- Chuẩn bị mơi trường NBRIP (Nautiyal, 1999) ( bảng 1)
- Hút 5 µl vi khuẩn nhỏ lên bề mặt mơi trường.
- Ủ 30o C trong 12- 24h.
- Quan sát khả năng tạo vịng halo. Đo đường kính halo và khuẩn lạc mỗi ngày
- Khả năng hịa tan lân E được tính theo cơng thức 100 lạc khuẩn kính Đường halo kính Đường E (C. NGUYEN và ctv, 1992)
e. Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dịng vi khuẩn phân lập.
Chuẩn bị
- Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và mơi trường NFb.
- Cho 15 ml mơi trường lỏng NFb, vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần.
- Nuơi cấy các dịng vi khuẩn trên máy lắc 200 vịng/phút. Trùm kín các ống
nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng)
Định lượng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
1. Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5 g FeCl3 trong 1 l H2SO4 10,8 M 2. Chuẩn bị phosphat buffer 200 ml gồm:
A: KH2PO4 0,136 g/100 ml nước cất.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 38 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
3. Lấy 39 ml A, 61 ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200 ml, chỉnh pH = 7
4. Hút 1,5 ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. 5. Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút.
6. Hút cẩn thận 1 ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống Durham.
7. Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hồn tồn sau đĩ đo
quang phổ OD ở bước sĩng 530 nm.
8. Chuẩn bị đường chuẩn IAA:
Cân 0,0016 g IAA thương mại hịa tan với 10 ml phosphat buffer được nồng độ là 160 µg/l. Sau đĩ pha loãng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 15; 20; 30; 40 µg/ml.
9. Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD cĩ giá trị từ 0 – 3. Trục hoành là nồng độ IAA cĩ giá trị từ 0 – 40 µg/ml.
10. Kết quả đo OD các dịng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ
thị đường chuẩn, từ đĩ tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
f. Khảo sát khả năng kháng khuẩn
Khảo sát khả năng kháng E. coli của các dịng vi khuẩn phân lập
Chuẩn bị mơi trường LB ( Bảng 6)
Trải vi khuẩn gây bệnh E. coli lên bề mặt đĩa mơi trường.
Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào vi khuẩn phân lập nuơi 1 ngày trong PDA lỏng vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt mơi trường đã trải vi khuẩn E. coli.
Ủ 30o C trong 12- 24h.
Quan sát khả năng tạo vịng kháng khuẩn. Tính hiệu quả kháng khuẩn theo cơng thức:
C = b – a
(Ngơ Thị Phương Dung el al., 2011) Ghi chú: C: Đường kinh vịng vơ khuẩn
a: Đường kính khuẩn lạc
Chuyên ngành Vi sinh vật học 39 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
Khảo sát khả năng kháng Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá của các dịng vi khuẩn phân lập
Chuẩn bị mơi trường LB ( Bảng 6)
Trải vi khuẩn gây bệnh cá Aeromonas hydrophilalên bề mặt đĩa mơi trường. Dùng giấy thấm đường kính 6mm nhúng vào vi khuẩn phân lập nuơi 1 ngày
trong PDA lỏng vài phút và đặt giấy thấm lên bề mặt mơi trường đã trải vi khuẩn A.hydrophila.
Ủ 30o C trong 12h – 24h.
Quan sát khả năng tạo vịng kháng khuẩn và tính hiệu quả kháng khuẩn.
3.2.3 Sử dụng kỹ thuật PCR nhận diện một số dịng vi khuẩn triển vọng.
Sau khi kiểm tra khả năng cố định đạm, tổng hợp IAA, thử nghiệm khả năng hịa tan lân và tính kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn đã phân lập được, chọn một số
dịng vi khuẩn cĩ khả năng cố định đạm, hịa tan lân, tổng hợp IAA cao, cĩ hoạt tính
kháng khuẩn để thực hiện phương pháp PCR với mồi tổng cho vi khuẩn.
Qui trình trích ADN nhanh theo phương pháp của Barberio và Fani (1998). -Cấy vi khuẩn từống trữ rịng lên đĩa Petri chứa mơi trường LB. Ủ 24h trong
tủủở 30°C.
-Khi khuẩn lạc vi khuẩn hình thành, dùng que cấy chọn 1 - 2 khuẩn lạc rời và
đều nhau cho vào tuýp Eppendorf
-Cho bi vào từng tuýp Eppendorf và trộn đều dung dich trên máy ly tâm. -Ủở 95°C trong 10 phút (ủ trong water bath).
