tôi hoàn thành tốt luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình và người thân đã động viên, khích lệ và luôn ủng hộ tôi về mặt vật chất cũng như tinh thần trong suốt thời gian qua để tôi vững tin thực hiện đề tài nghiên cứu này. Kính chúc quý vị nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt. Xin trân trọng cảm ơn! Cần Thơ, ngày 26 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Hữu Thiên Phúc Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 - 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƯỢC Mười sáu dòng vi khuẩn nội sinh đã được tách ròng từ cây Diếp cá thu được ở Huyện Châu Thành và Huyện Phụng Hiệp thuộc tỉnh Hậu Giang. Hầu hết các dòng vi khuẩn này đều có dạng hình que, một số khác có dạng hình cầu, 14 dòng gram âm và 2 dòng gram dương, đa số vi khuẩn đều có khả năng chuyển động. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA của vi khuẩn cho thấy, các dòng vi khuẩn này có thể tổng hợp được một lượng IAA và ammonium nhất định sau 2 ngày chủng. Lượng ammonium và IAA này tăng cao nhất vào ngày thứ 4 và giảm dần sau sáu ngày. Trong đó R5 dòng tổng hợp đạm cao nhất với 0,459µg/ml, lượng IAA cao nhất do dòng L4 tổng hợp. T3 là dòng có hiệu suất hòa tan lân cao nhất. Đối với khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh thì R1 là dòng kháng Escherichia coli mạnh nhất, R7 và T2 là dòng kháng mạnh Aeromonas hydrophila. R1, T5 và L1 là 3 dòng có khả năng kháng cả 2 loại vi khuẩn gây bệnh được tuyển chọn tiến hành định danh, theo kết quả giải trình tự DNA và mức độ tương đồng của DNA trên ngân hàng gen xác định 3 dòng vi khuẩn đó là Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae và Bacillus amyloliquefaciens với độ tương đồng 99%. Từ khóa: ammonium, cố định ammonium, diếp cá, IAA, kháng khuẩn, vi khuẩn nội sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT ...................................................................................................... LỜI CẢM TẠ............................................................................................................... TÓM LƯỢC................................................................................................................i MỤC LỤC..................................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT...................................................................................vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU.......................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................................1 1.2 Mục tiêu đề tài................................................................................................2 CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU...................................................................3 2.1 Sơ lược về Hậu Giang.....................................................................................3 2.1.1 2.1.2 2.1.3 a. b. c. 2.2 Sơ lược về cây Diếp cá ...................................................................................5 2.2.1 2.2.2 2.3 Vị trí địa lý: .................................................................................................... 3 Điều kiện tự nhiên........................................................................................... 3 Tổng quan về Huyện Phụng Hiệp.................................................................... 4 Đặc điểm địa hình: ........................................................................................... 4 Khí hậu: ........................................................................................................... 4 Sông ngòi: ........................................................................................................ 5 Đặc điểm chung .............................................................................................. 5 Tác dụng y học của cây Diếp cá ...................................................................... 6 Vi khuẩn nội sinh............................................................................................7 2.3.1 2.3.2 a. b. c. d. e. f. g. 2.2.3 a. b. c. 2.2.4 a. b. c. Sơ lược về vi khuẩn nội sinh ........................................................................... 7 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh ................... 8 Nguồn gốc........................................................................................................ 8 Di chuyển......................................................................................................... 9 Tiếp cận ........................................................................................................... 9 Xâm nhập hay xuyên thấu ................................................................................ 9 Sinh sản.......................................................................................................... 10 Xâm nhập....................................................................................................... 10 Định cư .......................................................................................................... 11 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ........................................................... 11 Khả năng cố định đạm.................................................................................... 11 Khả năng hòa tan lân khó tan.......................................................................... 13 Đối kháng sinh học......................................................................................... 13 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp........................................................ 14 Vi khuẩn Bacillus........................................................................................... 14 Vi khuẩn Pseudomonas .................................................................................. 18 Vi khuẩn Azospirillum.................................................................................... 20 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học d. e. f. g. 2.4 Vi khuẩn Klebsiella ........................................................................................ 20 Vi khuẩn Azotobacter..................................................................................... 20 Vi khuẩn Enterobacter ................................................................................... 21 Vi khuẩn Burkholderia ................................................................................... 21 Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp. .........................................................22 2.4.1 a. b. c. d. 2.4.2 2.5 Trường Đại học Cần Thơ Vi khuẩn Escherichia coli ( E. coli). ............................................................. 22 Sơ lược về E. coli ........................................................................................... 22 Đặc điểm:....................................................................................................... 23 Cơ chế gây bệnh:............................................................................................ 23 Triệu chứng:................................................................................................... 23 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila). ......................................... 23 Tình hình nghiên cứu Diếp cá trong và ngoài nước.......................................26 2.5.1 2.5.2 Trong nước ................................................................................................... 26 Ngoài nước ................................................................................................... 26 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................28 3.1 Phương tiện nghiên cứu ................................................................................28 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 a. b. 3.2 Thời gian ...................................................................................................... 28 Địa điểm ....................................................................................................... 28 Vật liệu ......................................................................................................... 28 Dụng cụ và thiết bị........................................................................................ 28 Hóa chất và môi trường................................................................................. 29 Hóa chất dùng để khử trùng mẫu .................................................................... 29 Hóa chất thí nghiệm ....................................................................................... 29 Phương pháp nghiên cứu ..............................................................................32 3.2.1 a. b. c. 3.2.2 a. b. c. d. e. f. 3.2.3 3.2.4 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh ....................................................... 32 Xử lý mẫu ...................................................................................................... 32 Pha loãng mẫu................................................................................................ 32 Phân lập vi khuẩn ........................................................................................... 32 Xác định các đặc tính của vi khuẩn nội sinh .................................................. 33 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn ............................ 33 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh...................................................................... 34 Xác định khả năng tổng hợp NH4+ .................................................................. 35 Xác định khả năng hòa tan lân khó tan............................................................ 37 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập. ............ 37 Khảo sát khả năng kháng khuẩn ..................................................................... 38 Sử dụng kỹ thuật PCR để nhận diện một số dòng vi khuẩn triển vọng. .......... 39 Xử lý kết quả ................................................................................................ 40 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................41 4.1 Phân lập vi khuẩn .........................................................................................41 4.2 Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA.................................41 4.3 Khả năng cố định đạm ..................................................................................45 4.4 Hoạt tính hòa tan lân khó tan. .......................................................................50 4.5 Khả năng tổng hợp IAA................................................................................52 Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 4.6 Khả năng kháng khuẩn. ................................................................................57 4.6.1 4.6.2 4.7 Trường Đại học Cần Thơ Khả năng kháng vi khuẩn Escherichia coli.................................................... 57 Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila. ........................................ 59 Kết quả PCR và định danh những dòng vi khuẩn triển vọng. ........................61 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...............................................................65 5.1 Kết luận ........................................................................................................65 5.2 Đề nghị.........................................................................................................65 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................66 PHỤ LỤC Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần môi trường PDA........................................................................29 Bảng 2: Thành phần môi trường NBRIP ....................................................................29 Bảng 3: Công thức môi trường đặc NFb (g/l).............................................................30 Bảng 4: Công thức dung dịch vi lượng.......................................................................30 Bảng 5: Công thức dung dịch Vitamin .......................................................................31 Bảng 6: Thành phần môi trường LB ( Luria Betani)...................................................31 Bảng 7. Thành phần các chất trong phản ứng PCR.....................................................31 Bảng 9. Chu kỳ phản ứng PCR ..................................................................................40 Bảng 10. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA.....................42 Bảng 11. Đặc tính khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA .................43 Bảng 12. Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA...............................44 Bảng 13: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Rễ..........46 Bảng 14: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Thân. .....47 Bảng 15: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Lá. .........48 Bảng 16: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn triển vọng.................49 Bảng 17: Khả năng hòa tan lân khó tan của 16 dòng vi khuẩn phân lập được.............51 Bảng 18: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ....................53 Bảng 19: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân. ...............54 Bảng 20: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá. ...................55 Bảng 21: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng. ........................55 Bảng 22 : Hiệu quả kháng E. coli của 3 dòng vi khuẩn triển vọng..............................57 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Cây Diếp cá ....................................................................................................6 Hình 2: Bacillus amyloliquefaciens............................................................................16 Hình 3: Bacillus cereus..............................................................................................17 Hình 4: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens...............................................................19 Hình 5: Vi khuẩn E. coli ............................................................................................22 Hình 6: Cá bị nhiễm A.hydrophila .............................................................................25 Hình 7: Một số hình ảnh về Aeromonas hydrophila ...................................................25 Hình 8: A: Cây Diếp cá tiến hành phân lập vi khuẩn.................................................41 B: Vòng pellicle xuất hiện trên môi trường Nfb ........................................................41 Hình 9: Hình dạng một số khuẩn lạc vi khuẩn phân lập. ............................................43 Hình 10: Hình dạng và đặc điểm nhuộm gram của một số dòng vi khuẩn ..................44 Hình 11: Đường chuẩn đo nồng độ NH4+ ..................................................................45 Hình 12: Hiệu quả hòa tan lân của một số dòng vi khuẩn phân lập.............................51 Hình 13: Đường chuẩn đo nồng độ IAA ....................................................................52 Hình 14: Hiệu quả kháng E. coli của các dòng vi khuẩn triển vọng............................58 Hình 15: Hoạt tính kháng E. coli của một số dòng vi khuẩn phân lập.........................58 Hình 16: Hiệu quả kháng A. hydrophila của các dòng vi khuẩn triển vọng.................59 Hình 17: Hoạt tính kháng A. hydrophila của một số dòng vi khuẩn phân lập.............60 Hình 18: Phổ điện di DNA các dòng vi khuẩn ...........................................................61 Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A. hydrophilla Aeromonas hydrophilla DMSO Dimethyl sulfoxide DNA Deoxyribo Nucleic Acid ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long E. coli Escherichia coli EAEC Enteroaggregative E. coli EHEC Enterohemorrhagic E. coli EPEC Enteropacthogenic E. coli ETEC Enterotoxigenic E. coli EIEC Enteroinvasive E. coli IAA Indole–3–Acetic Acid LB Luria - Bertani NBRIP National Botanical Research Institute's phosphate OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato dextrose agar Chuyên ngành Vi sinh vật học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Trong thiên nhiên, có rất nhiều cây cỏ có chất kháng sinh và nguồn dược liệu của Việt Nam thì vô cùng phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc có tính kháng khuẩn đã được Y học dân tộc dùng làm thuốc từ lâu. Chúng thường là những cây cỏ rất quen thuộc, mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn nhà. Nhiều cây thuốc đã được các nhà khoa học nghiên cứu và tìm thấy những chất kháng khuẩn có tác dụng diệt nhiều loại vi khuẩn, trong đó có cây Diếp cá. Diếp cá là loại rau rất quen thuộc trong các bữa ăn hàng ngày của các gia đình Việt Nam, nhất là các tỉnh phía Nam. Thường dùng làm rau ăn sống, làm gia vị cùng các loại rau khác. Diếp cá cũng được sử dụng làm thuốc trị một số bệnh như táo bón, sởi, viêm cơ, đau mắt, viêm phổi, nhiễm trùng... So sánh với kháng sinh tổng hợp, có thể thấy các chất kháng sinh từ thực vật tuy hiệu lực kháng khuẩn không mạnh bằng nhưng cũng đủ để chữa khỏi nhiều bệnh nhiễm khuẩn. Không những thế, chúng còn có nhiều ưu điểm mà thuốc kháng sinh tổng hợp không có. Một trong những vấn đề đó là hiện tượng quen thuốc, kháng thuốc và loạn khuẩn do tình hình lạm dụng kháng sinh trong điều trị ngày càng phát triển ở nhiều nước trên thế giới. Đây là chuyện nan giải đối với kháng sinh tổng hợp hiện nay, nhưng đối với kháng sinh thực vật người ta chưa thấy hiện tượng này. Đó là chưa kể những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng sinh gây ra, có khi dẫn đến tử vong, trong khi ưu điểm nổi bật của kháng sinh thực vật là rất ít độc, do đó không gây ra những tai biến nguy hiểm. Bên cạnh đó, phần lớn các kháng sinh thực vật lại rất bền vững và dễ hoà tan trong nước, nên có thể được dùng dưới dạng thuốc sắc là dạng bào chế đơn giản và thông dụng nhất. Chính vì vậy, gần đây người ta chú ý nhiều đến kháng sinh thực vật và có xu hướng trở lại với các cây thuốc, sử dụng các kháng sinh tự nhiên của cây cỏ. Nhiều nghiên cứu sản xuất cây dược liệu có tính kháng khuẩn như cây Sài đất (Wedelia calendulacea, Less), cây Diếp cá (Houttuynia cordata, Thunb), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria, Less)… đã được nghiên cứu chứng tỏ chúng có hoạt tính kháng khuẩn nhờ chúng có chứa tinh dầu là các nhóm aldehyd và các dẫn xuất ceton như methyl n-nonyl ceton, L-decanal, L-dodecanal. Nhóm terpen bao gồm các chất αChuyên ngành Vi sinh vật học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ pinen, camphen,...có tác dụng diệt các vi khuẩn Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Shigella, Salmonella, E. coli (Đỗ Tất Lợi, 2004). Nhiều nghiên cứu cho thấy trong các cây trồng không thuộc họ đậu cũng có các nhóm vi sinh vật có ích sống trong cây hoặc ở vùng rễ cây đã kích thích cây trồng phát triển tốt nhờ chúng có khả năng cố định nitơ, phân giải lân, tổng hợp các hormone tăng trưởng và các hợp chất có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại các tác nhân gây bệnh cây. Đặc biệt là có những chủng vi sinh vật nội sinh với cây dược liệu có thể sản xuất các hợp chất kháng khuẩn khi chúng sống bên trong cây dược liệu. Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter, Klebsiella… Đặc biệt có 2 chi có khả năng kháng khuẩn cao là Bacillus và Pseudomonas. 