-Lập tức đem ngâm đá nhanh trong 10 phút để phá vỡ tế bào của vi khuẩn -Ly tâm nhẹ hai lần. Thu được dịch trích ADN của vi khuẩn.
-Đem trữở -20°C nếu chưa tiến hành quy trình PCR. -Nhận diện các dịng vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
-Thành phần cho 1 phản ứng PCR (25μl/ phản ứng) (Bảng 7). -Quy trình PCR
Chuyên ngành Vi sinh vật học 40 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
-Tiếp theo là 3 chu trình được gia nhiệt như sau:
+ 95°C trong 1 phút + 49°C trong 1 phút + 72°C trong 1 phút
-Bước cuối cùng là 72°C trong 10 phút.
-Sản phẩm PCR sau đĩ được trữ lạnh ở -20°C để điện di
Điện di gel agarose sản phẩm PCR -Chuẩn bị gel nhỏ : (20ml)
+ Agarose (1%): 0,2g + TAE buffer (1X): 20ml
-Nấu 2 phút cho tan Agarose trong lị vi sĩng (microwave) -Sau khi nấu để nguội khoảng 50 – 60°C, bổ sung EtBr 0,4μl
-Rĩt gel vào khuơn
-Sau khi rĩt gel vào khuơn khoảng 90 phút ta tiến hành load mẫu.
-Load mẫu: dùng Micropipet hút 10μl Loading Buffer (LB) chia làm 4 giọt trên giấy parafilm. Hút 10μl mẫu DNA vi khuẩn, trộn với giọt Loading Buffer trên và load mẫu vào giếng.
-Điện di 60 phút ở 90V.
Với cặp mồi 16SrRNA (Lane, 1991)
Mồi xuơi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’
Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3 Chụp hình gel bằng máy chụp gep Bio – Rad.
Bảng 9. Chu kỳ phản ứng PCR
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 Biến tính 95 5 phút
Biến tính 95 1 phút
2 Gắn mồi 30 53 45 giây
Kéo dài 72 90 giây
3 Kéo dài 72 5 phút
3.2.4 Xử lý kết quả
Các thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel, phần mềm Statgraphic và phần mềm Minitab.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 41 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập vi khuẩn
Từ rễ, thân và lá của 14 cây Diếp cá thu được ở 2 Huyện thuộc tỉnh Hậu Giang. 16 dịng vi khuẩn đã được phân lập. Các dịng vi khuẩn này phân bố ở cả trong rễ, thân
và lá của cây Diếp cá. Trong đĩ, cĩ 7 dịng vi khuẩn được phân lập từ rễ, 5 dịng vi khuẩn từ thân và 4 dịng vi khuẩn từ lá. Chúng cĩ chung đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện vi hiếu khí. Khi được cấy trong mơi trường bán đặc, vi
khuẩn phát triển thành vịng pellicle (màu trắng trên mơi trường NFb), cách bề mặt mơi trường 3-7mm.
Hình 8: A: Cây Diếp cá tiến hành phân lập vi khuẩn (Hình chụp ngày 1/8/2013). B: Vịng pellicle xuất hiện trên mơi trường Nfb
4.2 Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên mơi trường PDA.
Các dịng vi khuẩn phân lập được trên mơi trường PDA từ rễ, thân và lá của cây
Diếp cá thu được ở các huyện khác nhau được ký hiệu là R, T và L kèm theo thứ tự
cácdịng(Bảng 10).
Vịng pellicle
Chuyên ngành Vi sinh vật học 42 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
Bảng 10. Nguồn gốc các dịng vi khuẩn phân lập trên mơi trường PDA
STT Dịng Vị trí phân lập Địa điểm thu mẫu
1 R1 Rễ Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 2 R2 Rễ Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 3 R3 Rễ Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 4 R4 Rễ Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang
5 R5 Rễ Đơng Phước A, Châu Thành, Hậu Giang
6 R6 Rễ Đơng Phước A, Châu Thành, Hậu Giang
7 R7 Rễ Đơng Phước A, Châu Thành, Hậu Giang
8 T1 Thân Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 9 T2 Thân Long Thạnh Phụng Hiệp, Hậu Giang 10 T3 Thân Đơng Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 11 T4 Thân Đơng Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 12 T5 Thân Đơng Phước A, Châu Thành, Hậu Giang 13 L1 Lá Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 14 L2 Lá Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 15 L3 Lá Long Thạnh, Phụng Hiệp, Hậu Giang 16 L4 Lá Đơng Phước A, Châu Thành, Hậu Giang.