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá trồng ở tỉnh Hậu Giang có khả năng tổng hợp ammonium, IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về Hậu Giang Hậu Giang là tỉnh thuộc khu vực nội địa của Đồng bằng Sông Cửu Long, nằm ở trung tâm châu thổ sông MeKong. Hậu Giang là một trong những trung tâm lúa gạo của miền Tây Nam Bộ. Tỉnh có thế mạnh về cây lúa và cây ăn quả các loại, có nguồn thủy sản phong phú, chủ yếu tôm cá nước ngọt và chăn nuôi gia súc. 2.1.1 Vị trí địa lý: Tỉnh nằm ở hạ lưu sông Hậu, giữa một mạng lưới sông ngòi, kênh rạch chằng chịt. Tỉnh nằm kề thành phố Cần Thơ, trung tâm của vùng Tây Nam Bộ. Sự phát triển của thành phố Cần Thơ sẽ có ảnh hưởng đến sự phát triển của tỉnh Hậu Giang. Tuy nhiên, do vị trí nằm sâu trong nội địa nên Hậu Giang gặp không ít khó khăn trong việc khai thác các nguồn lực bên ngoài lãnh thổ, nhất là trong bối cảnh toàn cầu hoá. 2.1.2 Điều kiện tự nhiên. Hậu Giang là tỉnh nằm ở phần cuối Đồng bằng châu thổ Sông Cửu Long, địa hình thấp, độ cao trung bình dưới 2m so với mực nước biển. Địa hình thấp dần từ Bắc xuống Nam và từ Đông sang Tây. Khu vực ven sông Hậu cao nhất, trung bình khoảng 1m - 1,5m, độ cao thấp dần về phía Tây. Bề mặt địa hình bị chia cắt mạnh bởi hệ thống kênh rạch nhân tạo. Tỉnh Hậu Giang nằm trong vòng đai nội chí tuyến Bắc bán cầu, gần xích đạo, có khí hậu nhiệt đới gió mùa, chia thành hai mùa rõ rệt. Mùa mưa có gió Tây Nam từ tháng 5 đến tháng 11, mùa khô có gió Đông Bắc từ tháng 12 đến tháng 4 hàng năm. Nhiệt độ trung bình là 27oC không có sự trên lệch quá lớn qua các năm. Tháng có nhiệt độ cao nhất (35oC) là tháng 4 và thấp nhất vào tháng 12 (20,3oC). Mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 hàng năm, chiếm từ 92 - 97% lượng mưa cả năm. Lượng mưa ở Hậu Giang thuộc loại trung bình, khoảng 1800 mm/năm, lượng mưa cao nhất vào khoảng tháng 9 (250,1mm). Ẩm độ tương đối trung bình trong năm phân hoá theo mùa một cách rõ rệt, chênh lệch độ ẩm trung bình giữa tháng ẩm nhất và tháng ít ẩm nhất khoảng 11%. Độ ẩm trung bình thấp nhất vào khoảng tháng 3 và 4 (77%) và giá trị độ ẩm trung bình trong năm là 82%. Tỉnh Hậu Giang có một hệ thống sông ngòi kênh rạch chằng chịt với tổng chiều dài khoảng 2.300 km. Mật độ sông rạch khá lớn 1,5 km/km, vùng ven sông Hậu thuộc Chuyên ngành Vi sinh vật học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ huyện Châu Thành lên đến 2 km/km. Hậu Giang nằm trong vùng trũng của khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long. Cấu tạo của vùng có thể chia thành hai vùng cấu trúc rõ rệt là tầng cấu trúc dưới và tầng cấu trúc bên, trong đó tầng cấu trúc dưới gồm nền đá cổ cấu tạo bằng đá Granite và các đá kết tinh khác, bên trên là đá cứng cấu tạo bằng đá trầm tích biển hoặc lục địa và các loại đá magma xâm nhập hoặc phun trào ( http://vi.wikipedia.org/wiki/H%E1%BA%ADu_Giang). 2.1.3 Tổng quan về Huyện Phụng Hiệp Huyện Phụng Hiệp nằm ở phía Đông của tỉnh Hậu Giang, địa hình chạy theo sông, kênh, rạch và các đường Quốc lộ chính như: đường tỉnh 927, đường 928, Quốc lộ 61 tiếp giáp với các huyện, tỉnh khác như sau: Phía Bắc giáp huyện Châu Thành A, phía Đông giáp huyện Châu Thành và thị xã Ngã Bảy, phía Nam giáp huyện Châu Thành và huyện Mỹ Tú (Sóc Trăng), phía Tây giáp huyện Vị Thủy và huyện Long Mỹ. Huyện chia thành 15 đơn vị hành chính gồm 03 thị trấn: Cây Dương, Kinh Cùng, Búng Tàu và 12 xã: Phụng Hiệp, Long Thạnh, Thạnh Hòa, Tân Bình, Hòa An, Hiệp Hưng, Tân Phước Hưng, Hòa Mỹ, Phương Bình, Phương Phú, Tân Long và Bình Thành. Có vị thế nằm gần với sông Hậu và nhiều kênh trục chạy qua, đồng thời quy mô đất đai và dân số của huyện lớn là tiềm năng và lợi thế cho phát triển kinh tế - xã hội, nhất là trong lĩnh vực nông nghiệp. a. Đặc điểm địa hình: Địa hình của huyện nhìn chung khá bằng phẳng, cao độ có xu thế thấp dần theo hướng từ Bắc xuống Nam, từ Đông sang Tây thấp dần vào giữa huyện, đã tạo thành các khu vực có địa hình cao thấp khác nhau. b. Khí hậu: Huyện Phụng Hiệp nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với những đặc trưng sau: Nhiệt độ cao đều trong năm (trung bình 26,8oC), tháng 4 nóng nhất (nhiệt độ trung bình 28,3oC) và tháng giêng thấp nhất (nhiệt độ trung bình 25,5 oC). Nắng nhiều (trung bình 2.445 giờ/năm, 6,7 giờ/ngày), điều kiện khí hậu khá thuận lợi để cây trồng sinh trưởng – phát triển tốt, cho năng suất và chất lượng sản phẩm cao. Chuyên ngành Vi sinh vật học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Lượng mưa bình quân năm đạt 1.635mm và phân hóa sâu sắc theo mùa. Mùa mưa bắt đầu từ tháng 4 đến tháng 11 với lượng mưa chiếm 90% tổng lượng mưa trong năm. Mùa khô bắt đầu từ tháng 12 đến tháng 3 với lượng mưa chỉ chiếm 10% tổng lượng mưa trong năm. c. Sông ngòi: Phụng Hiệp có hệ thống sông ngòi chằng chịt với nhiều con sông lớn nhỏ. Sông Hậu là nguồn cung cấp nước chủ yếu trên địa bàn huyện với nguồn nước dồi dào quanh năm tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển kinh tế -xã hội của huyện đặc biệt là trong lĩnh vực nông nghiệp ( Vũ Trường, 2011) 2.2 Sơ lược về cây Diếp cá 2.2.1 Đặc điểm chung Diếp cá có tên khoa học là Houttuynia cordata Thunb, thuộc họ lá Giấp (Saururaceae), còn được gọi là Giấp cá, Dấp cá, Ngư tinh thảo. Diếp cá là loài của lục địa châu Á, phân bố từ Ấn Độ qua Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, các nước Đông Dương. Ở nước ta, Diếp cá mọc hoang ở chỗ ẩm ướt, thường được trồng làm rau ăn. Thu hái cành lá quanh năm, thường dùng tươi. Có thể phơi hay sấy khô để dùng dần. Là một loại cỏ nhỏ, mọc lâu năm, có thân rễ mọc ngầm dưới đất. Rễ nhỏ mọc ở các đốt, thân mọc đứng, hình trụ tròn hay dẹt, có lông hoặc ít lông, cao 25- 30cm, đường kính 2- 3 mm. Các mấu ở gốc thân còn vết tích của rễ, chất giòn dễ gãy. Lá mọc cách, hình tim, đầu lá hơi nhọn hay nhọn hẳn, phiến lá gấp cuộn lại, nhàu nát, cuống lá dài khoảng 2- 3 cm, gốc cuống lá rộng thành bẹ mỏng. Mặt trên lá màu lục, vàng sẫm đến nâu sẫm, mặt dưới màu lục xám đến nâu xám. Cụm hoa là 1 bông dài 1-3cm, hoa nhỏ, không có bao hoa, có 4 lá bắc màu trắng; trông toàn bộ bề ngoài của cụm hoa và lá bắc giống như một cây hoa đơn độc. Toàn cây vò có mùi tanh như mùi cá. Hoa nở vào mùa hạ vào các tháng 5- 8, kết quả vào tháng 7- 10. (Đỗ Tất Lợi, 2004). Theo Đỗ Tất Lợi, (2004), trong cây có chừng 0,0049% tinh dầu và một ít chất ancaloit gọi là cocdalin. Thành phần chủ yếu của tinh dầu là metylnonylxeton, chất myrcen, axid caprinic và laurinaldehyt. Hoa và quả chứa chất isoquexitrin và không chứa quexitrin. Độ tro trung bình là 11,4%, tro không tan trong HCl là 2,7%. Chuyên ngành Vi sinh vật học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Hình 1: Cây Diếp cá (Hình chụp ngày 09/06/2013) 2.2.2 Tác dụng y học của cây Diếp cá Theo đông y, Diếp cá có vị cay chua, mùi tanh, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu tiêu thũng, sát trùng; còn có tác dụng ức chế thần kinh và chống viêm loét. Người ta đã biết là cordalin có tác dụng kích thích gây phồng, quercitrin có tác dụng lợi tiểu mạnh. Ngoài các hoạt chất trong Diếp cá là quercetin, isoquercetin có tác dụng lợi tiểu mạnh, làm vững bền mao mạch. Tinh dầu Diếp cá có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn mạnh. Ở Trung Quốc, người ta nhổ cây Diếp cá vào mùa hè và thu hoạch rửa sạch rồi phơi khô. Những người nguyên khí hư, có chứng đau chân không nên dùng. Những người không phải thấp nhiệt và sang độc cũng không nên dùng. Dùng bên ngoài trị ung nhọt, sưng, vết thương da lở, đắp bó làm xương gãy mau lành. Nấu Diếp cá với thịt heo uống vào mùa xuân để xổ lãi. Lá Diếp cá sắc nước rẩy để cây bông vải, lúa kiều mạch khỏi bị dòn úa. Diếp cá theo dân Đông Dương tin tưởng và kinh nghiệm dùng nhiều thế kỷ là có tính dược mát, tán khí, trị kiết lị, sởi. Nghiền nhỏ lá đắp vào các chỗ bầm dập và trên mí mắt trị đỏ mắt, lá còn trị mề đay. Hoa Diếp cá dùng để trục hài nhi chết trong bụng. (http://vi.wikipedia.org/wiki/Gi%E1%BA%A5p_c%C3%A1) Chuyên ngành Vi sinh vật học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Theo nghiên cứu của y khoa hiện đại, trong cây Diếp cá có chất decanoylacetaldehyde mang tính kháng sinh. Loại rau này có tác dụng kháng khuẩn như ức chế tụ cầu vàng, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn bạch hầu, E.coli, trực khuẩn lỵ, xoắn khuẩn leptospira. Nó cũng có tác dụng đối với virus sởi, herpes, cúm và cả HIV, do tác động vào vỏ bọc protein của virus. Diếp cá còn diệt ký sinh trùng và nấm. Cũng theo Tây y, Diếp cá giúp lợi tiểu do tác dụng của chất quercitrin, làm chắc thành mao mạch, chữa trĩ do tác dụng của chất dioxy-flavonon. Ngoài ra, nó còn có tác dụng lọc máu, giải độc, giải nhiệt, kháng viêm, tăng sức miễn dịch của cơ thể. Một nghiên cứu tại Viện đại học Y dược Toyama, Nhật Bản, đã cho thấy tác dụng chống oxy-hóa của 12 loại dược thảo và hợp chất được chiết xuất từ chúng. Diếp cá là một trong 4 cây có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất. Theo một nghiên cứu của Đại học Y khoa Koahsiung, Đài Loan, Diếp cá có tác dụng ức chế đáng kể đối với sự sinh sản của virus Herpes simplex. Nó được xem là dược thảo chữa trị bệnh này. Đại học Koahsiung cũng phát hiện diếp cá có tác dụng ngăn chặn 5 dòng tế nào ung thư máu. Một số nghiên cứu khác cho thấy Diếp cá có tác dụng chống viêm xoang kinh niên và polyp, làm tăng tưới máu sau phẫu thuật. Chất Houttuynin bisulphat natri chiết xuất từ nó có thể điều trị viêm tuyến vú. (http://vietbao.vn/Suc-khoe/Rau-diep-ca-vithuoc-da-nang/10910304/248/) 2.3 Vi khuẩn nội sinh 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang dại, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo nhiều cách: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên, thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô rễ hay biểu bì rễ để sống như: Azotobacter, Bacillus, Gluconacetobacter, Pseudomonas, Azoarcus, Burkholderia, Campylobacter, Herbaspirillum, Derxia, Paenibacillus (Elmerich, 2007). Tuy nhiên nó cũng có thể xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983). Sau khi xâm nhập vào cây chủ , các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, di vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al, 2002). Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ rất biến thiên, phụ thuộc chủ yếu vào loài vi khuẩn và kiểu di truyền của cây chủ, nhưng cũng phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của cây chủ và các điều kiện môi trường (Pillay và Nowak, 1997). Một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại hay gây bệnh đối với cây chủ mà nhiều loài còn có khả năng tổng hợp IAA, cố định đạm từ không khí và hòa tan lân khó tan, kích thích cây tăng trưởng và làm tăng năng suất cây trồng (Muthukumarasamy et al, 2002). Một số dòng đã mang lại hiệu quả cao trong kiểm soát bệnh của cây, nhất là hạn chế nguồn bệnh trong đất như Fusarium oxysporum, Gaeumannomyces graminis, Pythium spp., Vùng rễ là nơi tiếp giáp giữa rễ thực vật và đất, là nơi lắng động của các chất hữu cơ, và là nơi xuất phát của các môi trường sống và các nguồn sống khác nhau cho các vi sinh vật đất. Thực vật có thể thay đổi vùng rễ của chúng nhờ sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, độ ẩm và oxy từ vùng rễ; và các chất do rễ tiết ra. Đặc tính quan trọng của các dịch rễ có tỉ lệ C/N cao nên có thể đẩy mạnh sự phong phú của các vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ. Ngược lại, vi sinh vật vùng rễ có thể ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira et al, 1983; Harari et al, 1988). Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất trong các cây còn non. 2.3.2 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong cơ thể (mô) thực vật có thể sống sót và phát triển bên ngoài môi trường và có thể có nguồn gốc từ những hạt giống và cây con khi chúng ta phân phối hạt giống từ vùng này sang vùng khác. Chúng nhanh chóng phát triển trong đất vùng rễ hay bề mặt rễ (Hallmann, 2001), từ đây chúng nhân mật số và di chuyển vào trong mô thực vật bằng nhiều con đường. Trước hết, vi khuẩn nội sinh xuất phát từ nguồn nhất định. a. Nguồn gốc Qua những kết quả thu được từ thân, lá, hạt, rễ, Mano và Morisaki (2008) cho rằng nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh là đất vùng rễ. Kết hợp nhiều kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ cây lúa mì, bông vải, bắp ngọt, bắp đá và cải canola đều kết luận Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ vi khuẩn nội sinh xuất phát từ đất. Vai trò của hạt như là một nguồn của vi khuẩn nội sinh vẫn là một điều còn tranh cãi (Hallmann et al, 2001). b. Di chuyển Theo Hallmann (2001), thường vi khuẩn nội sinh được thu hút hay di chuyển từ môi trường bên ngoài đến cây chủ bằng cơ chế hóa hướng động hay ngẫu nhiên hoặc cả hai cơ chế. Rễ cây tiết ra bên ngoài một số hợp chất như là dưỡng chất để vi khuẩn nội sinh tìm đến và quần tụ trên bề mặt rễ, ví dụ: vi khuẩn có ích Pseudomonas fluorescens và Azospirillum brasilense hướng đến rễ lúa mì do rễ lúa mì tổng hợp và phóng thích chất kích thích tổng hợp (Bashan, 1986). Ngoài ra, sự tiếp xúc ngẫu nhiên với rễ cây do rễ phát triển để tìm nguồn nước hay dưỡng chất cũng là cơ hội quan trọng để vi khuẩn có thể tiếp xúc với lông hút của rễ non. c. Tiếp cận Một hợp chất trung gian để gắn chặt vi khuẩn nội sinh vào bề mặt rễ là lectins. Đây là hợp chất rất đặc biệt thường gặp trong các trường hợp vi khuẩn cộng sinh và giả thiết này cũng được các nhà khoa học đề cập đến. Duijff et al (1997) đã chứng minh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens dòng WCS417r đến bề mặt rễ do một hợp chất lipo-polysaccharide. d. Xâm nhập hay xuyên thấu Theo Hallmann ( 2001), có nhiều con đường chính để vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong mô thực vật như: Các lỗ tự nhiên như thủy khổng (Hydathodes), lỗ khí khổng (stomata), lỗ rễ (lenticels). Lỗ từ sự ma sát với đất hay vết bệnh, vị trí hình thành rễ ngang (lateral roots). Vi lỗ (micropores). Vết thương do tác động vật lý (wounds). Tuy nhiên con đường quan trọng và có khả năng nhất là vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong mô thực vật là vết thương và vi lỗ hiện diện khi bắt đầu sự hình thành lông hút, chính đây là lớp tế bào non rất dễ xâm nhập. Chuyên ngành Vi sinh vật học 9 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Thêm vào đó, vết bệnh cũng có thể là cửa ngõ cho vi khuẩn xâm nhập vào bên trong ví dụ như trường hợp vết bệnh từ tuyến trùng và vết nấm bệnh do Rhizotonia solani Ngoài ra vi khuẩn có thể tiết ra enzyme cellulase để phá hủy lớp tế bào biểu bì của rễ non để xâm nhập vào bên trong thực vật như trường hợp vi khuẩn Gluconacetobacter diazotrophicus. Vi khuẩn xâm nhập vào thẳng bên trong nhu mô rễ non và chúng vào thẳng những tế bào rễ. Vi khuẩn có thể xâm nhập vào rễ lúa bằng các rãnh trong các rễ ngang của giống Sprice, chúng tập trung vào bên ngoài và bên trong vùng nhu mô rễ và các mạch gỗ rồi từ đây chúng khuếch tán vào thân lúa, chúng được tìm thấy trong các tế bào nhu mô lá. e. Sinh sản Mặc dù vi khuẩn nội sinh tập trung hay tiếp cận các địa điểm mà chúng có khả năng xâm nhập vào bên trong mô thực vật nhưng mật số tương đối thấp chỉ từ 1.000 đến 1.000.000 tế bào/g mô thực vật (Hallmann, 2001), chúng bắt buộc phải sinh sản một số lượng tương đối lớn trước khi xâm nhập vào bên trong mô thực vật. Sự phân cắt hay sinh sản vi khuẩn Azoarcus sp. được tìm thấy bên ngoài và cả bên trong nhu mô rễ lúa và cỏ Kallar (Hurek et al, 1994) f. Xâm nhập Hallmann (2001) tóm tắt sự xâm nhập của vi khuẩn nội sinh vào bên trong mô thực vật bằng 7 con đường như sau: - Vi khuẩn nội sinh tập trung và xâm nhập ngẫu nhiên trên bề mặt rễ non. - Chúng cũng có thể tập trung và xâm nhập bên dưới lớp biểu bì rễ. - Chúng có thể tập trung và xâm nhập ngay vết thương ở rễ do sự ma sát. - Vi khuẩn nội sinh có thể tập trung và xâm nhập ngay lỗ mọc các lông hút. - Chúng tiếp cận đầu lông hút của rễ non để di chuyển vào trong. - Chúng len lỏi khoảng hở giữa các tế bào rễ. - Chúng có thể đi theo trong quá trình hấp thu chất dinh dưỡng vào rễ qua con đường các mạch gỗ. Nhìn chung, vi khuẩn nội sinh có khả năng tập trung ở những vị trí đã trình bày ở phần trên là do rễ cây tiết ra những chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh sản. Beattie và Lindow (1995) cho rằng vi khuẩn nội sinh có thể xâm nhập vào bên trong Chuyên ngành Vi sinh vật học 10 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ mô lá nhờ các khẩu của lục lạp, qua con đường này vi khuẩn có đủ khoảng không thích hợp có đủ oxy cần thiết cho sự sinh trưởng trong điều kiện vi hiếu khí như khoảng trống chứa khí ở nhu mô rễ lúa mà Rheinold et al (1987) đã phát hiện các vi khuẩn nội sinh sống tốt. g. Định cư Sau khi xâm nhập vào trong nhu mô thực vật, vi khuẩn nội sinh di chuyển đến các bó mạch gỗ để theo nước từ rễ lên các phần khác trên không của cây. Vi khuẩn nội sinh cũng có thể tập trung sinh sống và phát triển trong các tế bào nhu mô lá, tế bào diệp lục. Ở đây chúng có thể phát triển lâu dài hay có thể tiếp tục sinh sản và di chuyển đến các bộ phận khác của cây. 2.2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là nhóm vi khuẩn tiền nhân được liên kết với thực vật, một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại cho cây chủ, mà ngược lại còn thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự sinh trưởng của thực vật và sự cố định đạm từ không khí. Hơn nữa, một số dòng vi khuẩn nội sinh có thể cải thiện sự phát triển của bệnh và kích thích sự chống chịu của cây trồng đối với sự tác động của các nhân tố vô sinh và hữu sinh (Hallmann et al, 2001). a. Khả năng cố định đạm Các nguồn nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của vi sinh vật, nó là thành phần chính của tất cả các amino acid, cũng như liên kết với protein, cả trong DNA và RNA. Trong thực vật, hầu hết nitơ hiện diện trong các phân tử chlorophyll – chất cần thiết cho quá trình quang hợp. Trong không khí có khoảng 78% thể tích là khí nitơ, tuy nhiên vì đây là khí trơ nên có rất ít loài sinh vật có khả năng sử dụng nguồn chất dinh dưỡng này. Trong tự nhiên chỉ có nhóm vi sinh vật sơ hạch là vi khuẩn mới có khả năng sử dụng nitơ. Thông qua hoạt động của các vi sinh vật này, nitơ được chuyển hóa thành dạng dễ tiêu mà cây trồng cố thể sử dụng được. Hằng năm, cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn nitơ. Bằng cách bón phân con người đã trả lại cho đất khoảng 40% lượng nitơ, phần còn lại được bổ sung do hoạt động của các vi sinh vật. Vì vậy việc nghiên cứu, sử dụng nguồn đạm này đóng vai trò rất quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta, đặc biệt là trong tình hình môi trường đang bị ô nhiễm như hiện nay. Con người và cây trồng không có khả năng đồng hóa nguồn N2 tự nhiên Chuyên ngành Vi sinh vật học 11 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ này. Hơn nữa, liên kết N≡N rất bền vững, muốn tạo thành các hợp chất vô cơ cần phải sử dụng nguồn năng lượng rất lớn. Tuy nhiên, trong tự nhiên tồn tại một số vi sinh vật có khả năng biến N2 thành NH3 hữu ích cho cây mà cần rất ít năng lượng (3 – 5 kcal/M). Quá trình cố định đạm bằng con đường sinh học này có ý nghĩa rất to lớn đối với cân bằng lượng N2 trên trái đất và duy trì độ phì nhiêu của đất. Các quá trình cố định nitơ tự do thường cần nhiệt độ và áp suất cao. Tuy nhiên, trong công nghiệp, nhờ các chất xúc tác nên năng lượng dùng cho quá trình cố định nitơ được giảm nhiều, còn khoảng 16 – 20 Kcalo/M. Trong tự nhiên, cố định đạm sinh học xảy ra trong khí quyển được chuyển thành NH3 nhờ enzyme nitrogenase và thường tiêu tốn năng lượng: N2 + 8H+ + 8e- + 16ATP  2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi Enzyme nitrogenase thường gồm 2 thành phần: một thành phần gọi là Mo – protein có trọng lượng phân tử khoảng 60.000 và một thành phần khác gọi là Mo – Fe – protein có trọng lượng phân tử khoảng 220.000 và gồm 2 tiểu phần đã được kết tinh tinh khiết. Các vi sinh vật cố định đạm trong tế bào vi khuẩn hay vi khuẩn lam đều nhờ đến hệ thống gen nif, điều khiển quá trình tổng hợp enzyme nitrogenase. Enzyme này dễ bị phá hủy bởi oxy. Nhiều vi khuẩn ngừng sản xuất enzyme này trong sự hiện diện của oxy. Nhiều vi sinh vật cố định đạm chỉ tồn tại trong điều kiện kỵ khí, vi hiếu khí hoặc ràng buộc oxy với một protein như leghemoglobin. Quá trình cố định nitơ được tiến hành theo 2 con đường: con đường khử và con đường oxy hóa: - Con đường khử: N2  HN=NH  H2N-NH2  NH3  NH4OH - Con đường oxy hóa: N2  N2 O  (HNO)2  NH4OH Qua đó ta nhận thấy được: - Nếu nồng độ oxy cao sẽ ức chế quá trình cố định nitơ. - Hiệu suất cố định nitơ của các vi sinh vật kỵ khí thường cao hơn các vi sinh vật hiếu khí. Chuyên ngành Vi sinh vật học 12 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ b. Khả năng hòa tan lân khó tan Lân (P) là một trong những chất dinh dưỡng đa lượng thiết yếu nhất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng (Illmer và Schinner, 1992). Nhìn chung, lân sẵn có trong đất cần cho sự sinh trưởng thực vật thấp, hàm lượng lân trung bình trong đất khoảng 0,05% (w/w) nhưng chỉ có 0,1% hàm lượng lân tổng số là có giá trị cho cây (Zou et al, 1992). Việc thiếu lân ở đất là một trong những nhân tố quan trọng nhất ở đất hạn chế sự sinh trưởng của thực vật, vì vậy để đạt năng suất thực vật tối đa người ta thường dùng các dạng phân lân dễ tan để bón cho cây . Tuy nhiên, các dạng có thể hòa tan của phân lân khi bón vào đất lại dễ dàng bị kết tủa thành các dạng không hòa tan được như là: CaHPO4, Ca3(PO4)2 nên cây khó hấp thụ (Omar, 1998) và dẫn đến việc bón phân lân vượt quá mức đối với cây trồng. Việc bón phân lân vượt quá giới hạn cho phép là một trong những nguyên nhân gây ra ô nhiễm môi trường, làm đất bị hoang hóa hay xói mòn, đồng thời cũng gây ra các vấn đề về kinh tế. Cơ chế của quá trình phân giải phosphate đến nay vẫn chưa được hiểu đầy đủ và còn nhiều tranh cãi. Sản sinh acid hữu cơ có thể là nguyên nhân chủ yếu, song CO2, H2S, acid, kiềm cũng là các yếu tố được nhiều nhà nghiên cứu đề cập đến. Các vi sinh vật phân giải hợp chất phospho khó tan được biết đến nay là các loại: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus, Flavobacterrium, Penicilium, Sclelotium, Aspergillus. Các sinh vật này không chỉ phân giải phosphate canxi mà cả phosphate nhôm, sắt, mangan và các dạng khác, kể cả quặng. Vi sinh vật không chỉ chuyển hóa phosphate vô cơ, mà còn có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo ra sản phẩm mà cây trồng có thể hấp thu được. c. Đối kháng sinh học Vi khuẩn nội sinh có thể có khả năng làm yếu đi hay ngăn cản tác hại của các vi sinh vât gây hại; điều này có thể dân đến hiện tượng gia tăng kháng bệnh hay kích kháng. Nhiều thí nghiệm đã chứng minh vai trò của vi khuẩn nội sinh trong việc ngăn chặn sự tác hại của nấm Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum trên bông vải (Chen et al, 1995); Fusarium oxysporum f. sp. pisi trên đậu pea (Benhamou et al, 1996); nấm Verticillium albo-atrum và Rhizoctonia solani trên khoai tây (Nowak et al, 1995); Chuyên ngành Vi sinh vật học 13 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Rhizoctonia solani trên khoai tây (Pleban et al, 1995) và lúa (Krishnamurthy và Gnanamnickam, 1997)… Chất kháng sinh đã được tìm thấy trên vi khuẩn nội sinh phân lập từ khoai tây chống lại nấm Fusarium sambucinum, F. avenaceum, F. oxysporum, Rhizotonia solani và từ bắp chống lai nấm Fusarium miniliformis (Hinton và Bacon, 1995). 