Hầu hết các dịng vi khuẩn phân lập được đều phát triển nhanh, khuẩn lạc vi
khuẩn cĩ thể nhìn rõ chỉ sau 18-20 giờ ủ ở nhiệt độ 30oC. Trong các khuẩn lạc được
tạo thành từ 16 dịng vi khuẩn đã phân lập được cĩ 7 khuẩn lạc màu trắng đục (chiếm
43,75 %), 4 khuẩn lạc màu vàng (25%) và 5 khuẩn lạc màu vàng nhạt (chiếm 31,25%).
Kích thước khuẩn lạc của vi khuẩn sau 20 giờ cấy trên mơi trường PDA (khơng N, khơng yeast extract) và ủ ở 30oC rất đa dạng, dao động trong khoảng 0,2- 4mm (Bảng 11).
Tất cả các dạng khuẩn lạc của 16 dịng vi khuẩn đều cĩ dạng trịn. Chúng chỉ
khác nhau ở dạng bìa, độ nổi. Các dạng khuẩn dạng bìa nguyên, độ nổi mơ chiếm 75% cịn lại 25% là các khuẩn lạc dạng bìa răng cưa, lài.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 43 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
Bảng 11. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên mơi trường PDA
STT Dịng Màu Sắc Hình Dạng Đường kính(mm) 1 R1 Trắng đục Trịn, bìa răng cưa, độ nổi lài, khơ 2,3 2 R2 Vàng nhạt Trịn, bìa nguyên, độ nổi lài, khơ 2,0 3 R3 Vàng Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 2,0 4 R4 Trắng đục Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 0,8 5 R5 Vàng Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 1,0 6 R6 Trắng đục Trịn, bìa răng cưa, độ nổi lài, khơ 2,0 7 R7 Vàng Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 0,4 8 T1 Vàng nhạt Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 0,3 9 T2 Trắng đục Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 3,0 10 T3 Vàng nhạt Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 0,9 11 T4 Vàng nhạt Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 2,0 12 T5 Trắng đục Trịn, bìa nguyên, độ nổi lài, khơ 4,0 13 L1 Trắng đục Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 2,5 14 L2 Vàng nhạt Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 2,5 15 L3 Trắng đục Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 0,2 16 L4 Vàng Trịn, bìa nguyên, độ nổi mơ, nhầy 3,0
Hình 9: Hình dạng một số khuẩn lạc vi khuẩn phân lập.
(A1: Dịng R3; A2: Dịng R5; B: Dịng T3; C: Dịng L1; D: Dịng R1) A1 A2 B C D
Chuyên ngành Vi sinh vật học 44 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
Mười sáu dịng vi khuẩn phân lập được đa số cĩ dạng hình que, ngồi ra cịn cĩ dạng cầu đơn và cầu đơi. Trong đĩ, vi khuẩn cĩ dạng que ngắn chiếm 13/16 dịng (81,25 %), 1 dịng dạng que dài, 1 dịng dạng cầu đơn và 1 dịng dạng cầu đơi (mỗi
dạng chiếm 6,25%).
Trong tổng số 16 dịng vi khuẩn, 14 dịng gram âm (87,5%) và 2 dịng gram
dương (12,5%). Ba dịng vi khuẩn khơng cĩ khả năng chuyển động (18,75%) và 13 dịng cĩ thể di chuyển (81,25%). Chiều dài vi khuẩn dao động trong khoảng 0,684- 5,501 µm, chiều rộng khoảng 0,684- 1,368 µm (Bảng 12).
Bảng 12. Đặc tính vi khuẩn phân lập được trên mơi trường PDA.