2.2.4 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp Theo nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học Trung Quốc, hiện nay người ta đã phân lập được trên dưới 200 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá như Azospirillum, Klebsiella…nhưng trong đó phải kể đến 2 chi có khả năng kháng khuẩn đó là Bacillus và Pseudomonas. a. Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiêm mao. Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,... nhưng chủ yếu là từ đất nơi mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N. Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ,... Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình với nhiệt độ tối ưu là 30 -45oC, nhưng cũng có nhiều loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC . Đa số Bacillus sinh trưởng ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2-6 như Bacillus acidocaldrius. Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, trong bảo vệ môi trường, … Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: Chuyên ngành Vi sinh vật học 14 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học  Trường Đại học Cần Thơ Bacillus subtilis Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Robert Koch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 .Chúng được gọi là trực khuẩn cỏ khô vì nó phân bố nhiều trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô. Chúng phân hủy pectin và polysaccaride ở mô thực vật và góp phần gây nên các nốt trên củ khoai tây. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính acid ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hư hỏng bánh mì. Phần lớn thông tin chúng ta có về đặc điểm sinh học, hóa sinh, di truyền của các vi khuẩn Gram dương khác đều nhận được từ việc nghiên cứu Bacillus subtilis. Chúng là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3-5) x 0,6 µm. Chúng phát triển riêng rẽ như những sợi đơn bào ít khi kết chuỗi sợi. Khuẩn lạc khô, vô màu hay xám nhạt, có thể màu trắng hơi nhăn hoặc tạo ra lớp màng mịn lan trên bề mặt thạch, mép nhăn hoặc lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis sinh trưởng tốt nhất ở 36oC- 50oC, tối đa khoảng 60 oC. Là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6- 0,9µm. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi. Chúng là một thể nghỉ sinh ra vào cuối thời kỳ sinh trưởng phát triển của vi khuẩn. Chúng không có khả năng trao đổi chất nên có thể sống được vài năm đến vài chục năm, thậm chí đến 200- 300 năm. Vi khuẩn Bacillus subtilis được xem là vi sinh vật điển hình vì có những đặc tính tiêu biểu không gây hại nên đây là một trong những vi khuẩn được sử dụng để sản xuất enzyme và các hóa chất đặc biệt như: amylase, protease, inosine, ribosides, acid amin, subtilisin. Ngoài ra nhờ khả năng bám dính proton lên bề mặt mà B. subtilis có thể loại bỏ được chất thải phóng xạ như Thorium (IV) và Plutonium (IV). (Sevdalina Todorova and Lubka Kozhuharova, 2010) Chuyên ngành Vi sinh vật học 15 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học  Trường Đại học Cần Thơ Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn” . Tế bào của nó khá lớn khoảng gấp hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2- 1,5)µm có thể đến 2 µm, dài từ 312µm, ở các ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen). Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7- 1,0) µm, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 đến 1,5 µm. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào. Khuẩn lạc tròn đều không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, trông giống giọt bạch lạp, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzyme tương tự B. subtilis, do đó nó cũng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp.  Bacillus amyloliquefaciens Bacillus amyloliquefaciens là trực khuẩn gram dương, hình que, di động, kích thước 0,7- 0,9 x1,8- 3m, nội bào tử ( 0,6- 0,8 x 1- 1,4m), là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí, phát triển tối ưu ở pH=7, NaCl không cần thiết cho sự tăng trưởng. Nhiệt độ giới hạn 15- 50o C, nhiệt độ tối ưu 30- 40oC. Hình 2: Bacillus amyloliquefaciens (*Nguồn: http://www.visualphotos.com/image/1x8467158/bacillus_amyloliquefaciens_sem. Ngày 17-11-2013). Chuyên ngành Vi sinh vật học 16 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học  Trường Đại học Cần Thơ Bacillus cereus Hình 3: Bacillus cereus (*Nguồn: http://bacillus-cereus.blogspot.com/. Ngày 17-11-2013) Đây là loài có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, Bacillus mycoides, Bacillus thuringiensis. Bào tử của chúng phát tán khắp nơi, trong đất, không khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng. Chúng được áp dụng để sản xuất kháng sinh. Tế bào Bacillus cereus dày, kích thước (1- 1,5) x (3- 5)µm, có khi dài hơn, chúng đứng riêng rẽ hay xếp chuỗi. Bào tử hình bầu dục kích thước 0,9 x (1,2- 1,5)µm nằm lệch tâm, tế bào chất của nó chứa các hạt và không bào. Khuẩn lạc của chúng phẳng, khá khuếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm. Theo nghiên cứu của Swetha Sunkar, C Valli Nachiyar, (2012) trên cây bứa mủ vàng (Garcinia xanthochymus), Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng vi khuẩn E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi và Klebsiella pneumonia.  Bacillus polymyxa Bacillus polymyxa là vi khuẩn gram dương, có khuẩn lạc vô màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhầy, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy. Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6- 1) x (2- 7) µm, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh.Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chuyên ngành Vi sinh vật học 17 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng (1,7- 2,6) µm, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccaride trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kiềm và những môi trường có tính acid yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất kháng sinh polymyxin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược. b. Vi khuẩn Pseudomonas Pseudomonas là vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và cả trong cơ thể các động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học. Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là gram âm, tế bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lý là dị dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định nitrogen. Một số chủng Pseudomonas có ảnh hưởng quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển thực vật như tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật như: auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng trong đất ở một số loài như: Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae ( Glickmann et al, 1998; Suzuki et al, 2003; Xie et al, 1996). Khả năng phân giải phosphat. Trong rác ủ, phospho tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác nhau. Phospho được tích luỹ trong rác khi động thực vật chết đi, những hợp chất phospho hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất phospho vô cơ khó tan. Do đó phospho tồn tại ở hai dạng: phospho hữu cơ và phospho vô cơ. Vi sinh vật hòa tan lân hữu cơ chủ yếu thuộc hai chi: Bacillus và Pseudomonas. Các loài có khả năng phân giải mạnh là B. megatherium, B. mycoides và Pseudomonas sp. Trong số các loài Pseudomonas spp, P. fluorescens là được chú ý nghiên cứu hơn hết, vì ngoài khả năng đối kháng với 10 loại mầm bệnh phát sinh từ đất, nó còn có khả năng kích thích sự phát triển của cây trồng (Nguyễn Trọng Thể, 2004). Chuyên ngành Vi sinh vật học 18 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học  Trường Đại học Cần Thơ Pseudomonas fluorescens: Pseudomonas fluorescens là loài trực khuẩn, Gram âm, có đơn hoặc tùng mao, sống hiếu khí bắt buộc nhưng một số dòng có khả năng sử dụng nitrate thay thế oxy làm chất nhận electron cuối cùng trong quá trình hô hấp tế bào. Chúng có cơ chế trao đổi chất cực kỳ linh hoạt giúp chúng sống được cả trong đất và trong nước. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Pseudomonas fluorescens là 25- 30oC. Hình 4: Vi khuẩn Pseudomonas fluorescens (*Nguồn:http://www.quorumtech.com/image-gallery/low-angle-rotary-shadowing-images, ngày 20/07/2013) Đến nay, người ta vẫn chưa biết được chính xác cơ chế kiểm soát sinh học của Pseudomonas fluorescens, một số giả thuyết được đưa ra như sau: thứ nhất người ta cho rằng chúng kích thích tính kháng tập thể của cây, giúp cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh thực sự. Thứ hai là chúng cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ như tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe. Cuối cùng chúng có thể tạo ra các hợp chất đối kháng với các vi sinh vật khác, chẳng hạn như các loại kháng sinh thuộc họ phenazine hoặc hydrogen cyanide. Theo Sivamani et al (1987) cho rằng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có thể được dùng như biện pháp sinh học, là tác nhân chống lại Pseudomonas solanserum gây bệnh héo moko và vi khuẩn Xanthomonas campestris. Chuyên ngành Vi sinh vật học 19 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ c. Vi khuẩn Azospirillum Azospirillum là vi khuẩn Gram âm, có khả năng chuyển động, có dạng hình que ngắn, cong hoặc hình chữ S (như Azospirillum lipoferum). Đây là vi khuẩn có khả năng tổng hợp IAA, khả năng cố định đạm, hòa tan lân và một số chất dinh dưỡng khác. Vào năm 1923, Beijerinck phân lập được nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn và đã được Becking (1963) phát hiện lại. Đến năm 1976, Döbereiner và Day mô tả về sự liên hợp của những vi khuẩn này với các cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau. Sau đó các vi khuẩn này được phân thành giống mới và được gọi là Azospirillum (Tarrand et al, 1978). Các loài Azospirillum biểu hiện sự phân bố sinh thái vô cùng rộng lớn và được gắn liền với sự đa dạng to lớn của cây trồng (Van Berkum và Bohlool, 1980). Trong những năm 1984 – 1985, người ta đã phát hiện nhiều loài của giống Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar ( Leptochloa fusca ) (Reinhold et al, 1986). Trong đó các vi khuẩn xâm nhập vào bên trong nhu mô rễ có khả năng cố định đạm, hòa tan lân ở dạng khoáng khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Seshadri et al, 2000), sản xuất kích thích tố thực vật (Broek và Vanderleyden, 1995), hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangaraijan et al, 2003). d. Vi khuẩn Klebsiella Vi khuẩn Klebsiella thuộc Gram âm, dạng hình que, ít chuyển động, có khả năng kết nang thành bào xác, kỵ khí không bắt buộc, sống tự do trong đất hoặc có khả năng xâm nhập và nội sinh trong cây trồng. Klebsiella oxytoca có khả năng tổng hợp IAA từ tiền chất tryptophan là 30µg/mg trọng lượng khô, mức độ biểu hiện hoạt tính của nitrogenase trong phản ứng khử acetylene là khá cao. e. Vi khuẩn Azotobacter Năm 1966, Döbereiner phân lập được loài Azotobacter paspali từ các cây cỏ đang sinh trưởng trước phòng thí nghiệm của bà (Döbereiner, 1974). Sự khám phá ra vi khuẩn Azotobacter paspali là một bước quan trọng trong sự cố định đạm cộng sinh. Chuyên ngành Vi sinh vật học 20 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Đây là loài đặc hiệu cho Paspalum notatum và khoai lang. Tuy nhiên, khi Brown, (1976) theo dõi sự khử acetylene thì nhận thấy không phải lúc nào Paspanum notatum cũng được cộng sinh với sự có mặt của Azotobacter paspali ở vùng rễ. Bà cho rằng Azotobacter paspali cải thiện sự sinh trưởng của Paspanum notatum chủ yếu bằng việc tạo ra các auxin hơn là bằng sự cố định đạm. f. Vi khuẩn Enterobacter Vi khuẩn Enterobacter cũng thuộc nhóm γ – Proteobacteria , hầu hết là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que, sống kỵ khí không bắt buộc. Một số loài của vi khuẩn này sống ở vùng rễ hay nội sinh bên trong các mô thực vật có khả năng cố định đạm, là vi khuẩn kích thích sự sinh trưởng thực vật (Hwangbo et al, 2003) đã phân lập được loài Enterobacter intermedium từ vùng rễ của một số cây cỏ ở Triều Tiên, chúng có khả năng hòa tan các phosphate khó tan để cung cấp cho cây theo cơ chế acid hóa bằng cách sản xuất hợp chất 2 – ketogluconic acid. g. Vi khuẩn Burkholderia Vi khuẩn Burkholderia là vi khuẩn cố định đạm, Gram âm, dạng hình que ngắn, đường kính khoảng 1 m, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở đầu. Chúng sinh trưởng và phát triển trong điều kiện kỵ khí hoặc hiếu khí, trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất. Trong môi trường nuôi cấy, chúng tạo thành các khuẩn lạc màu trắng hoặc hơi vàng, đường kính khoảng 2- 4 mm, tròn, phẳng hoặc lài (Caballero Mellado et al, 2004). Vi khuẩn này có khả năng cố định đạm và tạo nốt sần trong những cây họ đậu nhiệt đới (Mounlin et al, 2001). Vi khuẩn Burkholderia sống cộng sinh với cây trồng và có khả năng cố định đạm, kích thích sự tăng trưởng của cây, hiện diện trong vùng rễ và rễ của nhiều loại cây như: bắp, mía, cà phê, lúa (Scarpella et al, 2003; Chen et al, 2006). Hiện nay người ta tìm được khoảng hơn 40 loài Burkholderia bao gồm vi khuẩn cố định đạm trong đất, rễ cây, đẩy mạnh các giai đoạn phát triển của cây (Coenye và Vadnamme, 2003). Chuyên ngành Vi sinh vật học 21 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 2.4 Trường Đại học Cần Thơ Một số vi khuẩn gây bệnh thường gặp. 2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli ( E. coli). Ngày nay, khi cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì điều mà họ quan tâm là vệ sinh ăn uống. Hằng năm có hàng trăm ca ngộ độc thực phẩm phải nhập viện, gây hậu quả nghiêm trọng đến sức khỏe của cộng đồng. Điều này không chỉ phổ biến ở Việt Nam mà ngay cả các nước khác trên thế giới cũng vậy. E. coli là một trong những nguyên nhân gây nên những bệnh nhiễm khuẩn nghiêm trọng. a. Sơ lược về E. coli E. coli là trực khuẩn dạng que ngắn, gram âm, kích thước dài hay ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy, trung bình 2- 3μm x 0,5μm, hai đầu tròn, có lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành nha bào. Trong bệnh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực hai đầu. Theo P. J. Quinn et al, (1994), E. coli có nhiều trong ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là động vật ăn cỏ, sống vài tuần đến vài tháng trong bụi, phân, nước, ngoài tự nhiên. Hầu hết chúng không gây hại cho người và động vật, giúp ổn định sinh lý đường ruột. Tuy nhiên cho đến nay đã phát hiện được 5 dòng có khả năng gây hại cho người và động vật là: - EAEC (Enteroaggregative E. coli), E. coli kết tạp ở ruột. - EHEC (Enterohemorrhagic E. coli), E. coli gây xuất huyết ở ruột. - EPEC (Enteropacthogenic E. coli), E. coli gây bệnh đường ruột. - ETEC (Enterotoxigenic E. coli), E. coli sinh độc tố ruột. - EIEC (Enteroinvasive E. coli), E. coli xâm lấn niêm mạc ruột. Hình 5: Vi khuẩn E. coli (*Nguồn: http://www.psmicrographs.co.uk/escherichia-coli--e--coli--bacteria/science-image/80013963c. Ngày 17-11-2013). Chuyên ngành Vi sinh vật học 22 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ b. Đặc điểm: Chúng tiết ra các độc tố tế bào (cytotoxin), các dòng vi khuẩn này có một plasmid có thề giúp chúng bám dính vào màng nhầy của ruột, gây tiêu chảy không có hoặc có máu và các hội chứng khác ở người. c. Cơ chế gây bệnh: Để gây bệnh trước hết vi khuẩn phải bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các nhân tố xâm nhập, vi khuẩn bám dính vào lớp tế bào biểu mô của thành ruột. Ở đây, chúng phát triển và nhân lên làm phá hủy các lớp tế bào biểu mô gây viêm ruột. Đồng thời sinh sản độc tố đường ruột enterotoxin gồm yếu tố chịu nhiệt làm tăng tính thấm xuất của tế bào thành ruột và phá hủy tế bào, yếu tố không chịu nhiệt sẽ tác động vào quá trình trao đổi muối, nước làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể chảy vào ống ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác động cơ học làm nhu động ruột đẩy nước và thức ăn gây nên hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột, chúng vào hệ bạch huyết, đến hệ tuần hoàn gây nhiễm trùng máu, chúng chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết làm cho cơ thể thiếu máu. Từ hệ thống tuần hoàn chúng theo các vi quản đến các tổ chức, cơ quan, ở đây chúng lại phát triển nhân lên lần thứ hai. Chúng phá hủy tế bào tổ chức gây viêm và sản sinh độc tố toxogenic và verotocin phá hủy tế bào tổ chức gây tụ huyết và xuất huyết. d. Triệu chứng: Sau khi sử dụng thực phẩm bị nhiễm E. coli thì trong vòng 24- 48h sẽ có các triệu chứng như đau bụng, đi ngoài phân lỏng từ 5- 15 lần/ngày có lẫn máu trong phân, đôi khi có buồn nôn, Nếu không được cấp cứu, xử trí kịp thời sẽ bị mất nước, điện giải, rối loạn thân nhiệt, hạ huyết áp và có thể tử vong. 2.4.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila). Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất giàu tiềm năng được thiên nhiên ưu đãi có lợi thế rất lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Trong những năm gần đây nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đã có những bước phát triển vượt bậc mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt cá tra là đối tượng nuôi chiến lược, thu lại nguồn ngoại tệ rất lớn. Tuy nhiên, do sự gia tăng quá mức của phong trào nuôi cá tra trong khi kỹ thuật của người nuôi chủ yếu dựa vào kinh nghiệm. Mặt khác do sự phát triển tự phát thiếu Chuyên ngành Vi sinh vật học 23 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ quy hoạch, mật độ thả nuôi và quản lý dịch bệnh còn hạn chế nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra gây thiệt hại cho người nuôi. Cá tra, cá basa và nhiều loại cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh phổ biến, các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi trường, dinh dưỡng. Bên cạnh đó, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila cũng là một loại bệnh phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm trên cá tra và cá basa nuôi bè. Bệnh xuất huyết gọi là bệnh đốm đỏ, có dấu hiệu bệnh lý bênh ngoài là xuất huyết trên gốc các vi và xoang miệng. Bên trong thấy xuất huyết ở cơ, ruột, mô mỡ, kèm theo những dấu hiệu khác như trương bụng hay lỡ loét ở gốc vi đuôi và vi hậu môn (Phan Văn Ninh et al, 1993). Bệnh xuất huyết gây tổn thất cho người nuôi về sản lượng và chất lượng sản phẩm khi xuất bán. Một số nghiên cứu về A. hydrophila của Groberg (1978) khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi giống đã kết luận tỷ lệ chết thường cao ở 20,5 oC và 17oC, tỷ lệ chết thấp hơn ở 15 oC và 12oC, còn ở 9 oC hay thấp hơn nữa thì cá chết rất ít hoặc không chết (Roselynn and Stevenson, 1988). Theo báo cáo của Rahman et al, (2000), thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá vàng (Carassius auratus) bằng 4 cách: tiêm ở bụng (mật độ vi khuẩn 3x104-3x10 8 CFU/ml), tiêm dưới da (8,5x10 4-8,5x108 CFU/ml), tiêm ở cơ (8x104-8x108 CFU/ml), và ngâm vi khuẩn (4,6x104-4,6x108 CFU/ml), sau khi so sánh kết quả gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm dưới da độc lực của vi khuẩn mạnh nhất với giá trị LD50 là 106,4 CFU/. Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2001) đã thí nghiệm gây cảm nhiễm 15 chủng A.hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn từ 10 3 đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2 lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có giá trị LD50 lần lược là 3,68x106 CFU/ml, 2,64x106 đến 4,52x10 6 CFU/ml và 1,96x106 đến 1,45x107 CFU/ml. Chuyên ngành Vi sinh vật học 24 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ A B Hình 6: Cá bị nhiễm A.hydrophila (Ghi chú: A: Cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ do vi khuẩn Aeromonas hydrophila có các đốm đỏ, vẩy rụng, gốc vây xuất huyết; B: Cá tra bị bệnh xuất huyết trên vây). (*Nguồn: http://tepbac.com/disease/full/31/Benh-nhiem-trung-do-vi-khuan-Aeromonas-di-dong-o-dong-vatthuy-san.htm. Ngày 17-11-2013) Sơ lược về A.hydrophila A B Hình 7: Một số hình ảnh về Aeromonas hydrophila Ghi chú: A: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila có một chiên mao. Ảnh kính hiển vi điện tử (theo Bùi Quang Tề, 1998). (Nguồn: http://tepbac.com/disease/full/31/Benh-nhiem-trung-do-vi-khuan-Aeromonas-di-dong-o-dongvat-thuy-san.htm. Ngày 17-11-2013) B: Khuẩn lạc vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên môi trường CLED. (Nguồn: http://commons.wikimedia.org/wiki/File%3AAeromonas_hydrophila_on_CLED_Agar_-_Detail.jpg. Ngày 17-11-2013). Vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, Aeromonas là vi khuẩn Gram âm, di động, hình que, hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, khử nitrate, có khả năng lên men, oxidase dương tính. Chuyên ngành Vi sinh vật học 25 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Trong giống Aeromonas có hai nhóm: - Nhóm 1: Aeromonas không di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở nước lạnh. - Nhóm 2: Là các loài Aeromonas di động, bao gồm A. hydrophila, A. caviae, A. sobria. Đặc tính chung của ba loài vi khuẩn này là di động nhờ có 1 chiên mao. Vi khuẩn Gram âm dạng hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,5 x 1,0-1,5µm. Vi khuẩn yếm khí tuỳ tiện, Cytochrom oxidase dương tính, khử nitrate, không mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129... Tỷ lệ Guanin + Cytozin trong ADN là 57 - 63 mol%. 2.5 Tình hình nghiên cứu Diếp cá trong và ngoài nước 2.5.1 Trong nước Đến nay, Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu cây dược liệu nhưng phần lớn các nghiên cứu này chỉ tập trung khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cây dược liệu đặc biệt là Diếp cá thông qua các nghiên cứu điều trị lâm sàng. Khi canh tác cây dược liệu đa phần sử dụng phân bón hóa học hay phân bón hữu cơ. Tuy nhiên, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây dược liệu có khả kích thích cây phát tiển tốt thông qua khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp hormone tăng trưởng kích thích cây dược liệu phát triển, góp phần giảm các loại bệnh, giảm chi phí sản xuất và đặc biệt là khả năng tổng hợp các hoạt chất kháng khuẩn của chúng khi sống nội sinh với cây chưa được quan tâm nhiều. Vì vậy, việc nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật hữu ích này để phát triển cây dược liệu có hoạt tính kháng khuẩn hiệu quả hơn sẽ mang nhiều ý nghĩa quan trọng trong giai đoạn hiện nay. 2.5.2 Ngoài nước Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh trong cây dược liệu, đặc biệt là những cây dược liệu nhiệt đới như: cây Diếp cá (Houttuynia cordata T), cây Sài đất (Wedelia chinensis M), cây Diệp hạ châu (Phyllanthus urinaria L)… Bacillus cereus sống nội sinh có khả năng diệt các chủng E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi và Klebsiella pneumonia (Swetha Sunkar và C Valli Nachiyar, 2012) Chuyên ngành Vi sinh vật học 26 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Năm 2005, Salme Timmusk đã phân lập được Bacillus polymyxa sống nội sinh trên cây Arabidopsis thaliana có khả năng tổng hợp kháng sinh polymyxin kháng lại cả nấm và vi khuẩn. Theo nghiên cứu của Artidtaya Bhoonobtong et al, (2012) trên cây Phyllodium pulchellum, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt E.coli, Pseudomonas aeruginosa. Sheng Qin et al, (2009) đã phân lập được một số dòng vi khuẩn nội sinh như: Streptomyces specialis trong rễ cây Sedum sp, Pseudomonas alni trong lá cây Hoa môi (Callicarpa longifolia) cũng có khả năng kháng khuẩn. Gon et al, (2012) khi nghiên cứu công dụng của cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) cho biết dịch trích của cây này có khả năng diệt khuẩn Salmonella. Jee et al, (2010) cũng cho biết cây diếp cá có khả năng kháng khuẩn cũng như kháng viêm. Ngoài ra, các dịch trích cây diếp cá còn có thể giúp gia tăng số lượng tế bào lympho nhanh chóng giúp tăng tính miễn dịch của người (Busarawan et al, 2007). Tập đoàn vi sinh vật nội sinh hoặc sống ở vùng rễ cây trong đó có cây dược liệu có khả năng giúp cây tăng trưởng và đồng hóa tốt. Ngoài ra chúng còn có khả năng sản xuất trực tiếp các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) nhưng chúng cũng có khả năng kích thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất biến dưỡng trung gian như ở cây dược liệu chúng có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn rất tốt (Hardoim et al, 2008; Kaul et al, 2008). Từ kết quả mới đây của nhóm nghiên cứu do Giáo sư Renato Fani phụ trách cho thấy, các vi khuẩn nội sinh với các cây trồng như Lavandula officinalis, Echinacea purperea và Echinacea angustifolia có thể sản xuất ra các hợp chất có tính kháng khuẩn gây các bệnh như Cysitic Fibrosis (CF). Cây Diếp cá là một vị thuốc cổ truyền của Trung Quốc dùng để trị các bệnh nhiễm khuẩn. (http://www.wisegeek.com) Theo Kim et al (2007), cây Diếp cá có khả năng ức chế phát triển của vi khuẩn E.coli O157- H7 giống như kháng sinh beta-lactam. Theo Wangchauy và Chanpraser (2012), dịch trích cây Diếp cá cùng hai chất Isoquercetin và Rutin có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào bạch cầu vì vậy có thể sử dụng để điều trị bệnh ung thư máu. Chuyên ngành Vi sinh vật học 27 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Thời gian Từ tháng 06 đến tháng 08 năm 2013 tìm tài liệu và viết đề cương. Từ tháng 08 đến tháng 11 năm 2013 chuẩn bị vật liệu, vật dụng và tiến hành thực hiện đề tài. Tháng 12 bảo vệ luận văn. 3.1.2 Địa điểm Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Viện Nghiện cứu và Phát triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ. 3.1.3 Vật liệu Toàn bộ phần rễ, thân, lá của cây Diếp cá trồng ở tỉnh Hậu Giang Hai dòng vi khuẩn chỉ thị: E. coli từ phòng thí nghiệm SHPT, Viện NC và PT CNSH. A. hydrophila từ bộ môn Bệnh cá, Khoa Thủy Sản. 3.1.4 Dụng cụ và thiết bị Micropipet Đĩa petri, ống nghiệm Ống trữ mẫu Ống đong 10ml, 100ml Cốc thủy tinh 10ml, 100ml, 200ml Kẹp, kim cấy, que trải mẫu, đèn cồn Lame, Lammelle Máy Vortex Tủ cấy vô trùng Biosafe II – ESCO Nồi khử trùng nhiệt ướt Máy ly tâm Eppendorf Tủ ủ vi sinh vật Binder Máy lắc mẫu Chuyên ngành Vi sinh vật học 28 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Cân điện tử Kính hiển vi 3.1.5 Hóa chất và môi trường a. Hóa chất dùng để khử trùng mẫu - Nước cất vô trùng - Ethanol (cồn) 70% - Hydrogen peroxide (H2O2) 3% b. Hóa chất thí nghiệm Môi trường phân lập vi khuẩn: Bảng 1: Thành phần môi trường PDA Hóa chất Liều lượng (g/l) Khoai Tây 200 Dextrose 20 Agar 20 pH 5,6 ± 0,2 Môi trường khảo sát khả năng hòa tan lân Bảng 2: Thành phần môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) Hóa chất Liều lượng (g/l) Glucose 10 MgSO4.7H2O 0,25 Ca3(PO4)2 5 MgCl2.6H2O 5 KCl 0,2 (NH4)2SO4 Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 0,1 3ml Agar 20 pH 7,2 Chuyên ngành Vi sinh vật học 29 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Môi trường khảo sát khả năng tổng hợp NH4+ Bảng 3: Công thức môi trường đặc NFb (g/l) (Kirchhof và ctv, 1997). Hóa Chất Liều lượng Acid malic 5g K2HPO4 0,5g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,1g CaCl2 0,02 KOH 4,5g Dung dịch vi lượng 2ml Dung dịch Vitamine 1ml Dung dịch FeEDTA 1,64% 4ml Bromthymol blue 0,5% trong KOH 0,2N 2ml pH 6,8 Agar* 20g *: Môi trường bán đặc thêm 2g/1000ml. Bảng 4: Công thức dung dịch vi lượng. Dung dịch vi lượng Na2MoO4.2H2O 1g MnSO4.H2O 1,5g H2BO3 1,4g CuSO4 0,4g ZnSO4.7H2O 0,12g Thêm nước cất vào cho đủ 1000ml Chuyên ngành Vi sinh vật học 30 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 5: Công thức dung dịch Vitamin Dung dịch Vitamin Biotin 10mg Pyridyoxyl - HCl 20mg Thêm nước cất vào cho đủ 100ml Môi trường khảo sát khả năng kháng khuẩn Bảng 6: Thành phần môi trường LB ( Luria Betani). Hóa chất Liều lượng (g/l) Tryptone 10 Yeast extract 5 NaCl 10 Agar 20 pH 7,2 Bảng 7. Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Nước cất hai lần Buffer 10X Thể tích (μl) 11,75 2,5 MgCl2 2,0 dNTPS 4,0 DMSO 0,5 0,25 0,25 0,25 Mồi F Mồi R Taq DNA polymerase (5U/µl) ADN vi khuẩn 2,0 Tổng thể tích 25 Chuyên ngành Vi sinh vật học 31 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 3.2 Trường Đại học Cần Thơ Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh Trước khi thực hiện đề tài cần lấy mẫu đất sau đó chuyển về phòng thí nghiệm đo độ pH. Bảng 8: Số đo pH đất hai huyện Châu Thành và Phụng Hiệp STT Địa điểm pH 1 Đông Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 6,71 2 Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 7,87 a. Xử lý mẫu Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân và lá. Sau đó cắt rễ, thân và lá thành những đoạn nhỏ 2 - 3cm, rửa với nước cất rồi làm khô chúng bằng giấy thấm. Khử trùng bằng dung dịch ethanol 70% trong 30 giây và rửa lại với nước cất vô trùng. Tiếp tục khử trùng mẫu bằng dung dịch H2O2 3% (trong 3 phút) và rửa lại 4 lần bằng nước cất vô trùng. Lấy nước rửa lần thứ 4 cấy lên môi trường PDA để xem có vi khuẩn xuất hiện hay không. Nếu có khuẩn lạc phát triển thì cần phải khử trùng triệt để hơn để loại bỏ vi sinh vật có trong đất. b. Pha loãng mẫu Sau khi khử trùng mẫu xong, cắt chúng thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1ml nước cất vô trùng. Tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ 10-1, 10-2 … c. Phân lập vi khuẩn Lấy 10µL dung dịch nghiền ở trên cấy vào ống nghiệm chứa môi trường PDA bán đặc không bổ sung đạm rồi đem ủ ở 30 oC để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển. Sau khoảng 2 - 3 ngày nuôi, khi thấy môi trường nuôi vi khuẩn xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (pellicle) cách mặt môi trường bán đặc khoảng 3 - 6mm, lấy 5µL dung dịch nuôi vùng này cấy sang đĩa petri chứa môi trường PDA đặc có bổ sung Chuyên ngành Vi sinh vật học 32 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ kháng sinh rồi tiếp tục đem ủ ở 30 oC trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển. Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập nhiều lần để tách ròng vi khuẩn. Trữ vi khuẩn đã phân lập ròng trong môi trường PDA 3.2.2 Xác định các đặc tính của vi khuẩn nội sinh a. Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong môi trường nước cất vô trùng, tiếp tục đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau: - Nhỏ 10μL nước cất vô trùng lên kính mang vật. - Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. - Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật. - Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 góc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật không có bọt khí. Kích thước vi khuẩn được đo bằng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính như sau: - Thước trắc vi thị kính là một miếng kính tròn trên đó chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính. - Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10µm. - Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau: - Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thước. - Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho hai thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho Chuyên ngành Vi sinh vật học 33 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính. - Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. - Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thức sau: x N *10 m n x: Trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35 Ta có: - Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. - Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo. - Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm trong hai vạch này. - Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002). b. Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, ta tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn. Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau: - Hút 10μl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật. - Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật. Chuyên ngành Vi sinh vật học 34 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ - Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật. - Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước. - Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô. - Rửa lại bằng cồn 70 o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô. - Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đó để 1 phút. - Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của fushin. - Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước. - Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn có màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, có màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm. c. Xác định khả năng tổng hợp NH 4+ Nguyên tắc Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hóa là hypochlorite hình thành có phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982) Hóa chất: - Chuẩn bị dung dịch KCl : Hòa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất. - Stock (NH4+): Hòa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha loãng 40ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được dung dịch 2µg/ml Chuyên ngành Vi sinh vật học 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học - Trường Đại học Cần Thơ Thuốc thử phenol nitroprusside: hòa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0,5L. - Hypochloride buffer: hòa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5L. - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb lỏng Tiến hành thí nghiệm: - Cho 15ml môi trường lỏng NFb, vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121 oC trong 20 phút. - Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. * Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) Phương pháp định lượng: - Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hòa tan thêm nước cất vào đến 0,5L. - Pha buffer: cho 1ml NaOCl có nồng độ (5 – 5,25 %) và 5 g NaOH vào 0,5L nước cất. - Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 µg/ml • Đường chuẩn 0 µg/ml gồm có: 5ml H2O: 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử • Đường chuẩn 1 µg/ml gồm có: 4ml H2O: 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử • Đường chuẩn 2 µg/ml gồm có: 3ml H2O: 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử • Đường chuẩn 3 µg/ml gồm có: 2ml H2O: 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử • Đường chuẩn 4 µg/ml gồm có: 1ml H2O: 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử • Đường chuẩn 5 µg/ml gồm có: 0ml H2O: 5ml NH4+, 5ml buffer, 5 ml thuốc thử - Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn • Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. • Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyên ngành Vi sinh vật học 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học • Trường Đại học Cần Thơ Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD. • Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sóng 636nm, sau đó vẽ đồ thị trên Excel có thể tính được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn. d. Xác định khả năng hòa tan lân khó tan - Chuẩn bị môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) ( bảng 1) - Hút 5 µl vi khuẩn nhỏ lên bề mặt môi trường. - Ủ 30o C trong 12- 24h. - Quan sát khả năng tạo vòng halo. Đo đường kính halo và khuẩn lạc mỗi ngày - Khả năng hòa tan lân E được tính theo công thức E Ñöôøng kính halo  100 Ñöôøng kính khuaån laïc (C. NGUYEN và ctv, 1992) e. Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dòng vi khuẩn phân lập. Chuẩn bị - Chuẩn bị các dòng vi khuẩn đã tách ròng và môi trường NFb. - Cho 15 ml môi trường lỏng NFb, vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 20 phút. - Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuôi cấy các dòng vi khuẩn trên máy lắc 200 vòng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng) Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) 1. Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5 g FeCl3 trong 1 l H2SO4 10,8 M 2. Chuẩn bị phosphat buffer 200 ml gồm: A: KH2PO4 0,136 g/100 ml nước cất. B: K2HPO4 0,174 g/100 ml nước cất. Chuyên ngành Vi sinh vật học 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 3. Lấy 39 ml A, 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200 ml, chỉnh pH = 7 4. Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. 5. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút. 6. Hút cẩn thận 1 ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham. 7. Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hoàn toàn sau đó đo quang phổ OD ở bước sóng 530 nm. 8. Chuẩn bị đường chuẩn IAA: Cân 0,0016 g IAA thương mại hòa tan với 10 ml phosphat buffer được nồng độ là 160 µg/l. Sau đó pha loãng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 15; 20; 30; 40 µg/ml. 9. Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD có giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA có giá trị từ 0 – 40 µg/ml. 10. Kết quả đo OD các dòng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đó tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp. f.  Khảo sát khả năng kháng khuẩn Khảo sát khả năng kháng E. coli của các dòng vi khuẩn phân lập  Chuẩn bị môi trường LB ( Bảng 6)  Trải vi khuẩn gây bệnh E. coli lên bề mặt đĩa môi trường.  Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào vi khuẩn phân lập nuôi 1 ngày trong PDA lỏng vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn E. coli.  Ủ 30 o C trong 12- 24h.  Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn.  Tính hiệu quả kháng khuẩn theo công thức: C=b–a (Ngô Thị Phương Dung el al., 2011) Ghi chú: C: Đường kinh vòng vô khuẩn a: Đường kính khuẩn lạc b: Đường kính vòng sáng xung quanh khuẩn lạc. Chuyên ngành Vi sinh vật học 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học  Trường Đại học Cần Thơ Khảo sát khả năng kháng Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá của các dòng vi khuẩn phân lập  Chuẩn bị môi trường LB ( Bảng 6)  Trải vi khuẩn gây bệnh cá Aeromonas hydrophila lên bề mặt đĩa môi trường.  Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào vi khuẩn phân lập nuôi 1 ngày trong PDA lỏng vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt môi trường đã trải vi khuẩn A.hydrophila.  Ủ 30o C trong 12h – 24h.  Quan sát khả năng tạo vòng kháng khuẩn và tính hiệu quả kháng khuẩn. 3.2.3 Sử dụng kỹ thuật PCR nhận diện một số dòng vi khuẩn triển vọng. Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, thử nghiệm khả năng hòa tan lân và tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp IAA cao, có hoạt tính kháng khuẩn để thực hiện phương pháp PCR với mồi tổng cho vi khuẩn. Qui trình trích ADN nhanh theo phương pháp của Barberio và Fani (1998). - Cấy vi khuẩn từ ống trữ ròng lên đĩa Petri chứa môi trường LB. Ủ 24h trong tủ ủ ở 30°C. - Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và đều nhau cho vào tuýp Eppendorf - Cho bi vào từng tuýp Eppendorf và trộn đều dung dich trên máy ly tâm. - Ủ ở 95°C trong 10 phút (ủ trong water bath). - Lập tức đem ngâm đá nhanh trong 10 phút để phá vỡ tế bào của vi khuẩn - Ly tâm nhẹ hai lần. Thu được dịch trích ADN của vi khuẩn. - Đem trữ ở -20°C nếu chưa tiến hành quy trình PCR. - Nhận diện các dòng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR - Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) (Bảng 7). - Quy trình PCR - Biến tính DNA ở 95°C trong 5 phút. Chuyên ngành Vi sinh vật học 39 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ - Tiếp theo là 3 chu trình được gia nhiệt như sau: + 95°C trong 1 phút + 49°C trong 1 phút + 72°C trong 1 phút - Bước cuối cùng là 72°C trong 10 phút. - Sản phẩm PCR sau đó được trữ lạnh ở -20°C để điện di Điện di gel agarose sản phẩm PCR - Chuẩn bị gel nhỏ : (20ml) + Agarose (1%): 0,2g + TAE buffer (1X): 20ml - Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lò vi sóng (microwave) - Sau khi nấu để nguội khoảng 50 – 60°C, bổ sung EtBr 0,4μl - Rót gel vào khuôn - Sau khi rót gel vào khuôn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu. - Load mẫu: dùng Micropipet hút 10μl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10μl mẫu DNA vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng. - Điện di 60 phút ở 90V. Với cặp mồi 16SrRNA (Lane, 1991) Mồi xuôi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3 Chụp hình gel bằng máy chụp gep Bio – Rad. Bảng 9. Chu kỳ phản ứng PCR Bước phản ứng 1 2 3 3.2.4 Tên bước Biến tính Biến tính Gắn mồi Kéo dài Kéo dài Số lượng chu kỳ 30 Nhiệt độ (oC) 95 95 53 72 72 Thời gian 5 phút 1 phút 45 giây 90 giây 5 phút Xử lý kết quả Các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel, phần mềm Statgraphic và phần mềm Minitab. Chuyên ngành Vi sinh vật học 40 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập vi khuẩn Từ rễ, thân và lá của 14 cây Diếp cá thu được ở 2 Huyện thuộc tỉnh Hậu Giang. 16 dòng vi khuẩn đã được phân lập. Các dòng vi khuẩn này phân bố ở cả trong rễ, thân và lá của cây Diếp cá. Trong đó, có 7 dòng vi khuẩn được phân lập từ rễ, 5 dòng vi khuẩn từ thân và 4 dòng vi khuẩn từ lá. Chúng có chung đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Khi được cấy trong môi trường bán đặc, vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle (màu trắng trên môi trường NFb), cách bề mặt môi trường 3-7mm. A B Vòng pellicle Hình 8: A: Cây Diếp cá tiến hành phân lập vi khuẩn (Hình chụp ngày 1/8/2013). B: Vòng pellicle xuất hiện trên môi trường Nfb 4.2 Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. Các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA từ rễ, thân và lá của cây Diếp cá thu được ở các huyện khác nhau được ký hiệu là R, T và L kèm theo thứ tự các dòng (Bảng 10). Chuyên ngành Vi sinh vật học 41 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 10. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA STT Dòng Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu 1 R1 Rễ Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 2 R2 Rễ Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 3 R3 Rễ Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 4 R4 Rễ Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 5 R5 Rễ Đông Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 6 R6 Rễ Đông Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 7 R7 Rễ Đông Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 8 T1 Thân Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 9 T2 Thân Long Thạnh Phụng Hiệp, Hậu Giang 10 T3 Thân Đông Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 11 T4 Thân Đông Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 12 T5 Thân Đông Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 13 L1 Lá Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 14 L2 Lá Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 15 L3 Lá Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 16 L4 Lá Đông Phước A, Châu Thành, Hậu Giang. Hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập được đều phát triển nhanh, khuẩn lạc vi khuẩn có thể nhìn rõ chỉ sau 18-20 giờ ủ ở nhiệt độ 30oC. Trong các khuẩn lạc được tạo thành từ 16 dòng vi khuẩn đã phân lập được có 7 khuẩn lạc màu trắng đục (chiếm 43,75 %), 4 khuẩn lạc màu vàng (25%) và 5 khuẩn lạc màu vàng nhạt (chiếm 31,25%). Kích thước khuẩn lạc của vi khuẩn sau 20 giờ cấy trên môi trường PDA (không N, không yeast extract) và ủ ở 30 oC rất đa dạng, dao động trong khoảng 0,2- 4mm (Bảng 11). Tất cả các dạng khuẩn lạc của 16 dòng vi khuẩn đều có dạng tròn. Chúng chỉ khác nhau ở dạng bìa, độ nổi. Các dạng khuẩn dạng bìa nguyên, độ nổi mô chiếm 75% còn lại 25% là các khuẩn lạc dạng bìa răng cưa, lài. Chuyên ngành Vi sinh vật học 42 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 11. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA STT Dòng Màu Sắc Hình Dạng Đường kính(mm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 T1 T2 T3 T4 T5 L1 L2 L3 Trắng đục Vàng nhạt Vàng Trắng đục Vàng Trắng đục Vàng Vàng nhạt Trắng đục Vàng nhạt Vàng nhạt Trắng đục Trắng đục Vàng nhạt Trắng đục Tròn, bìa răng cưa, độ nổi lài, khô Tròn, bìa nguyên, độ nổi lài, khô Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa răng cưa, độ nổi lài, khô Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi lài, khô Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy 2,3 2,0 2,0 0,8 1,0 2,0 0,4 0,3 3,0 0,9 2,0 4,0 2,5 2,5 0,2 16 L4 Vàng Tròn, bìa nguyên, độ nổi mô, nhầy 3,0 B A1 A2 C D Hình 9: Hình dạng một số khuẩn lạc vi khuẩn phân lập. (A1: Dòng R3; A2: Dòng R5; B: Dòng T3; C: Dòng L1; D: Dòng R1) Chuyên ngành Vi sinh vật học 43 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Mười sáu dòng vi khuẩn phân lập được đa số có dạng hình que, ngoài ra còn có dạng cầu đơn và cầu đôi. Trong đó, vi khuẩn có dạng que ngắn chiếm 13/16 dòng (81,25 %), 1 dòng dạng que dài, 1 dòng dạng cầu đơn và 1 dòng dạng cầu đôi (mỗi dạng chiếm 6,25%). Trong tổng số 16 dòng vi khuẩn, 14 dòng gram âm (87,5%) và 2 dòng gram dương (12,5%). Ba dòng vi khuẩn không có khả năng chuyển động (18,75%) và 13 dòng có thể di chuyển (81,25%). Chiều dài vi khuẩn dao động trong khoảng 0,6845,501 µm, chiều rộng khoảng 0,684- 1,368 µm (Bảng 12). Bảng 12. Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Dòng R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 T1 T2 T3 T4 T5 L1 L2 L3 L4 Hình dạng Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que dài Cầu đơn Que ngắn Que ngắn Cầu đôi Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Chiều Dài (µm) 1,368 1,710 1,710 1,710 1,539 1,026 5,301 0,684 1,710 3,420 1,881 3,078 2,052 1,539 1,539 1,368 Chiều Rộng (µm) 1,026 1,197 1,368 1,026 1,197 0,855 1,197 0,684 1,026 1,197 0,855 0,855 1,197 0,684 1,026 1,197 Chuyển động* + + + + + + + + + + + + + Gram** + + - Ghi chú: * : - không chuyển động, + có chuyển động ; **:- gram âm, + gram dương. A B B Hình 10: Hình dạng và đặc điểm nhuộm gram của một số dòng vi khuẩn A: Vi khuẩn hình que, gram dương dòng R1; B: Vi khuẩn dạng cầu đôi, gram âm dòng T4. Chuyên ngành Vi sinh vật học 44 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 4.3 Trường Đại học Cần Thơ Khả năng cố định đạm Khảo sát khả năng cố định đạm dựa vào lượng NH4+ (ammonium) do vi khuẩn sinh ra (phương pháp so màu Indophenol Blue), kết quả là tất cả các dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng sinh ra NH4+. Nhìn chung, ở ngày thứ 2, đã có NH4+ được sinh ra nhưng còn thấp. Lượng NH4+ (ammonium) cao nhất ở ngày thứ 4 và giảm mạnh vào ngày thứ 6. Mười sáu dòng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Diếp cá phân lập được trên môi trường PDA được chia thành 3 nhóm để khảo sát lượng ammonium do vi khuẩn tạo ra ở ngày 2, 4 và 6 (sau khi chủng trong môi trường NFb lỏng, không N, không Yeast extract). Hình 11: Đường chuẩn đo nồng độ NH4+ 4.3.1. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 1nhóm vi khuẩn sống nội sinh phân lập từ rễ (R1- R7). Sau 2 ngày chủng, các dòng vi khuẩn R1- R7 đã tạo ra được một lượng ammonium nhất định. Lượng ammonium nhiều nhất ở dòng R5, khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại (Bảng 13). Chuyên ngành Vi sinh vật học 45 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 13: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Rễ STT Dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 1 R1 0,087 e 0,553 bc 0,311 b 2 R2 0,216 c 0,540 c 0,292 b 3 R3 0,224 c 0,566 b 0,344 a 4 R4 0,121 d 0,478 e 0,267 c 5 R5 0,431 a 0,633 a 0,314 b 6 R6 0,082 e 0,507 d 0,292 b 7 R7 0,353 b 0,569 b 0,338 a 3,614 1,698 4,107 CV% (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) Tiếp tục đến ngày thứ 4, dòng R5 vẫn là dòng vi khuẩn tạo ra lượng ammonium nhiều nhất với 0,633µg/ml khác biệt có nghĩa so với các dòng còn lại. Xếp ngay sau đó là 2 dòng R7 và R3 với lượng ammonium lần lượt là 0,569µg/ml và 0,566µg/ml; 2 dòng vi khuẩn này nhìn chung khác biệt không ý nghĩa với nhau nhưng khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại. R1 cũng là dòng vi khuẩn đáng được chú ý với lượng ammonium tạo ra là 0,553µg/ml so với tổng thể các dòng vi khuẩn nội sinh ở rễ. Ngày thứ 6, do nguồn dinh dưỡng cạn kiệt nên vi khuẩn sử dụng ammonium do chính chúng tạo ra, vì thế, lượng ammonium được sinh ra từ các dòng vi khuẩn đều giảm. Lượng ammonium do dòng R4 tạo ra là thấp nhất (0,267 µg/ml), khác biệt có ý nghĩa so với các dòng khác. Lượng ammonium còn lại nhiều nhất sau 6 ngày chủng là do dòng R3 và R7 tạo ra. 4.3.2. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 2nhóm vi khuẩn sống nội sinh phân lập từ thân (T1 – T5). Tương tự các dòng vi khuẩn ở nhóm 1, đa số các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 đều đã tạo ra được một lượng ammonium nhất định sau 2 ngày chủng và lượng ammonium này tăng cao nhất vào ngày thứ 4 rồi giảm vào ngày thứ 6 (Bảng 14 ). Chuyên ngành Vi sinh vật học 46 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Nếu so sánh với các dòng vi khuẩn ở nhóm 1 thì các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 tạo ra lượng ammonium ở ngày 2 có phần thấp hơn (dưới 0.2µg/ml). Ở ngày 2, lượng ammonium được tạo ra cao nhất do dòng T5 tổng hợp với 0,229µg/ml khác biệt có ý nghĩa so với 4 dòng vi khuẩn còn lại. Mặc dù trong những ngày đầu các dòng vi khuẩn phân lập từ thân cố định đạm còn ít nhưng đến ngày thứ 4 lượng ammonium được tạo ra tăng đáng kể. Cao nhất vẫn là dòng T5 với lượng ammonium tạo ra là 0,657µg/ml ( gấp gần 3 lần so với ngày 2). Dòng T4 là dòng có lượng ammonium khác biệt không ý nghĩa so với dòng T5 với lượng ammonium tổng hợp là 0,644µg/ml, đây cũng là dòng vi khuẩn đáng được chú ý do ngày thứ 2 dòng vi khuẩn này tổng hợp ammonium ít nhất( chỉ 0,059µg/ml), nhưng sang ngày 4 thì cùng với dòng T5 có lượng ammonium cao nhất (tăng gần 11 lần). Nhìn chung ở ngày 4 tất cả các dòng đều tổng hợp được lượng ammonium trên 0,5µg/ml so với lượng ammonium rất thấp trong ngày 2. Đến ngày thứ 6, lượng ammonium bắt đầu giảm. Cao nhất là dòng T2 và thấp nhất là dòng T3. Bảng 14: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Thân. STT Dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 1 T1 0,183 b 0,522 c 0,294 b 2 T2 0,172 b 0,538 b 0,341 a 3 T3 0,123 c 0,512 c 0,278 b 4 T4 0,058 d 0,644 a 0,314 ab 5 T5 0,229 a 0,657 a 0,300 b 4,213 1,336 7,315 CV% (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) Chuyên ngành Vi sinh vật học 47 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 4.3.3. So sánh khả năng tạo ammonium của các dòng vi khuẩn nhóm 3nhóm vi khuẩn sống nội sinh phân lập từ Lá (L1 – L4). Ở ngày thứ 2, các dòng vi khuẩn trong nhóm 3 cũng chỉ tạo được lượng ammonium rất thấp, thấp nhất là dòng L4 với 0,035µg/ml, lượng ammonium cao nhất của ngày này là dòng L1 với 0,144µg/ml khác biệt có ý nghĩa so với 3 dòng còn lại nhưng lượng ammonium cũng không đáng kể. Dòng L2, với lượng ammonium tạo ra được là 0,876µg/ml vào ngày thứ 4, là dòng vi khuẩn đứng đầu về khả năng sinh ammonium, khác biệt có ý nghĩa so với các dòng trong nhóm. Ngoài ra L2 cũng là dòng có lượng ammonium tăng cao nhất (tăng gần 13 lần so với ngày 2). Đến ngày 6, tất cả các dòng vi khuẩn đều có luọng ammonium giảm dần. Giảm nhiều nhất là dòng L2 (giảm 2,61 lần so với ngày 4). Nguyên nhân có thể do vi khuẩn đã sử dụng hết chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp lượng ammonium cao nhất vào ngày 4 nên đến ngày 6, để duy trì sự sống vi khuẩn bắt buộc phải sử dụng lượng ammonium đó. Ở ngày này, lượng ammonium ở các dòng vi khuẩn L1, L2, L4 nhìn chung tương đương nhau, và cao nhất là dòng L3 với 0,408µg/ml khác biệt có ý nghĩa so với các dòng trong nhóm. (Bảng 15). Bảng 15: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn phân lập từ Lá. STT Dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 1 L1 0,144 a 0,574 b 0,333 b 2 L2 0,069 c 0,876 a 0,336 b 3 L3 0,113 b 0,566 b 0,408 a 4 L4 0,035 d 0,545 c 0,311 b 6,552 1,192 4,854 CV% (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) Chuyên ngành Vi sinh vật học 48 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 4.3.4. So sánh khả năng tạo ammonium của 8 dòng vi khuẩn triển vọng. Sau khi khảo sát khả năng sinh ammonium của 16 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA, nhận thấy có 8 dòng vi khuẩn có lượng ammonium tạo ra được nhiều hơn các dòng khác. Các dòng vi khuẩn này có khả năng sản sinh ra được một lượng ammonium nhất định ở ngày thứ 2, lượng ammonium tăng cao nhất vào ngày thứ 4 và giảm ở ngày thứ 6 (Bảng 16). Bảng 16: Khả năng tổng hợp Amonium của các dòng vi khuẩn triển vọng. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 Dòng R3 R5 R7 T2 T5 L1 L2 L3 CV% Ngày 2 0,224 c 0,431 a 0,353 b 0,172 c 0,229 d 0,144 e 0,069 g 0,113 f Ngày 4 0,567 d 0,633 c 0,569 d 0,538 b 0,657 e 0,574 d 0,876 a 0,566 d Ngày 6 0,344 b 0,314 cd 0,338 bc 0,341 d 0,300 bc 0,333 bc 0,336 bc 0,408 a Trung bình 0,378 d 0,459 a 0,420 b 0,351 c 0,395 e 0,350 e 0,427 b 0,362 e 3,657 1,060 5,074 2,055 (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) R5, T5 và L2 là 3 dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp ammonium tốt nhất trong 16 dòng vi khuẩn hiện tại với lượng ammonium đều trên 0,6µg/ml vào ngày thứ 4. đáng chú hơn cả là dòng L2, mặc dù ở ngày 2 chỉ tạo ra lượng ammonium 0,069µg/ml thấp nhất so với các dòng còn lại, nhưng lượng ammonium bắt đầu tăng đột biến khi sang ngày thứ 4 ( tăng gần 13 lần lên 0,876µg/ml), khác biệt có ý nghĩa so với các dòng khác. Nhìn chung, các dòng vi khuẩn triển vọng có sự phát triển và tổng hợp amonium tương đối đồng đều, các dòng có lượng ammonium ở ngày thứ 4 cao nên lượng ammonium trung bình cao và ngược lại. Tóm lại, các dòng vi khuẩn phân lập được trên môi trường PDA có khả năng tổng hợp ammonium trong môi trường không N. Mặc dù là lượng ammonium tạo ra là không đáng kể nhưng cũng chúng cũng sinh ra được một lượng ammonium vào ngày thứ 2 sau khi chủng. Lượng ammonium này tăng mạnh vào ngày thứ 4 và giảm rõ rệt Chuyên ngành Vi sinh vật học 49 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ sau 6 ngày. Tất cả các dòng vi khuẩn này đều tạo ra được lượng ammonium rất ít trong những ngày đầu. Nguyên nhân có thể là do các dòng vi khuẩn này cần một khoảng thời gian để thích ứng với môi trường không dinh dưỡng. 4.4 Hoạt tính hòa tan lân khó tan. Để khảo sát khả năng và hoạt tính hòa tan lân khó tan, tất cả 16 dòng vi khuẩn được thử nghiệm bằng cách cấy nhỏ giọt trên môi trường lân không tan ( NBRIP). Sau 1 ngày ủ ở 30 oC. Có tất cả 15/16 dòng phát triển khuẩn lạc, tuy nhiên chỉ có 4 dòng xuất hiện vòng halo, còn lại duy nhất nhất 1 dòng không xuất hiện khuẩn lạc (Bảng 17- Hình 12). Sau 2 ngày, 4/16 dòng tạo halo ngày trước có kích thước halo tăng nhanh (tăng cao nhất là 15mm ở dòng T3). 10 dòng phát triển khuẩn lạc ngày trước cũng bắt đầu tạo halo. Sau 3 ngày, đường kính vòng halo của 4 dòng tạo vòng sáng trong ngày 1 đã ngừng tăng ( R2, R4, T1, T3). Riêng 10 dòng tạo vòng halo trong ngày 2 vẫn còn tiếp tục tăng nhưng không mạnh. Trong ngày này, đường kính vòng halo cao nhất do dòng T3 tạo ra với 15mm, đây cũng là dòng cao nhất vào ngày 2, hiệu quả hòa tan lân cũng xếp hàng đầu kể cả trong 3 ngày ủ lẫn trung bình hiệu quả. Riêng dòng L4, tuy trong 2 ngày đầu vẫn chưa tạo được vòng halo, nhưng khi đến ngày 3 thì dòng này bắt đầu tăng đường kính khuẩn lạc lên 8mm ( cao nhất trong 15 dòng phát triển khuẩn lạc) và vòng halo bắt đầu xuất hiện với 12mm. Nguyên nhân có thể là do trong 2 ngày đầu vi khuẩn đang thích nghi với môi trường mới nên hàm lượng lân được hòa tan còn rất ít nên chưa tạo được vòng sáng. Bên cạnh những dòng vi khuẩn có thể tạo được vòng halo thì có những dòng không làm sáng môi trường nhưng khuẩn lạc vẫn phát triển ( T2, T4). Nguyên nhân có thể do đây là những dòng vi khuẩn cần hàm lượng phosphate rất ít để phát triển nên chúng chỉ hòa tan đủ lượng phosphate cần thiết cho sự sống nên sẽ không tạo được vòng halo. Dòng R3 là dòng vi khuẩn duy nhất trong 16 dòng vi khuẩn không có khả năng sống trên môi trường nên không có khả năng hòa tan lân. Khả năng hòa tan lân của các dòng vi khuẩn được trình bày ở Bảng 14. Chuyên ngành Vi sinh vật học 50 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 17: Khả năng hòa tan lân khó tan của 16 dòng vi khuẩn phân lập được. Thời gian ủ STT Dòng vi khuẩn a b E a b E a b E 1 R1 6 0 0 6 12 200 6 12 200 133,33 2 R2 6 10 166,67 6 14 233,33 6 14 233,33 211,11 3 R3 0 0 x 0 0 x 0 0 x x 4 R4 6 11 183.33 6 11 183,33 6 11 183,33 183,33 5 R5 5 0 - 5 8 160 6 9 150 103,33 6 R6 6 0 - 6 11 183,33 6 12 200 127,78 7 R7 6 0 - 6 9 150 6 9,5 158,33 102,78 8 T1 6 8 133,33 6 12 200 6 12 200 177,78 9 T2 4 0 - 4 0 - 4 0 - - 10 T3 6 14 233,33 6 15 250 6 15 250 244,44 11 T4 6 0 - 6 0 - 6 0 - - 12 T5 6 0 - 6 10 166,67 6 11 183,33 116,67 13 L1 6 0 - 6 9 150 6 11 183,33 111,11 14 L2 6 0 - 7 10 142,86 7 10 142,86 95,24 15 L3 6 0 - 6 11 183,33 6 11,5 191,67 125 16 L4 6 0 - 6 0 - 8 12 150 50 1 ngày 2 ngày 3 ngày Ē Ghi chú: a: Đường kính khuẩn lạc (mm); b: Đường kính vòng halo(mm); E: Hiệu quả hòa tan lân(%); Ē: Hiệu quả hòa tan lân trung bình sau 3 ngày ủ(%). “x”: Không có khả năng hòa tan lân; “-“: Hoạt tính hòa tan lân không đáng kể. B C D A Hình 12: Hiệu quả hòa tan lân của một số dòng vi khuẩn phân lập. (A: Dòng T4; B: Dòng R5 ; C: Dòng T1 ; D: Dòng R4) Chuyên ngành Vi sinh vật học 51 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 4.5 Trường Đại học Cần Thơ Khả năng tổng hợp IAA Tất cả 16 dòng vi khuẩn phân lập đều có khả năng tổng hợp IAA sau 2 ngày chủng. Lượng IAA do các dòng khác nhau tổng hợp là khác nhau và thời điểm tạo ra nhiều IAA tập trung vào ngày thứ 4. Hình 13: Đường chuẩn đo nồng độ IAA 4.5.1. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 1- nhóm vi khuẩn sống nội sinh phân lập từ rễ (R 1 – R7 ). Các dòng vi khuẩn của nhóm 1 có khả năng tổng hợp ra nồng độ IAA cao nhất vào ngày thứ 4. Lượng IAA được tạo ra cao nhất ở ngày thứ 4 là do dòng R4, R5 và R3. Tuy R4 là dòng có lượng IAA cao nhất vào ngày thứ 4 (12,02µg/ml) nhưng từ ngày 2 đến ngày 4, R5 mới là dòng có lượng IAA tăng nhiều nhất ( từ 1,559µg/ml tăng gần 7 lần lên 10,31µg/ml), (Bảng 18). Đến ngày thứ 6, lượng IAA bắt đầu giảm mạnh. Dòng R3 có lượng IAA thấp nhất ở ngày này chỉ với 0,229µg/ml khác biệt có ý nghĩa so với các dòng còn lại. Lượng IAA đáng kể nhất là dòng R6 với 1,340µg/ml, kế đến là dòng R5 với 0,993µg/ml. Chuyên ngành Vi sinh vật học 52 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 18: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ. STT Dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 1 R1 3,225 a 3,64 e 0,473 e 2 R2 2,588 b 3,099 e 0,611 e 3 R3 1,265 e 8,324 c 0,229 f 4 R4 2,539 b 12,018 a 0,681 c 5 R5 1,559 d 10,306 b 0,993 b 6 R6 1,755 c 3,369 f 1,340 a 7 R7 0,725 f 4,315 d 0,507 de 5,207 1,772 9,869 CV% (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) 4.5.2. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 2- nhóm vi khuẩn sống nội sinh phân lập từ thân (T1 – T5 ) Tương tự như các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ, các dòng vi khuẩn ở nhóm 2 cũng tạo được lượng IAA thấp vào ngày thứ 2, cao nhất vào ngày thứ 4 và giảm mạnh vào ngày 6 (Bảng 19). Ở ngày 2, có 2 dòng vi khuẩn với lượng IAA tổng hợp được bằng nhau và bằng 2,539µg/ml, đó là dòng T1 và T5, lượng IAA do 2 dòng này tổng hợp được là cao nhất và khác biệt có ý nghĩa thống kê với các dòng vi khuẩn khác. Tuy nhiên, đến ngày 4 thì dòng T5 là 1 trong hai dòng vi khuẩn có lượng IAA cao nhất và cao hơn hẳn so với dòng T1 với lượng IAA tổng hợp được là 10,26µg/ml (tăng 4,04 lần). Trong khi các dòng T1, T2 và T3 có lượng IAA tổng hợp được khá thấp thì dòng T4 lại có lượng IAA cao nhất vào ngày 4 với 12,74µg/ml khác biệt có ý nghĩa với các dòng khác. Đáng chú ý hơn cả ở dòng T4 này là vào ngày 2, lượng IAA tổng hợp được rất thấp chỉ 1,461µg/ml (thấp thứ 2 trong 5 dòng phân lập từ thân) lại tăng đột biến vào ngày 4. Ngày 6 với lượng IAA giảm dần ở các dòng. Cao nhất ở ngày 6 này là dòng T5 với lượng IAA còn lại là 4,604µg/ml và thấp nhất là dòng T1. Chuyên ngành Vi sinh vật học 53 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 19: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân. STT Dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 1 T1 2,539 a 3,144 e 0,333 e 2 T2 1,951 b 3,865 d 1,271 d 3 T3 1,265 d 5,937 c 2,799 b 4 T4 1,461 c 12,74 a 2,417 c 5 T5 2,539 a 10,26 b 4,604 a 5,417 2,70 4,707 CV% (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) 4.5.3. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nhóm 3- nhóm vi khuẩn sống nội sinh phân lập từ lá (L1 – L4 ). Trong khi dòng L3 và L4 tạo ra lượng IAA thấp vào ngày 2, tăng cao vào ngày 4 và giảm vào ngày 6 thì dòng L1 có lượng IAA cao nhất vào ngày 2 và giảm dần sau đó. L2 cũng là dòng khác biệt với lượng IAA cao nhất vào ngày 6 ( Bảng 20). Ở dòng L1, 5,676µg/ml là lượng IAA dòng này tạo ra ở ngày 2 và là lượng IAA cao nhất vào ngày này. Đến ngày 4 và ngày 6, lượng IAA giảm đều theo thời gian và còn 2,938µg/ml vào ngày 6, đây cũng là lượng IAA còn lại cao thứ 2 trong ngày này. Trong 2 ngày, ngày 2 và ngày 4 thì dòng L2 có lượng IAA thấp nhất và giảm cho đến ngày 4 chỉ còn 0,667µg/ml. Tuy nhiên, đến ngày 6 thì lượng IAA đột nhiên lại tăng nhanh lên 4,674µg/ml nên dòng này trở thành dòng có lượng IAA cao nhất vào ngày 6 và trở thành dòng khá đặc biệt trong nhóm 3. Nguyên nhân có thể là do ở ngày 2 vi khuẩn đã tổng hợp được IAA cho sự phát triển, đến ngày 4 mật số vi khuẩn quá cao dẫn đến sự cạnh tranh nên một số chết đi và lượng IAA cũng giảm. Khi mật số ổn định đến ngày 6 thì vi khuẩn bắt đầu tăng cường tổng hợp IAA và lượng IAA tăng cao. Ở nhóm 3, đáng chú ý nhất là dòng L4 với lượng IAA ngày 2 nằm trong số 2 dòng vi khuẩn tổng hợp IAA kém nhất, tuy nhiên đến ngày 4, đây là dòng vi khuẩn tổng hợp IAA nhiều nhất với 13,55µg/ml khác biệt có ý nghĩa với 3 dòng còn lại. Chuyên ngành Vi sinh vật học 54 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 20: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá. STT 1 2 3 4 Dòng L1 L2 L3 L4 CV% Ngày 2 5,676 a 1,314d 4,549 b 2,147 c Ngày 4 4,135 c 0,667 d 6,522 b 13,552 a Ngày 6 2,938 b 4,674 a 2,452 c 2,521 c 5,417 2,70 4,707 (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) 4.5.4. So sánh khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng. Trong tổng số 16 dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA, có 8 dòng vi khuẩn tổng hợp được lượng IAA cao hơn các dòng còn lại. Hầu hết các dòng vi khuẩn tạo ra IAA nhiều nhất vào ngày thứ 4 (Bảng 21). Ở ngày 4, lượng IAA được tổng hợp nhiều nhất bởi dòng L4 (13,55µg/ml), T4 (12,74µg/ml) và R4 (12,02µg/ml), chứng tỏ đây là 3 dòng có khả năng tổng hợp IAA tốt nhất. Đáng chú ý là dòng T5, tuy lượng IAA vào ngày 4 không cao nhất nhưng sang ngày 6 thì đây chính là dòng có lượng IAA còn lại nhiều nhất (4,604µg/ml), lượng IAA vào ngày 2 và ngày 4 cũng nhiều hơn các dòng trong nhóm. Bảng 21: Khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn triển vọng. STT Dòng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6 Trung bình 1 R3 1,265 f 8,324 e 0,229 f 3,273 g 2 R4 2,539 c 12,02 c 0,681 e 5,079 d 3 R5 1,599 e 10,31 d 0,993 d 4,286 f 4 T4 1,461 ef 12,74 b 2,417 c 5,539 c 5 T5 2,539 c 10,26 d 4,604 a 5,802 b 6 L1 5,676 a 4,135 g 2,938 b 4,250 f 7 L3 4,549 b 6,522 f 2,452 c 4,508 e 8 L4 2,147 d 13,55 a 2,521 c 6,072 a 4,812 1,552 3,910 1,767 CV% (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) Chuyên ngành Vi sinh vật học 55 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Tóm lại, cả 16 dòng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp Indole-3-Acetic Acid (IAA) mà không cần bổ sung Tryptophan vào môi trường nuôi. Tổng hợp được lượng IAA nhiều nhất ở ngày thứ 4 và giảm rõ rệt sau 6 ngày chủng. Tuy nhiên, có một dòng tạo ra lượng IAA nhiều nhất vào ngày thứ 2 rồi giảm dần theo thời gian. Dòng này thường không tổng hợp được nhiều IAA. Bên cạnh các dòng triển vọng với lượng IAA tổng hợp nhiều nhất vào ngày 4 và trung bình, vẫn còn một dòng vi khuẩn với lượng IAA tăng dần và cao nhất vào ngày 6 (dòng L2), mặc dù đây không phải là dòng vi khuẩn có lượng IAA trung bình nằm trong những dòng triển vọng nhưng với sự phát triển khác biệt nên có khả năng đây là dòng vi khuẩn với khả năng tổng hợp IAA lâu dài và có sức sống tốt. Chuyên ngành Vi sinh vật học 56 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học 4.6 Trường Đại học Cần Thơ Khả năng kháng khuẩn. Khả năng kháng khuẩn được khảo sát trên 2 loại vi khuẩn gây bệnh : E. coli gây bệnh đường tiêu hóa và Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá. 4.6.1 Khả năng kháng vi khuẩn E. coli Từ 16 dòng vi khuẩn thí nghiệm, kết quả đã chọn ra 3 dòng vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn E. coli mạnh ( Bảng 22) Bảng 22 : Hiệu quả kháng E.coli của 3 dòng vi khuẩn triển vọng Ngày 1 STT Ngày 2 Ngày 3 Dòng a/b C a/b C a/b C 1 R1 7,5/12,1 4,65 9,5/14 4,9 9,8/14,7 5,0 2 T5 6,0/9,0 3,00 6,5/9,5 3,0 7,0/10,0 3,0 3 L1 6,0/9,5 3,55 6,3/10,3 4,0 6,9/11,3 4,4 *Ghi chú: a/b: Đường kính khuẩn lạc/Đường kính vòng sáng (mm/mm) C: Đường kính vòng vô khuẩn (mm). Sau 1 ngày ủ ở nhiệt độ 30 oC, tất cả 16 dòng vi khuẩn đều phát triển khuẩn lạc, tuy nhiên chỉ 3/16 dòng vi khuẩn thí nghiệm có phản ứng lại với vi khuẩn E. coli. Kết quả là xuất hiện vòng sáng xung quanh khuẩn lạc của 3 dòng R1, T5 và L1 (Hình 15). Sau 2 ngày, 3 dòng vi khuẩn trên tiếp tục phát triển, đường kính vòng vô khuẩn tăng dần. Đến ngày thứ 3, đường kính vòng vô khuẩn vẫn tiếp tục lan rộng nhưng không nhiều. Duy chỉ có dòng T5 là sau 3 ngày vòng vô khuẩn không tăng nhưng nhìn tổng thể thì cả 3 dòng đều có hoạt tính kháng khuẩn tăng theo ngày do đường kính vòng sáng tăng đều theo đường kính khuẩn lạc (Hình 14). Chuyên ngành Vi sinh vật học 57 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Đường kính vòng vô khuẩn(mm) 6 5 5,0a 4,9a 4,7a 4,4b 4,0b 4 3,6b 3,0c 3,0c 3,0c 3 R1 T5 L1 2 1 0 1 2 3 Ngày Hình 14: Hiệu quả kháng E. coli của các dòng vi khuẩn triển vọng theo thời gian. (Ghi chú: Các trị trung bình có các mẫu tự trên cột giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) 77 Hình 15: Hoạt tính kháng E. coli của một số dòng vi khuẩn phân lập. Ghi chú: 77: Dòng T4 không có hoạt tính kháng E. coli. 67: Dòng R1; 75: Dòng T5; 78: Dòng L1 ( các dòng có hoạt tính kháng E. coli với vòng sáng xung quanh khuẩn lạc). Chuyên ngành Vi sinh vật học 58 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Khi xét khả năng kháng với E. coli của 3 dòng triển vọng thì hiệu quả kháng khuẩn cao nhất là dòng R1 ở cả 3 ngày ủ, đây là dòng vi khuẩn tạo được đường kính vòng vô khuẩn cao nhất (4,65mm ở ngày 1) khác biệt có ý nghĩa so với 2 dòng còn lại. Tóm lại, đây là 3 dòng vi khuẩn triển vọng trong 16 dòng vi khuẩn phân lập. Khả năng kháng lại với E. coli chứng tỏ trong quá trình phát triển, 3 dòng vi khuẩn này đã tạo ra một hoặc nhiều chất có tác dụng tiêu diệt E. coli. 4.6.2 Khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Có tất cả 5/16 dòng vi khuẩn được thử nghiệm có khả năng kháng vi khuẩn Aeromonas hydrophila. Kết quả sau 1 ngày ủ ở 30 oC cho ta thấy rõ vòng sáng vô khuẩn xung quanh khuẩn lạc. ( Hình 16 + 17) Khi so sánh hoạt tính kháng với A. hydrophila giữa 5 dòng vi khuẩn triển vọng sau 3 ngày, dòng R7 và T2 là 2 dòng có hoạt tính kháng A. hydrophila mạnh nhất, đường kính vòng vô khuẩn của 2 dòng vi khuẩn này bằng nhau và bằng 7,8mm ở ngày Đường kính trung bình vòng vô khuẩn (mm). 3 khác biệt có ý nghĩa so với các dòng khác. 9 a 8 a 7 ab 6 5 a 3 2 1 ab a 4 b b b bc R1 T2 T5 ab bc c b R7 b L1 0 1 2 3 Ngày Hình 16: Hiệu quả kháng vi khuẩn A. hydrophila của các dòng vi khuẩn triển vọng theo thời gian. (Ghi chú: Các trị trung bình có các mẫu tự trên cột giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) Nhìn chung, sau 3 ngày, đường kính khuẩn lạc và đường kính vòng sáng đều tăng dần. Điều này chứng tỏ trong quá trình phát triển vi khuẩn có thể đã tạo ra được hợp chất kháng sinh đối kháng với vi khuẩn gây bệnh và tiêu diệt chúng. Khi khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học 59 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ lạc phát triển, chất kháng vi khuẩn gây bệnh liên tục đươc tổng hợp làm cho đường kính vòng vô khuẩn ngày càng tăng dần. 73 Hình 17: Hoạt tính kháng A. hydrophila của một số dòng vi khuẩn phân lập. Ghi chú: 73: Dòng T1 không có hoạt tính kháng khuẩn A. hydrophila 66: Dòng R7; 75: Dòng T5; 76: Dòng T2 (Các dòng vi khuẩn có khả năng kháng A. hydrophila với vòng sáng rất rõ xung quanh khuẩn lạc). Tóm lại, trong tổng số 16 dòng vi khuẩn phân lập, 3 dòng kháng với E. coli, 5 dòng kháng với A. hydrophila và 3 dòng kháng cả E. coli và A. hydrophila. Mặc dù có những dòng kháng A. hydrophyla nhưng không thể kháng lại E. coli, tuy nhiên kết quả khảo sát cho thấy rằng khả năng ức chế A. hydrophyla mạnh hơn khả năng ức chế E. coli gấp nhiều lần, đặc biệt là những dòng chỉ kháng A. hydrophila. Đây có thể là những dòng vi khuẩn triển vọng để nghiên cứu và ứng dụng phòng chống và điều trị các bệnh do A. hydrophila gây ra trên cá trong tình hình nuôi cá ở ĐBSCL hiện nay. Chuyên ngành Vi sinh vật học 60 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Tổng hợp kết quả các thí nghiệm trước, R5 và L2 tổng hợp ammonium cao nhất, L4 và T5 tổng hợp mạnh IAA, R1, T5 và R7 là ba dòng vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Các dòng vi khuẩn với thế mạnh khác nhau phân bố ở cả hai huyện, tuy nhiên, số lượng dòng vi khuẩn triển vọng phân lập từ cây Diếp cá trồng ở Huyện Châu Thành nhiều hơn. Vì thế độ pH trung tính thích hợp cho vi khuẩn phát triển (6,7- 7,0). Những dòng vi khuẩn phân bố ở Huyện Châu Thành là những dòng vi khuẩn triển vọng cho sự phát triển của cây Diếp cá khi được trồng ở những vùng đất pH 6,6- 7,0. 4.7 Kết quả PCR và định danh những dòng vi khuẩn triển vọng. Tổng hợp kết quả của các thí nghiệm trước, xét theo các tiêu chí khác nhau về khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA và khả năng kháng khuẩn. R1, T5 và L1 là 3 dòng vi khuẩn triển vọng được lựa chọn để nhận diện bằng kỹ thuật PCR. 1 2 3 4 1500bp Hình 18: Phổ điện di DNA các dòng vi khuẩn Ghi chú: 1: Thang chuẩn 1kp. Kích thước mẫu ở 1500bp. 2: Dòng R1; 3: Dòng T5; 4: Dòng L1. Chuyên ngành Vi sinh vật học 61 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Từ kết quả giải trình tự, chúng tôi đã sử dụng công cụ BLAST của NCBI để so sánh trình tự của các dòng vi khuẩn nghiên cứu với các dòng vi khuẩn từ cơ sở dữ liệu của ngân hàng gen NCBI, dựa trên vùng gen 16SrRNA. Kết quả cho thấy. Kết quả giải trình tự dòng R1: Dòng R1 có tỉ lệ đồng hình 99% với trình tự 16SrRNA của vi khuẩn Bacillus subtilis. Bacillus megaterium và B. subtilis được phát hiện là vi khuẩn nội sinh trong cây cà phê (Fernando et al., 2005). Ngoài ra, Bacillus subtilis đã được báo cáo là vi khuẩn nội sinh trong cây dẻ, giúp cây chống lại bệnh cháy lá do nấm Cryphonectria parasitica gây ra (Wilhelm et al., 1998). Bacillus subtilis còn có khả năng chống lại một số nấm và vi khuẩn như: Alternaria solani, Botrytis cinerea Pseudomonas syringae pv. Tomato, Xanthomonas campestris (Sevdalina Todorova và Lubka Kozhuharova., 2010). Theo nghiên cứu của Hilda Rodríguez và Reynaldo Fraga, (1999), Phytase là enzyme do Bacillus subtilis tổng hợp để hòa tan lân trong đất giúp cây trồng phát triển tốt. Chuyên ngành Vi sinh vật học 62 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Kết quả giải trình tự dòng T5: Dòng T5 có tỉ lệ đồng hình 99% với trình tự 16SrRNA của vi khuẩn Enterobacter cloacae. Theo nghiên cứu của A.A. Hassen et al, (2007), Enterobacter cloacae là vi khuẩn có khả năng cố định đạm nội sinh ở cây lúa. Nghiên cứu của J. K. Ladha et al, (1983) cũng cho kết quả tương tự. Ngoài ra, Enterobacter cloacae cũng có khả năng tiết ra các chất kháng sinh hoặc chất độc để chống lại nấm Pythium ultimum. (Nelson et al, 1986), bên cạnh đó, Enterobacter cloacae cũng có khả năng tổng hợp Acid phosphatase hòa tan lân trong đất góp phần thúc đẩy tăng trưởng cho cây trồng (Hilda Rodríguez và Reynaldo Fraga, 1999). Kết quả giải trình tự dòng L1: Chuyên ngành Vi sinh vật học 63 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Dòng L1 có tỉ lệ đồng hình 99% với trình tự 16SrRNA của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens. Theo nghiên cứu của Artidtaya Bhoonobtong et al, (2012) trên cây Phyllodium pulchellum, vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens sống nội sinh có khả năng diệt E.coli, Pseudomonas aeruginosa và một số nấm gây bệnh. Ngoài ra, Bacillus amyloliquefaciens được phân lập từ lá dâu tằm (Mulberry Leaves) có khả năng kháng lại nấm và vi khuẩn như: Rosellinia necatrix, Pyricularia oryzae, Agrobacterium tumefaciens, và Xanthomonas campestris pv. Campestris. (Yoshida et al, 2001). Chuyên ngành Vi sinh vật học 64 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Mười sáu dòng vi khuẩn đã được phân lập từ cây Diếp cá. Trong đó, 7 dòng phân lập được từ rễ, 5 dòng từ thân và 4 dòng từ lá. Tất cả 16 dòng vi khuẩn này đều có khả năng cố định đạm và tổng hợp IAA. 15 dòng có khả năng hòa tan lân. Ba dòng vi khuẩn R1, T5 và L1 vừa kháng được với E.coli vừa kháng được với Aeromonas hydrophila với hoạt tính khá cao được nhận diện lần lượt là các dòng vi khuẩn Bacillus subtilis, Enterobacter cloacae và Bacillus amyloliquefaciens với mức độ tương đồng 99%. 5.2 Đề nghị Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn trên các vi khuẩn hoặc nấm gây bệnh khác. Chuyên ngành Vi sinh vật học 65 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Quang Tề, 1998. Giáo trình bệnh của Động Vật Thủy Sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2002. Giáo trình thực tập vi sinh vật. Nxb Đại Học Cần Thơ, Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp, 2008. Giáo trình vi sinh chuyên sâu, Trường Đại học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp, 2010. Sách chuyên khảo vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria), Trường Đại học Cần Thơ. Đặng Thị Huỳnh Mai, 2001. Phân lập vi sinh vật hòa tan lân khó tan. Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ, 4: 353- 357. Đoàn Nhật Phương, 2001. Xác định LD50 và thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio). Luận văn tốt nghiệp, Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ. Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nxb Y Học, Hà Nội. Giang Cẩm Tú, 2011. Phân lập và xác định khả năng tổng hợp amonium của một số dòng vi khuẩn từ đất vùng rễ lúa ở các tỉnh Vĩnh Long, Bến Tre và Trà Vinh. Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Sinh học. Khoa Khoa học – Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Lai Chí Quốc, Nguyễn Thị Dơn và Cao Ngọc Điệp, 2012. Tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn cố định đạm (có khả năng hòa tan lân và kali) phân lập từ vật liệu phong hóa của vùng núi đá hoa cương tại Núi Cấm, tỉnh An Giang. Tạp chí Khoa học, trường Đại học Cần Thơ, 24a: 60- 69. Lăng Ngọc Dậu, Nguyễn Thị Xuân Mỵ và Cao Ngọc Điệp, 2007. Khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sinh tổng hợp IAA của vi khuẩn Azospirillium lipoferum. Tuyển tập báo cáo Khoa học Hội nghị toàn Quốc 2007 Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Quy Nhơn 10-08-2007. NXB KH-KT, trang 445- 448. Lê Hoàng Thắng, 2008. Phân lập một số dòng vi khuẩn cố định đạm Azospirillum trên lúa. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Chuyên ngành Vi sinh vật học 66 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Ngô Thị Phương Dung, Huỳnh Thị Yến Ly và Huỳnh Xuân Phong, 2011. Phân Lập và Tuyển Chọn Vi Khuẩn Lactic Có Khả Năng Sinh Chất Kháng Khuẩn. Tạp chí khoa học, Trường Đại Học Cần Thơ, 19a: 176- 184. Ngô Tự Thành và Bùi Thị Việt Hà (2007). Nghiên cứu hoạt tính enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng ứng dụng chúng trong xử lý nước thải. Tập chí khoa học ĐHQGHN, Khoa tự nhiên và công nghệ 25(2009): 101-106. Nguyễn Hữu Hiệp, 2008. Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh để sản xuất phân vi sinh ở qui mô thí nghiệm cho cây mía trồng tại Tỉnh Sóc Trăng. Tạp chí nghiên cứu khoa học Cần Thơ, 8: 149- 157. Nguyễn Thị Thu Hà, Hà Thanh Toàn và Cao Ngọc Điệp, 2009. Phân lập và khảo sát đặc tính của những dòng vi khuẩn nội sinh trong một số cây cỏ chăn nuôi. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 7(2): 241- 250. Nguyễn Thị Nga, 2008. Ảnh hưởng của vi khuẩn cố định đạm và vi khuẩn hòa tan lân lên năng suất lúa ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long. Luận văn thạc sĩ chuyên ngành Sinh thái học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Trọng Thể, 2004. Chọn lọc và sử dụng vi khuẩn đối kháng Pseudomonas fluorescens để phòng trừ bệnh do nấm Rhizoctonia solani và Sclerotium rolfsii gây hại trên cây bông vải và cây cà chua. Luận văn thạc sĩ khoa nông nghiệp, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. Phan Văn Ninh, Nguyễn Thị Phi Phượng, Phạm Thị Thu Hồng và Trần Châu Phương Tuấn., 1993. Điều tra vi sinh vật gây bệnh cá nuôi bè, nghiên cứu biện pháp phòng trị. Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học, 32 trang. Sở Nông Nghiệp An Giang. Võ Thị Tú Anh, 2011. Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan cả lân và kali từ vật liệu phong hóa ở Núi Dài – huyện Tri Tôn – tỉnh An Giang. Luận văn tốt nghiệp Đại học, chuyên ngành Sinh học, khoa Khoa học – Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Chuyên ngành Vi sinh vật học 67 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Tiếng Anh A. V. Sturz, B. R. Christie and J. Nowak, 2000. Bacterial Endophytes: Potential Role in Developing Sustainable Systems of Crop Production. Plant Sciences, 19 (1): 1- 30. A.A. Hassen , J. Xu and J. Yang, 2007. Growth Conditions of Associative NitrogenFixing Bacteria Enterobacter cloace in Rice Plants. Agricultural Journal, 2: 672675. Ann Vande Broek and Jos Vanderlayden, 1995. The Role of Bacterial Motility, Chemotaxis, and Attachment in Bacteria- Plant Interactions. The American Phytopathologycal Society, 8 (6): 800- 810. Artidtaya Bhoonobtong, Sasiphimol Sawadsitang, Sirirath Sodngam and Wiyada Mongkolthanaruk, 2012. Characterization of Endophytic Bacteria, Bacillus amyloliquefacien for antimicrobial Agents Production. International Conference on Biological and Life Sciences, 40: 6- 11. Benhamou N., BClanger RR., and Paulitz T, 1996. Pre- inoculation of RI T-DNAtransformed pea roots with Pseudomonas jluorescens inhibits colonization by Pythium ultimum Trow: an ultrastrucural and cytochemical study. Planta, 199: 105 - 117. Barbara Reinhold, Thomas Hurek, Ernst-Georg Niemann and Istvan Fendrik, 1996. Close Association of Azospirillum and Diazotrophic Rods with Different Root Zones of Kallar Grass. Applied and Environmental Microbiology, 52 (3): 520526. Beattie GA, and Lindow SE, 1995. The secret life of foliar bacterial pathogens on leaves. Annu Rev Phytopathol, 33:145- 172. Chen C., Bauske EM., Musson G., Rodriguez-Kgbana R., and Kloepper JW, 1995a. Biological control of Fusarium wilt on cotton by use of endophytic bacteria. Biol. Control, 5: 83 -91. Chuyên ngành Vi sinh vật học 68 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Clémence Chaintreuil, Eric Giraud, Yves Prin, Jean Lorquin, Amadou Bâ, Monique Gillis, Philippe de Lajudie, and Bernard Dreyfus, 2000. Photosynthetic Bradyrhizobia Are Natural Endophytes of the African Wild Rice Oryza breviligulata. Applied and Environmental Microbiology, 66 (12): 5437- 5447. Diego Harari and P. Sikivie, 1988. Gravitational field of a global string. The American Physical Society new Journal, 37 (12): 3438- 3440. Döbereiner, 1974. Nitrogen fixing bacteria in the rhizosphere. In The Biology of Nitrogen Fixation. Ed. A Quispel. :86- 120. E. Sivamani and S. S. Gnanamanickam, 1988. Biological control ofFusarium oxysporumf.sp.cubense in banana by inoculation with Pseudomonas fluorescens. Plant and Soil, 107 (1): 3- 9. Elmerich, Baca. B, 2007. Microbial production of plant hormones, in: C. Elmerich, W.E. Newton (Eds.), Associative and Endophytic Nitrogen-Fixing Bacteria and Cyanobacterial Associations, Springer, The Netherland, :113-143. Enrico Scarpella, Saskia Rueb and Annemarie H. Meijer, 2003. The RADICLELESS1 gene is required for vascular pattern formation in rice. Development, (130): 645- 658. Hallmann, 2001. Plant interactions with endophytic bacteria. In: Jeger MJ, Spence NJ. Biotic interactions in plant pathogen interactions. CAB international, Wallingford, pp 87- 119. Hilda Rodríguez and Reynaldo Fraga, 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion. Biotechnology Advances 17: 319- 339. Hinton DM, Bacon CW, 1995. Enterobacter cloacae is an endophytic symbiont of corn. Mycopathologia 129:117–125. Hong Xie, J.J. Pasternak and Bernard R. Glick, 1996. Isolation and Characterization of Mutants of the Plant Growth- Promoting Rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 That Overproduce Indoleacetic Acid. Current Microbiology, 32 (2): 6771. Chuyên ngành Vi sinh vật học 69 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Hoon Hwangbo, Ro Dong Park, Yong Woong Kim, Yo Sup Rim, Keun Hyung Park, Tae Hwan Kim, Jang Sun Suh and Kil Yong Kim, 2-Ketogluconic Acid Production and Phosphate Solubilization by Enterobacter intermedium. Current Microbiology, 47 (2): 87- 92. Hu Ru Xiao and Xie Da Ping, 2008. The Study on Endophytic Antibacterial Microbes from Houttuynia cordata. The Master's thesis of Biochemistry and Molecular Biology, Hunan Agricultural University. J. C. Biswas, J.K. Ladha and F.B. Dazzo, 2000. Rhizobia Inoculation Improves Nutrient Uptake and Growth of Lowland Rice. Soil Science Society of America Journal, 64 (5): 1644- 1650. J. Hallmann, A. Quadt-Hallmann, W. F. Mahaffee and J. W. Kloepper, 1997. Bacterial endophytes in agricultural crops. Revue canadienne de microbiologie, 43 (10): 895- 914. James G. Daly, Roselynn M and W. Stevenson, 1990. Characterization of the Renibacterium salmoninarum haemagglutinin. Applied and Environmental Microbiology, 136 (5): 949- 953. Jeffrey J. Tarrand, Noel R. Krieg and Johanna Döbereiner, 1978. A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group, genus, Azospirillum gen. nov. with and two descriptions of species, Azospirillum a new lipoferum (Beijerinck) comb. nov. And Azospirillum brasilense sp. nov.. Revue canadienne de microbiologie, 24 (8): 967- 980. Jesús Caballero-Mellado, Janette Onofre-Lemus, Paulina Estrada-de los Santos and Lourdes Martínez-Aguilar, 2007. The Tomato Rhizosphere, an Environment Rich in Nitrogen-Fixing Burkholderia Species with Capabilities of Interest for Agriculture and Bioremediation. Applied and Environmental Microbiology, 73 (16): 5308- 5319. Chuyên ngành Vi sinh vật học 70 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Johan Goris, Paul De Vos, Jesús Caballero-Mellado, Joonhong Park, Enevold Falsen, John F. Quensen III, James M. Tiedje and Peter Vandamme, 2004. Classification of the biphenyl- and polychlorinated biphenyl-degrading strain LB400T and relatives as Burkholderia xenovorans sp. nov.. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51 (5): 1677- 1681. Kim GS, Kim DH, Lim JJ, Lee JJ, Han DY, Lee WM, Jung WC, Min WG, Won CG, Rhee MH, Lee HJ and Kim S., 2008. Biological and Antibacterial Activities of the Natural Herb Houttuynia cordata Water Extract against the Intracellular Bacterial Pathogen Salmonella within the RAW 264.7 Macrophage. 31 (11): 2012- 2017. Koga J, Adachi T and Hidaka H, 1991. Molecular cloning of the gene for indolepyruvate decarboxylase from Enterobacteria cloacae. Mol Gen Gennet, 226: 10- 26. L. A. O'Sullivan and E. Mahenthiralingam, 2005. Biotechnological potential within the genus Burkholderia. Applied Microbiology, 41 (1): 8- 11. Ladha JK, Barraquio WL and Wanatabe I, 1983, Isolation and Identification of nitrogen- fixing Enterobacter cloacae and Klebsiella planticola associated with rice plant. Can. J. Microbial, 29: 1301- 1308. Lane, D.J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Stackebrandt, E., and Goodfellow, M., eds., John Wiley and Sons, New York, NY, pp. 115-175. Lionel Moulin, Antonio Munive, Bernard Dreyfus and Catherine Boivin-Masson, 2001. Nodulation of legumes by members of the β- subclass of Proteobacteria. International Weekly Journal of Science, 411: 948- 950. Luis M. R. and P. W. Ludden, 2005. Maturation of nitrogenase: a Biochemical puzzle. Journal of Bacteriology, 187 (2): 405- 414.William G. Weisburg, Susan M. Barns, Dale A. Pelletier, and David J. Lane., 1991. 16S Ribosomal DNA Amplification for Phylogenetic Study. Journal Of Bacteriology, 173 (2): 697703. Chuyên ngành Vi sinh vật học 71 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ M. John Albert, M. Ansaruzzaman, Kaisar A. Talukder, Ashok K. Chopra, Inger Kuhn, Motiur Rahman, A. S. G. Faruque, M. Sirajul Islam, R. Bradley Sack and Roland Mollby, 2000. Prevalence of Enterotoxin Genes in Aeromonasspp. Isolated From Children with Diarrhea, Healthy Controls, and the Environment. Applied and Environmental Microbiology, 38 (10): 3785- 3790. Mano H and Morisaki H, 2008. Endophytic bacteria in the rice plant. Microbes environ 23: 109- 117. Michael H Glickman, David M Rubin, Olivier Coux, Inge Wefes, Günter Pfeifer, Zdenka Cjeka, Wolfgang Baumeister, Victor A Fried and Daniel Finley, 1998. A Subcomplex of the Proteasome Regulatory Particle Required for Ubiquitin-Conjugate Degradation and Related to the COP9-Signalosome and eIF3. Cell Press, 94 (5): 615- 623. Muthukumarasamy R., G. Revathi, S. Seshadri and C. Laskshminarsimhan, 2002. Gluconacetobacter diazotrophicus (Syn. Acetobacter diazotrophicus), a promising diazotrophic endophyte intropics. Curr Sci, 83: 137-145. Nelson EB, Chao Wl, Norton JM, Nash GT and Harman GE, 1986. Attachment of Enterobacter cloacae to hyphae of Pythium ultimum: possible role in the biological control of Pythium preemerence damping- off. Phytopathology 76: 327-335. Nicole Benhamou, 1996. Elicitor-induced plant defence pathways. Trend in Plant Science, 1 (7): 233- 240. Panchal H and S.S. Ingle, 2011. Isolation and Characterization of Endophytes From the Root of Medicinal Plant Chlorophytum borivilianum (Safed musli). Journal of Advances in Developmental Research, 2 (2): 205- 209. Pleban S., Ingel F., and Chet I, 1995. Control of Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii in the greenhouse using endophytic Bacillus spp. Eur. J. Plant Pathol. 101: 665 -672. Chuyên ngành Vi sinh vật học 72 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ P van Berkum and B B Bohlool, 1980. Evaluation of nitrogen fixation by bacteria in association with roots of tropical grasses.Evaluation of nitrogen fixation by bacteria in association with roots of tropical grasses. Microbiological Review, 44 (3): 491- 517. Roos and Hattingh, 1983. Scanning Electron Microscopy of Pseudomonas syringae pv,morsprunorum on Sweet Cherry Leaves. Journal of Phytopathology, 108 (1): 18- 25. Salme Timmusk, Nina Grantcharova, E. Gerhart and H. Wagner, 2005. Paenibacillus polymyxa Invades Plant Roots and Forms Biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 71 (11): 7292- 7300. Sevdalina Todorova and Lubka Kozhuharova, 2010. Characteristics and antimicrobial activity of Bacillus subtilis strains isolated from soil. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 26 (7): 1207- 1216. Sheng Qin, Jie Li, Hua Hong Chen, Guo Zhen Zhao, Wen Yong Zhu, Cheng Lin Jiang, Li Hua Xu and Wen Jun Li, 2009. Isolation, Diversity, and Antimicrobial Activity of Rare Actinobacteria from Medicinal Plants of Tropical Rain Forests in Xishuangbanna, China. Applied and Environmental Microbiology, 75 (19): 6176- 6186. Shino Suzuki, Yuxi He, Hiroshi Oyaizu, 2003. Indole-3-Acetic Acid Production in Pseudomonas fluorescens HP72 and Its Association with Suppression of Creeping Bentgrass Brown Patch. Current Microbiology, 47 (2): 138- 143. Sunita Rangarajan, Lilly M. Saleena, Preeti Vasudevan and Sudha Nair, 2003. Biological suppression of rice diseases by Pseudomonas spp. under saline soil conditions. Plant and Soil, 251 (1): 73- 82. Swetha Sunkar and C Valli Nachiyar, 2012. Biogenesis of antibacterial silver nanoparticles using the endophytic bacterium Bacillus cereus isolated from Garcinia xanthochymus. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2 (12): 953- 959. Chuyên ngành Vi sinh vật học 73 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Tom Coenye and Trường Đại học Cần Thơ Peter Vandamme, 2003. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches. Environmental Microbiology, 5 (9): 719- 729. Valgas Cleidson, Souza Simone Machado de, Smania Elza F. A and Smania, JR Artur, 2007. Screening methods to determine antibacterial activity of natural products. Brazilian Journal of Microbiology 38: 369- 380. V. K. Pillay and J. Nowak, 1997. Inoculum density, temperature, and genotype effects on in vitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato (Lycopersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a pseudomonad bacterium. Revue canadienne de microbiologie, 43 (4): 354-361. Wen- Ming Chen, Euan K. James, Tom Coenye, Jui-Hsing Chou, Edmundo Barrios, Sergio M. de Faria, Geoffrey N. Elliott, Shih-Yi Sheu, Janet I. Sprent and Peter Vandamme, 2006. Burkholderia mimosarum sp. nov., isolated from root nodules of Mimosaspp. from Taiwan and South America. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 56 (8): 1847- 1851. Xiaocong Yu, Tshidi Tsibane, Patricia A. McGraw, Frances S. House, Christopher J. Keefer, Mark D. Hicar, Terrence M. Tumpey, Claudia Pappas, Lucy A. Perrone, Osvaldo Martinez, James Stevens, Ian A. Wilson, Patricia V. Aguilar, Eric L. Altschuler, Christopher F. Basler and James E. Crowe Jr, 2008. Neutralizing antibodies derived from the B cells of 1918 influenza pandemic survivors. International Weekly Journal of Science, 455: 532- 536. Zinniel, Pat Lambrecht, N. Beth Harris, Zhengyu Feng, Daniel Kuczmarski, Phyllis Higley, Carol A. Ishimaru, Alahari Arunakumari, Raúl G. Barletta, and Anne K. Vidaver, 2002. Isolation and Characterization of Endophytic Colonizing Bacteria from Agronomic Crops and Prairie Plants. Applied and Environmental Microbiology, 68 (5): 2198- 2208. Zou WX, Meng JC, Lu H, Chen GX, Shi GX and Zhang TY, 1992. Metabolites of Colletotrichumgloeosporioides, an endophytic fungus in Artemisia mongolica. J Nat Prod, 63:1529 –1530. Chuyên ngành Vi sinh vật học 74 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Trang web http://www.lrc-hueuni.edu.vn (25/7/2013) http://vi.wikipedia.org/wiki/Giấp_cá (25/7/2013) http://en.wikipedia.org(25/7/2013) http://www.duoclieu.org(25/7/2013) http://duoclieudonghan.vn(25/7/2013) http://www.dissertationtopic.net(25/7/2013) http://yhocbandia.com.vn(25/7/2013) http://tepbac.com.( 17/11/2013) http://commons.wikimedia.org. (17/11/2013) http://www.duoclieu.org/2012/02/phuong-phap-thu-tac-dung-khang-khuan.html (Ngày 15/9/2013) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9573152 (Ngày 22/10/2013). http://jb.asm.org/content/180/10/2676.full (Ngày 22/10/2013). http://www.mientayvn.com/Sinh/Tai_lieu/Logo/GT_vi_sinh.pdf (Ngày 22/10/2013). http://niemtin.free.fr/visinhvat.htm (Ngày 22/10/2013). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3621471/ (Ngày 27/11/2013). http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11274-009-0290-1 (Ngày 27/11/2013). Chuyên ngành Vi sinh vật học 75 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC 1. Phụ lục 1: một số hình ảnh. 0.8 0.7 y = 0.2579x + 0.0498 0.6 R2 = 0.9893 OD 0.5 Series1 0.4 Linear (Series1) 0.3 0.2 0.1 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Lượng ammonium (ml) Hình 19: Đường chuẩn đo đạm ngày 2 0.7 0.6 y = 0.2578x - 0.0413 0.5 R2 = 0.9765 OD 0.4 Series1 0.3 Linear (Series1) 0.2 0.1 0 -0.1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Lượng ammonium (0,5ml) Hình 20: Đường chuẩn đo đạm ngày 4 0.7 0.6 y = 0.2409x - 0.0415 0.5 R2 = 0.9556 OD 0.4 Series1 0.3 Linear (Series1) 0.2 0.1 0 -0.1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 Lượng ammonium (ml) Hình 21: Đường chuẩn đo đạm ngày 6 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 0.6 R2 = 0.9853 0.5 y = 0.0068x + 0.0224 R2 = 0.9853 0.4 0.3 Series1 0.2 Linear (Series1) Linear (Series1) 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 6 Hình 22: Đường chuẩn IAA ngày 2 0.8 y = 0.0084x + 0.0244 0.7 R2 = 0.9905 0.6 0.5 Series1 0.4 Linear (Series1) 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Hình 23: Đường chuẩn IAA ngày 4 0.7 y = 0.0079x + 0.0233 0.6 R2 = 0.9903 0.5 0.4 Series1 0.3 Linear (Series1) 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Hình 24: Đường chuẩn IAA ngày 6 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Hình 25: Một số thiết bị trong phòng thí nghiệm 2. Phụ lục 2: Các kết quả thí nghiệm. Bảng 23: Lượng ammonium (µg/ml) các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ tổng hợp: DÒNG R7 R1 R3 R5 R2 R6 R4 Lặp lại Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Lượng Đạm Ngày 2 0,358 0,343 0,358 0,079 0,095 0,087 0,227 0,211 0,234 0,436 0,436 0,420 0,219 0,211 0,219 0,079 0,087 0,079 0,126 0,118 0,118 Lượng đạm Ngày 4 0,569 0,561 0,576 0,553 0,553 0,553 0,569 0,561 0,569 0,631 0,631 0,638 0,545 0,530 0,545 0,499 0,507 0,514 0,460 0,476 0,499 Lượng đạm Ngày 6 0,333 0,341 0,341 0,300 0,308 0,325 0,350 0,333 0,350 0,308 0,308 0,325 0,292 0,292 0,292 0,267 0,300 0,308 0,250 0,267 0,283 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 24: Lượng ammonium (µg/ml) các dòng vi khuẩn phân lập từ lá tổng hợp: DÒNG L1 L2 L3 L4 Lặp lại Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Lượng Đạm Ngày 2 0,141 0,149 0,141 0,071 0,071 0,064 0,102 0,118 0,118 0,033 0,040 0,033 Lượng đạm Ngày 4 0,576 0,569 0,576 0,871 0,879 0,879 0,553 0,576 0,569 0,538 0,553 0,545 Lượng đạm Ngày 6 0,317 0,333 0,350 0,317 0,333 0,358 0,408 0,424 0,391 0,300 0,308 0,325 Bảng 25: Lượng ammonium (µg/ml) các dòng vi khuẩn phân lập từ thân tổng hợp: DÒNG T1 T3 T5 T2 T4 Lặp lại Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Lượng Đạm Ngày 2 0,188 0,172 0,188 0,126 0,126 0,118 0,234 0,227 0,227 0,164 0,172 0,180 0,056 0,056 0,064 Lượng đạm Ngày 4 0,514 0,522 0,530 0,507 0,514 0,514 0,654 0,654 0,662 0,538 0,530 0,545 0,654 0,646 0,631 Lượng đạm Ngày 6 0,275 0,275 0,333 0,267 0,275 0,292 0,292 0,300 0,308 0,308 0,341 0,375 0,308 0,317 0,317 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 26: Lượng IAA(µg/ml) các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ tổng hợp: DÒNG R7 R1 R3 R5 R2 R6 R4 Lặp lại Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Lượng IAA Ngày 2 0,676 0,676 0,824 3,324 3,176 3,176 1,265 1,265 1,265 1,412 1,559 1,706 2,441 2,735 2,588 1,706 1,853 1,706 2,441 2,588 2,588 Lượng IAA Ngày 4 4,270 4,270 4,405 3,595 3,595 3,730 8,189 8,324 8,459 10,216 10,216 10,486 3,189 3,054 3,054 3,324 3,459 3,324 12,108 11,838 12,108 Lượng IAA Ngày 6 0,438 0,542 0,542 0,542 0,438 0,438 0,229 0,229 0,229 0,958 1,063 0,958 0,542 0,646 0,646 1,271 1,271 1,479 0,646 0,646 0,750 Bảng 27: Lượng IAA(µg/ml) các dòng vi khuẩn phân lập từ lá tổng hợp: DÒNG L1 L2 L3 L4 Lặp lại Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Chuyên ngành Vi sinh vật học Lượng IAA Ngày 2 5,529 5,676 5,824 1,118 1,412 1,412 4,353 4,500 4,794 2,294 2,147 2,000 Lượng IAA Ngày 4 4,135 4,135 4,135 0,622 0,622 0,757 6,432 6,432 6,703 13,459 13,595 13,595 Lượng IAA Ngày 6 2,938 2,938 2,938 4,500 4,708 4,813 2,521 2,313 2,521 2,521 2,417 2,625 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 28: Lượng IAA(µg/ml) các dòng vi khuẩn phân lập từ thân tổng hợp: DÒNG T1 T3 T5 T2 T4 Lặp lại Lượng IAA Ngày 2 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 1 Ống 2 Ống 3 2,441 2,588 2,588 1,118 1,265 1,412 2,441 2,588 2,588 1,853 2,000 2,000 1,412 1,559 1,412 Chuyên ngành Vi sinh vật học Lượng IAA Ngày 4 2,919 3,189 3,324 5,892 5,757 6,162 10,081 10,486 10,216 3,730 3,865 4,000 12,514 12,784 12,919 Lượng IAA Ngày 6 0,333 0,333 0,333 2,625 2,833 2,938 4,500 4,604 4,708 1,271 1,167 1,375 2,417 2,313 2,521 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 29: Kết quả khảo sát khả năng kháng A.hydrophila của 16 dòng vi khuẩn. Dòng R7 R1 R3 R5 R2 R6 R4 T1 T3 T5 T2 T4 L1 L2 L3 L4 a 8x7 9x7 7,5x7 7x6 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 7x6,5 10x9 9x8,5 6,0 6,0 8x7,5 9x7 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 Ngày 1 b 12x11 13x13 9x8 8x8 9x8 9x8 12x11 11x11 9x9 10x9 - C 4,0 6,0 1,0 2,0 2,0 1,5 2,0 2,5 1,5 2,0 - a 9x7 11x8 10x10 9x8 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 7,5x7 7,5x7 9 9 6,0 6,0 9x8 9x8 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 Ngày 2 b 13x12 13 13 11x10 11x9,5 10x9 12x11 12 10 10 - C 5 5 3 2 2,5 2 2,5 3 2 2 - a 12x7 9x7 11 9x8 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 7x6 11x9 12x9 9 6,0 6,0 9x8 13x8 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 Ngày 3 b 18x13 15x14 14x12 11x10 14 18 22x20 14 15x13 17x12 - C 6 7 3 2 8 9 11 5 5 4 - Ghi chú: a: Đường kính khuẩn lạc vi khuẩn (mm); b: Đường kính vòng sáng (mm); C: Đường kính vòng vô khuẩn (mm); “ – “ : Không có hoạt tính kháng khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Bảng 30: Hiệu quả kháng E.coli của 16 dòng vi khuẩn phân lập Dòng R7 R1 R3 R5 R2 R6 R4 T1 T3 T5 T2 T4 L1 L2 L3 L4 a 6 6 9x7 7x7 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 7x5 6 6 6 6 6 6 6 Ngày 1 b 14x11 12x11,5 9 9 11x8 9,6x9,5 - C 4,5 4,8 3 3 3,5 3,6 - a 6 6 12x9 9x8 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 7 6 6 6 6 6 7x6 6 6 6 6 6 6 6 Ngày 2 b 17x13,5 15x12 10 9 12x9 10 - C 4,8 5 3 3 4 4 - a 6 6 13x9 9x8 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 7 7 6 6 6 6 7 7x6,6 6 6 6 6 6 6 Ngày 3 b 18x13,9 15x12 10 10 12x11 11,7x10,5 - C 5 5 3 3 4,5 4,3 - Ghi chú: a: Đường kính khuẩn lạc vi khuẩn (mm); b: Đường kính vòng sáng (mm); C: Đường kính vòng vô khuẩn (mm); “ – “ : Không có hoạt tính kháng khuẩn. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 3. Phụ lục 3: Kết quả thống kê. 3.1. Kết quả thống kê khả năng tổng hợp ammonium. 3.1.1. Kết quả thống kê ANOVA các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ. One-way ANOVA: Ngày 2 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 6 0.3260686 0.0543448 890.20 0.000 Error 14 0.0008547 0.0000610 Total 20 0.3269232 S = 0.007813 R-Sq = 99.74% R-Sq(adj) = 99.63% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+-----R1 3 0.08700 0.00800 (*) R2 3 0.21633 0.00462 (*) R3 3 0.22400 0.01179 (*) R4 3 0.12067 0.00462 (*) R5 3 0.43067 0.00924 (*) R6 3 0.08167 0.00462 (*) R7 3 0.35300 0.00866 (*) ---+---------+---------+---------+-----0.10 0.20 0.30 0.40 Pooled StDev = 0.00781 Grouping Information Using Fisher Method Dòng N Mean Grouping R5 3 0.43067 A R7 3 0.35300 B R3 3 0.22400 C R2 3 0.21633 C R4 3 0.12067 D R1 3 0.08700 E R6 3 0.08167 E One-way ANOVA: Ngày 4 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 6 0.0440419 0.0073403 84.28 0.000 Error 14 0.0012193 0.0000871 Total 20 0.0452612 S = 0.009332 R-Sq = 97.31% R-Sq(adj) = 96.15% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -------+---------+---------+---------+-R1 3 0.55300 0.00000 (--*-) R2 3 0.54000 0.00866 (-*-) R3 3 0.56633 0.00462 (-*--) R4 3 0.47833 0.01960 (--*-) R5 3 0.63333 0.00404 (--*-) R6 3 0.50667 0.00751 (-*--) R7 3 0.56867 0.00751 (--*-) -------+---------+---------+---------+-0.500 0.550 0.600 0.650 Pooled StDev = 0.00933 Grouping Information Using Fisher Method Dòng N Mean Grouping R5 3 0.63333 A R7 3 0.56867 B R3 3 0.56633 B R1 3 0.55300 B C R2 3 0.54000 C R6 3 0.50667 D R4 3 0.47833 E Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ One-way ANOVA: Ngày 6 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 6 0.013536 0.002256 14.08 0.000 Error 14 0.002243 0.000160 Total 20 0.015780 S = 0.01266 R-Sq = 85.78% R-Sq(adj) = 79.69% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+--R1 3 0.31100 0.01277 (-----*----) R2 3 0.29200 0.00000 (----*-----) R3 3 0.34433 0.00981 (----*----) R4 3 0.26667 0.01650 (----*----) R5 3 0.31367 0.00981 (-----*----) R6 3 0.29167 0.02173 (----*----) R7 3 0.33833 0.00462 (----*----) ------+---------+---------+---------+--0.270 0.300 0.330 0.360 Pooled StDev = 0.01266 Grouping Information Using Fisher Method Dòng R3 R7 R5 R1 R2 R6 R4 N 3 3 3 3 3 3 3 Mean 0.34433 0.33833 0.31367 0.31100 0.29200 0.29167 0.26667 Grouping A A B B B B C 3.1.2. Kết quả thống kê ANOVA các dòng vi khuẩn phân lập từ thân One-way ANOVA: Ngày 2 versus Dòng Source Dòng Error Total DF 4 10 14 S = 0.006455 Level T1 T2 T3 T4 T5 N 3 3 3 3 3 SS 0.0505397 0.0004167 0.0509564 MS 0.0126349 0.0000417 R-Sq = 99.18% Mean 0.18267 0.17200 0.12333 0.05867 0.22933 StDev 0.00924 0.00800 0.00462 0.00462 0.00404 F 303.24 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.86% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------(-*) (*-) (-*) (-*) (-*-) +---------+---------+---------+--------0.050 0.100 0.150 0.200 Pooled StDev = 0.00645 Grouping Information Using Fisher Method Dòng T5 T1 T2 T3 T4 N 3 3 3 3 3 Mean 0.22933 0.18267 0.17200 0.12333 0.05867 Grouping A B B C D Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ One-way ANOVA: Ngày 4 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 4 0.0587887 0.0146972 249.67 0.000 Error 10 0.0005887 0.0000589 Total 14 0.0593773 S = 0.007672 R-Sq = 99.01% R-Sq(adj) = 98.61% Level T1 T2 T3 T4 T5 N 3 3 3 3 3 Mean 0.52200 0.53767 0.51167 0.64367 0.65667 StDev 0.00800 0.00751 0.00404 0.01168 0.00462 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------(-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) +---------+---------+---------+--------0.500 0.550 0.600 0.650 Pooled StDev = 0.00767 Grouping Dòng N T5 3 T4 3 T2 3 T1 3 T3 3 Information Using Fisher Method Mean Grouping 0.65667 A 0.64367 A 0.53767 B 0.52200 C 0.51167 C One-way ANOVA: Ngày 6 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 4 0.006802 0.001701 3.40 0.053 Error 10 0.004995 0.000500 Total 14 0.011798 S = 0.02235 R-Sq = 57.66% R-Sq(adj) = 40.72% Level T1 T2 T3 T4 T5 N 3 3 3 3 3 Mean 0.29433 0.34133 0.27800 0.31400 0.30000 StDev 0.03349 0.03350 0.01277 0.00520 0.00800 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---------+---------+---------+---------+ (-------*-------) (--------*-------) (-------*--------) (--------*-------) (--------*-------) ---------+---------+---------+---------+ 0.280 0.315 0.350 0.385 Pooled StDev = 0.02235 Grouping Information Using Fisher Method Dòng T2 T4 T5 T1 T3 N 3 3 3 3 3 Mean 0.34133 0.31400 0.30000 0.29433 0.27800 Grouping A A B B B B Means that do not share a letter are significantly different. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 3.1.3. Kết quả thống kê ANOVA các dòng vi khuẩn phân lập từ lá One-way ANOVA: Ngày 2 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 3 0.0205122 0.0068374 196.29 0.000 Error 8 0.0002787 0.0000348 Total 11 0.0207909 S = 0.005902 R-Sq = 98.66% R-Sq(adj) = 98.16% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --+---------+---------+---------+------L1 3 0.14367 0.00462 (-*-) L2 3 0.06867 0.00404 (--*-) L3 3 0.11267 0.00924 (-*-) L4 3 0.03533 0.00404 (-*-) --+---------+---------+---------+------0.035 0.070 0.105 0.140 Pooled StDev = 0.00590 Grouping Dòng N L1 3 L3 3 L2 3 L4 3 Information Using Fisher Method Mean Grouping 0.14367 A 0.11267 B 0.06867 C 0.03533 D One-way ANOVA: Ngày 4 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 3 0.2240727 0.0746909 1282.25 0.000 Error 8 0.0004660 0.0000582 Total 11 0.2245387 S = 0.007632 R-Sq = 99.79% R-Sq(adj) = 99.71% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ------+---------+---------+---------+--L1 3 0.57367 0.00404 (*) L2 3 0.87633 0.00462 (*) L3 3 0.56600 0.01179 (*) L4 3 0.54533 0.00751 (*) ------+---------+---------+---------+--0.60 0.70 0.80 0.90 Pooled StDev = 0.00763 Grouping Information Using Fisher Method Dòng N Mean Grouping L2 3 0.87633 A L1 3 0.57367 B L3 3 0.56600 B L4 3 0.54533 C One-way ANOVA: Ngày 6 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 3 0.015853 0.005284 18.63 0.001 Error 8 0.002269 0.000284 Total 11 0.018122 S = 0.01684 R-Sq = 87.48% R-Sq(adj) = 82.78% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --------+---------+---------+---------+L1 3 0.33333 0.01650 (----*-----) L2 3 0.33600 0.02066 (-----*-----) L3 3 0.40767 0.01650 (-----*-----) L4 3 0.31100 0.01277 (-----*----) --------+---------+---------+---------+Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 0.320 Pooled StDev = 0.01684 Grouping Information Using Fisher Method Dòng L3 L2 L1 L4 N 3 3 3 3 Mean 0.40767 0.33600 0.33333 0.31100 0.360 0.400 0.440 Grouping A B B B 3.2. Kết quả thống kê khả năng tổng hợp IAA 3.2.1. Kết quả thống kê ANOVA của các dòng vi khuẩn phân lập từ rễ. One-way ANOVA: Ngày 2 versus Dòng Source DF Dòng 6 Error 14 Total 20 S = 0.1015 Level R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 N 3 3 3 3 3 3 3 SS MS 13.6246 2.2708 0.1442 0.0103 13.7687 R-Sq = 98.95% Mean 3.2255 2.5882 1.2647 2.5392 1.5588 1.7549 0.7255 StDev 0.0849 0.1471 0.0000 0.0849 0.1471 0.0849 0.0849 F 220.50 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.50% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -+---------+---------+---------+-------(-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (*-) -+---------+---------+---------+-------0.70 1.40 2.10 2.80 Pooled StDev = 0.1015 Grouping Information Using Fisher Method Dòng R1 R2 R4 R6 R5 R3 R7 N 3 3 3 3 3 3 3 Mean 3.2255 2.5882 2.5392 1.7549 1.5588 1.2647 0.7255 Grouping A B B C D E F Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Ngày 4 versus Dòng Source DF Dòng 6 Error 14 Total 20 S = 0.1142 Level R1 R2 R3 R4 R5 R6 N 3 3 3 3 3 3 SS MS F P 247.6799 41.2800 3164.69 0.000 0.1826 0.0130 247.8625 R-Sq = 99.93% R-Sq(adj) = 99.89% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Mean StDev --------+---------+---------+---------+3.640 0.078 (* 3.099 0.078 *) 8.324 0.135 *) 12.018 0.156 *) 10.306 0.156 *) 3.369 0.078 *) Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học R7 3 4.315 0.078 Trường Đại học Cần Thơ *) --------+---------+---------+---------+5.0 7.5 10.0 12.5 Pooled StDev = 0.114 Grouping Information Using Fisher Method Dòng N Mean Grouping R4 3 12.0180 A R5 3 10.3063 B R3 3 8.3243 C R7 3 4.3153 D R1 3 3.6396 E R6 3 3.3694 F R2 3 3.0991 G One-way ANOVA: Ngày 6 versus Dòng Source DF SS MS Dòng 6 2.44296 0.40716 Error 14 0.06510 0.00465 Total 20 2.50806 S = 0.06819 R-Sq = 97.40% Level R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 N 3 3 3 3 3 3 3 Mean 0.4722 0.6111 0.2292 0.6806 0.9931 1.3403 0.5069 StDev 0.0601 0.0601 0.0000 0.0601 0.0601 0.1203 0.0601 F 87.56 P 0.000 R-Sq(adj) = 96.29% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ------+---------+---------+---------+--(-*--) (-*--) (--*-) (-*--) (-*--) (-*--) (-*--) ------+---------+---------+---------+--0.35 0.70 1.05 1.40 Pooled StDev = 0.0682 Grouping Information Using Fisher Method Dòng N Mean Grouping R6 3 1.3403 A R5 3 0.9931 B R4 3 0.6806 C R2 3 0.6111 C D R7 3 0.5069 D E R1 3 0.4722 E R3 3 0.2292 F 3.2.2. Kết quả thống kê ANOVA của các dòng vi khuẩn phân lập từ thân. One-way ANOVA: Ngày 2 versus Dòng Source DF Dòng 4 Error 10 Total 14 S = 0.1005 Level T1 T3 T5 T2 T4 N 3 3 3 3 3 SS MS 4.2099 1.0525 0.1009 0.0101 4.3108 R-Sq = 97.66% Mean 2.5392 1.2647 2.5392 1.9510 1.4608 StDev 0.0849 0.1471 0.0849 0.0849 0.0849 Chuyên ngành Vi sinh vật học F 104.29 P 0.000 R-Sq(adj) = 96.72% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev --+---------+---------+---------+------(--*---) (---*--) (--*---) (--*--) (---*--) --+---------+---------+---------+------1.20 1.60 2.00 2.40 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ Pooled StDev = 0.1005 Grouping Information Using Fisher Method Dòng T5 T1 T2 T4 T3 N 3 3 3 3 3 Mean 2.5392 2.5392 1.9510 1.4608 1.2647 Grouping A A B C D One-way ANOVA: Ngày 4 versus Dòng Source DF Dòng 4 Error 10 Total 14 S = 0.1943 Level T1 T3 T5 T2 T4 N 3 3 3 3 3 SS MS F P 207.6504 51.9126 1375.52 0.000 0.3774 0.0377 208.0278 R-Sq = 99.82% R-Sq(adj) = 99.75% Mean 3.144 5.937 10.261 3.865 12.739 StDev 0.206 0.206 0.206 0.135 0.206 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev +---------+---------+---------+--------*) (*) (*) (*) *) +---------+---------+---------+--------3.0 6.0 9.0 12.0 Pooled StDev = 0.194 Grouping Information Using Fisher Method Dòng T4 T5 T3 T2 T1 N 3 3 3 3 3 Mean 12.7387 10.2613 5.9369 3.8649 3.1441 Grouping A B C D E One-way ANOVA: Ngày 6 versus Dòng Source DF Dòng 4 Error 10 Total 14 S = 0.1076 Level T1 T3 T5 T2 T4 N 3 3 3 3 3 SS MS 31.4916 7.8729 0.1157 0.0116 31.6073 R-Sq = 99.63% Mean 0.3333 2.7986 4.6042 1.2708 2.4167 StDev 0.0000 0.1591 0.1042 0.1042 0.1042 F 680.22 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.49% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev --------+---------+---------+---------+(*) (*) (*-) (-*) (*) --------+---------+---------+---------+1.2 2.4 3.6 4.8 Pooled StDev = 0.1076 Grouping Information Using Fisher Method Dòng T5 T3 T4 T2 T1 N 3 3 3 3 3 Mean 4.6042 2.7986 2.4167 1.2708 0.3333 Grouping A B C D E Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 3.2.3. Kết quả thống kê ANOVA của các dòng vi khuẩn phân lập từ lá. One-way ANOVA: Ngày 2 versus Dòng Source DF Dòng 3 Error 8 Total 11 S = 0.1750 Level L1 L2 L3 L4 N 3 3 3 3 SS MS F P 37.2693 12.4231 405.49 0.000 0.2451 0.0306 37.5144 R-Sq = 99.35% R-Sq(adj) = 99.10% Mean 5.6765 1.3137 4.5490 2.1471 StDev 0.1471 0.1698 0.2246 0.1471 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---+---------+---------+---------+-----(-*) (-*) (*-) (*-) ---+---------+---------+---------+-----1.5 3.0 4.5 6.0 Pooled StDev = 0.1750 Grouping Information Using Fisher Method Dòng L1 L3 L4 L2 N 3 3 3 3 Mean 5.6765 4.5490 2.1471 1.3137 Grouping A B C D Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Ngày 4 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 3 266.9999 89.0000 9747.28 0.000 Error 8 0.0730 0.0091 Total 11 267.0730 S = 0.09555 R-Sq = 99.97% R-Sq(adj) = 99.96% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev --------+---------+---------+---------+L1 3 4.1351 0.0000 (* L2 3 0.6667 0.0780 * L3 3 6.5225 0.1560 (* L4 3 13.5495 0.0780 (* --------+---------+---------+---------+3.5 7.0 10.5 14.0 Pooled StDev = 0.0956 Grouping Information Using Fisher Method Dòng L4 L3 L1 L2 N 3 3 3 3 Mean 13.5495 6.5225 4.1351 0.6667 Grouping A B C D Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Ngày 6 versus Dòng Source DF Dòng 3 Error 8 Total 11 S = 0.1125 SS MS 9.7512 3.2504 0.1013 0.0127 9.8524 R-Sq = 98.97% Chuyên ngành Vi sinh vật học F 256.76 P 0.000 R-Sq(adj) = 98.59% Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Level L1 L2 L3 L4 N 3 3 3 3 Mean 2.9375 4.6736 2.4514 2.5208 StDev 0.0000 0.1591 0.1203 0.1042 Trường Đại học Cần Thơ Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -------+---------+---------+---------+-(-*-) (-*-) (-*-) (-*-) -------+---------+---------+---------+-2.80 3.50 4.20 4.90 Pooled StDev = 0.1125 Grouping Information Using Fisher Method Dòng L2 L1 L4 L3 N 3 3 3 3 Mean 4.6736 2.9375 2.5208 2.4514 Grouping A B C C 3.3. Số liệu thống kê kết quả kháng khuẩn: 3.3.1. A.hydrophila One-way ANOVA: Ngày 1 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 4 16.850 4.213 7.33 0.025 Error 5 2.875 0.575 Total 9 19.725 S = 0.7583 R-Sq = 85.42% R-Sq(adj) = 73.76% Average 2.45 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+---------+ L1 2 1.7500 0.3536 (--------*--------) R1 2 1.5000 0.7071 (-------*--------) R7 2 5.0000 1.4142 (-------*--------) T2 2 2.2500 0.3536 (--------*--------) T5 2 1.7500 0.3536 (--------*--------) ---------+---------+---------+---------+ 1.6 3.2 4.8 6.4 Pooled StDev = 0.7583 Grouping Information Using Fisher Method Dòng R7 T2 T5 L1 R1 N 2 2 2 2 2 Mean 5.0000 2.2500 1.7500 1.7500 1.5000 Grouping A B B B B One-way ANOVA: Ngày 2 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 4 11.650 2.912 19.42 0.003 Error 5 0.750 0.150 Total 9 12.400 S = 0.3873 R-Sq = 93.95% R-Sq(adj) = 89.11% Average 2.90 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---------+---------+---------+---------+ L1 2 2.0000 0.0000 (-----*-----) R1 2 2.5000 0.7071 (-----*-----) R7 2 5.0000 0.0000 (-----*-----) T2 2 2.7500 0.3536 (-----*-----) Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học T5 2 2.2500 Trường Đại học Cần Thơ 0.3536 (-----*-----) ---------+---------+---------+---------+ 2.4 3.6 4.8 6.0 Pooled StDev = 0.3873 Grouping Information Using Fisher Method Dòng R7 T2 R1 T5 L1 N 2 2 2 2 2 Mean 5.0000 2.7500 2.5000 2.2500 2.0000 Grouping A B B B B One-way ANOVA: Ngày 3 versus Dòng Source DF SS MS F P Dòng 4 50.00 12.50 3.13 0.122 Error 5 20.00 4.00 Total 9 70.00 S = 2 R-Sq = 71.43% R-Sq(adj) = 48.57% Average 6.00 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ---+---------+---------+---------+-----L1 2 4.500 0.707 (----------*---------) R1 2 2.500 0.707 (---------*----------) R7 2 6.500 0.707 (----------*---------) T2 2 8.000 4.243 (----------*---------) T5 2 8.500 0.707 (---------*----------) ---+---------+---------+---------+-----0.0 3.5 7.0 10.5 Pooled StDev = 2.000 Grouping Information Using Fisher Method Dòng T5 T2 R7 L1 R1 N 2 2 2 2 2 Mean 8.500 8.000 6.500 4.500 2.500 Grouping A A A B A B B Bảng 27: Kết quả thống kê hiệu quả kháng A.hydrophila của 5 dòng vi khuẩn triển vọng. STT Dòng Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 1 R1 1,25 b 2,50 bc 2,00 b 2 R7 4,50 a 4,00 a 7,75 a 3 T2 2,13 b 3,00 ab 7,75 a 4 T5 2,13 b 2,65 bc 6,25 ab 5 L1 1,38 b 1,50 c 4,75 ab 30,95 13,35 33,33 CV% (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ 3.2. E.coli One-way ANOVA: Ngày 1 versus Dòng Source Dòng Error Total DF 2 3 5 SS 2.8233 0.0500 2.8733 MS 1.4117 0.0167 F 84.70 S = 0.1291 R-Sq = 98.26% Average 3.73 Level L1 R1 T5 N 2 2 2 Mean 3.5500 4.6500 3.0000 StDev 0.0707 0.2121 0.0000 P 0.002 R-Sq(adj) = 97.10% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev -----+---------+---------+---------+---(----*----) (----*---) (----*----) -----+---------+---------+---------+---3.00 3.60 4.20 4.80 Pooled StDev = 0.1291 Grouping Information Using Fisher Method Dòng R1 L1 T5 N 2 2 2 Mean 4.6500 3.5500 3.0000 Grouping A B C Means that do not share a letter are significantly different. One-way ANOVA: Ngày 2 versus Dòng Source Dòng Error Total DF 2 3 5 SS 3.61333 0.02000 3.63333 MS 1.80667 0.00667 S = 0.08165 R-Sq = 99.45% Average 3.96 Level L1 R1 T5 N 2 2 2 Mean 4.0000 4.9000 3.0000 StDev 0.0000 0.1414 0.0000 F 271.00 P 0.000 R-Sq(adj) = 99.08% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---+---------+---------+---------+-----(--*--) (--*--) (--*--) ---+---------+---------+---------+-----3.00 3.60 4.20 4.80 Pooled StDev = 0.0816 Grouping Information Using Fisher Method Dòng R1 L1 T5 N 2 2 2 Mean 4.9000 4.0000 3.0000 Grouping A B C One-way ANOVA: Ngày 3 versus Dòng Source DF SS MS Dòng 2 4.21333 2.10667 Error 3 0.02000 0.00667 Total 5 4.23333 Chuyên ngành Vi sinh vật học F 316.00 P 0.000 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ S = 0.08165 R-Sq = 99.53% Average 4.13 Level L1 R1 T5 N 2 2 2 Mean 4.4000 5.0000 3.0000 StDev 0.1414 0.0000 0.0000 R-Sq(adj) = 99.21% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev ---+---------+---------+---------+-----(--*--) (--*--) (--*--) ---+---------+---------+---------+-----3.00 3.60 4.20 4.80 Pooled StDev = 0.0816 Grouping Information Using Fisher Method Dòng R1 L1 T5 N 2 2 2 Mean 5.0000 4.4000 3.0000 Grouping A B C Bảng 28: Kết quả thống kê hiệu quả kháng E.coli của 3 dòng vi khuẩn triển vọng. STT 1 2 3 Dòng R1 T5 L1 CV% Ngày 1 4,65 a 3,00 c 3,55 b 17,1 Ngày 2 4,90 a 3,00 c 4,00 b Ngày 3 5,00 a 3,00 c 4,40 b 10,65 11,65 (Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột có các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt không ý nghĩa ở mức 5%.) …..HẾT….. Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC & PT Công nghệ Sinh học [...]... khuẩn cao là Bacillus và Pseudomonas 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá trồng ở tỉnh Hậu Giang có khả năng tổng hợp ammonium, IAA, hòa tan lân và có khả năng kháng khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học 2 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về Hậu Giang Hậu Giang. .. của cây 2.2.3 Một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh là nhóm vi khuẩn tiền nhân được liên kết với thực vật, một số nhóm vi khuẩn nội sinh không gây hại cho cây chủ, mà ngược lại còn thúc đẩy sự phát triển của cây trồng bằng cách sản xuất các chất kích thích sự sinh trưởng của thực vật và sự cố định đạm từ không khí Hơn nữa, một số dòng vi khuẩn nội sinh có thể cải thiện sự phát triển... các vi khuẩn nội sinh sống tốt g Định cư Sau khi xâm nhập vào trong nhu mô thực vật, vi khuẩn nội sinh di chuyển đến các bó mạch gỗ để theo nước từ rễ lên các phần khác trên không của cây Vi khuẩn nội sinh cũng có thể tập trung sinh sống và phát triển trong các tế bào nhu mô lá, tế bào diệp lục Ở đây chúng có thể phát triển lâu dài hay có thể tiếp tục sinh sản và di chuyển đến các bộ phận khác của cây. .. mọc hoang dại hoặc được trồng ngay trong vườn nhà Nhiều cây thuốc đã được các nhà khoa học nghiên cứu và tìm thấy những chất kháng khuẩn có tác dụng diệt nhiều loại vi khuẩn, trong đó có cây Diếp cá Diếp cá là loại rau rất quen thuộc trong các bữa ăn hàng ngày của các gia đình Vi t Nam, nhất là các tỉnh phía Nam Thường dùng làm rau ăn sống, làm gia vị cùng các loại rau khác Diếp cá cũng được sử dụng làm... nó có thể điều trị vi m tuyến vú (http://vietbao.vn/Suc-khoe/Rau-diep-ca-vithuoc-da-nang/10910304/248/) 2.3 Vi khuẩn nội sinh 2.3.1 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh có mặt trong nhiều loại cây trồng và thực vật hoang dại, chúng xâm nhập vào mô thực vật xuyên qua vùng rễ theo nhiều cách: bám ở bề mặt rễ và tìm cách chui vào rễ chính hay rễ bên, thông qua lông hút, giữa các tế bào nhu mô... sinh đã được tìm thấy trên vi khuẩn nội sinh phân lập từ khoai tây chống lại nấm Fusarium sambucinum, F avenaceum, F oxysporum, Rhizotonia solani và từ bắp chống lai nấm Fusarium miniliformis (Hinton và Bacon, 1995) 2.2.4 Các nhóm vi khuẩn nội sinh thường gặp Theo nghiên cứu khoa học của các nhà khoa học Trung Quốc, hiện nay người ta đã phân lập được trên dưới 200 dòng vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp. .. rằng nguồn gốc của vi khuẩn nội sinh là đất vùng rễ Kết hợp nhiều kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh từ rễ cây lúa mì, bông vải, bắp ngọt, bắp đá và cải canola đều kết luận Chuyên ngành Vi sinh vật học 8 Vi n NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Trường Đại học Cần Thơ vi khuẩn nội sinh xuất phát từ đất Vai trò của hạt như là một nguồn của vi khuẩn nội sinh vẫn là một điều còn tranh... có khả năng trực tiếp ức chế một số bệnh cho cây trồng hoặc kích thích cây trồng sản xuất các hợp chất biến dưỡng thứ cấp giúp cây chống lại các tác nhân gây bệnh cây Đặc biệt là có những chủng vi sinh vật nội sinh với cây dược liệu có thể sản xuất các hợp chất kháng khuẩn khi chúng sống bên trong cây dược liệu Các nhóm vi sinh vật có khả năng này bao gồm các loài thuộc chi Azosprillum, Herbaspirillum,... xâm nhập vào các mô xuyên qua khí khổng hay các vị trí tổn thương của lá (Roos và Hattingh, 1983) Sau khi xâm nhập vào cây chủ , các vi khuẩn nội sinh có thể tập trung tại vị trí xâm nhập hay phát tán khắp nơi trong cây đến các tế bào bên trong, di vào các khoảng trống gian bào hay vào trong hệ mạch (Zinniel et al, 2002) Mật số của quần thể vi khuẩn nội sinh Chuyên ngành Vi sinh vật học 7 Vi n NC & PT... trưởng của cây do sự tác động của chúng đến giá trị của các chất dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira et al, 1983; Harari et al, 1988) Các vi khuẩn vùng rễ làm tăng sự hấp thu dinh dưỡng và sự chuyển hóa các chất trong các cây còn non 2.3.2 Sự xâm nhập và nội sinh trong mô thực vật của vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh xâm nhập vào bên trong cơ thể (mô) thực vật có thể sống sót và phát