STT Dịng Hình dạng Chiều Dài (µm) Chiều Rộng (µm) Chuyển động* Gram** 1 R1 Que ngắn 1,368 1,026 + + 2 R2 Que ngắn 1,710 1,197 - - 3 R3 Que ngắn 1,710 1,368 + - 4 R4 Que ngắn 1,710 1,026 + - 5 R5 Que ngắn 1,539 1,197 + - 6 R6 Que ngắn 1,026 0,855 - - 7 R7 Que dài 5,301 1,197 + - 8 T1 Cầu đơn 0,684 0,684 + - 9 T2 Que ngắn 1,710 1,026 - - 10 T3 Que ngắn 3,420 1,197 + - 11 T4 Cầu đơi 1,881 0,855 + - 12 T5 Que ngắn 3,078 0,855 + - 13 L1 Que ngắn 2,052 1,197 + + 14 L2 Que ngắn 1,539 0,684 + - 15 L3 Que ngắn 1,539 1,026 + - 16 L4 Que ngắn 1,368 1,197 + -
Ghi chú: * : - khơng chuyển động, + cĩ chuyển động ; **:- gram âm, + gram dương.
Hình 10: Hình dạng và đặc điểm nhuộm gram của một số dịng vi khuẩn
A: Vi khuẩn hình que, gram dương dịng R1; B: Vi khuẩn dạng cầu đơi, gram âm dịng T4.
B
Chuyên ngành Vi sinh vật học 45 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
4.3 Khả năng cố định đạm
Khảo sát khả năng cố định đạm dựa vào lượng NH4+ (ammonium) do vi khuẩn sinh ra (phương pháp so màu Indophenol Blue), kết quả là tất cả các dịng vi khuẩn phân lập đều cĩ khả năng sinh ra NH4+. Nhìn chung, ở ngày thứ 2, đã cĩ NH4+ được
sinh ra nhưng cịn thấp. Lượng NH4+ (ammonium) cao nhất ở ngày thứ 4 và giảm mạnh vào ngày thứ 6.
Mười sáu dịng vi khuẩn sống nội sinh trong cây Diếp cá phân lập được trên mơi
trường PDA được chia thành 3 nhĩm để khảo sát lượng ammonium do vi khuẩn tạo ra ở ngày 2, 4 và 6 (sau khi chủng trong mơi trường NFb lỏng, khơng N, khơng Yeast
extract).
Hình 11: Đường chuẩn đo nồng độ NH4+
4.3.1. So sánh khả năng tạo ammonium của các dịng vi khuẩn nhĩm 1- nhĩm vi khuẩn sống nội sinh phân lập từ rễ (R1- R7).
Sau 2 ngày chủng, các dịng vi khuẩn R1- R7 đã tạo ra được một lượng ammonium nhất định. Lượng ammonium nhiều nhất ở dịng R5, khác biệt cĩ ý nghĩa
Chuyên ngành Vi sinh vật học 46 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
Bảng 13: Khả năng tổng hợp Amonium của các dịng vi khuẩn phân lập từ Rễ
STT Dịng Ngày 2 Ngày 4 Ngày 6
1 R1 0,087 e 0,553 bc 0,311 b 2 R2 0,216 c 0,540 c 0,292 b 3 R3 0,224 c 0,566 b 0,344 a 4 R4 0,121 d 0,478 e 0,267 c 5 R5 0,431 a 0,633 a 0,314 b 6 R6 0,082 e 0,507 d 0,292 b 7 R7 0,353 b 0,569 b 0,338 a CV% 3,614 1,698 4,107
(Ghi chú: Các trị trung bình trong cùng một cột cĩ các mẫu tự theo sau giống nhau biểu thị sự khác biệt khơng ý nghĩa ở mức 5%.)
Tiếp tục đến ngày thứ 4, dịng R5 vẫn là dịng vi khuẩn tạo ra lượng ammonium
nhiều nhất với 0,633µg/ml khác biệt cĩ nghĩa so với các dịng cịn lại. Xếp ngay sau đĩ là 2 dịng R7 và R3 với lượng ammonium lần lượt là 0,569µg/ml và 0,566µg/ml; 2 dịng vi khuẩn này nhìn chung khác biệt khơng ý nghĩa với nhau nhưng khác biệt cĩ ý nghĩa so với các dịng cịn lại. R1 cũng là dịng vi khuẩn đáng được chú ý với lượng
ammonium tạo ra là 0,553µg/ml so với tổng thể các dịng vi khuẩn nội sinh ở rễ.
Ngày thứ 6, do nguồn dinh dưỡng cạn kiệt nên vi khuẩn sử dụng ammonium do
chính chúng tạo ra, vì thế, lượng ammonium được sinh ra từ các dịng vi khuẩn đều
giảm. Lượng ammonium do dịng R4 tạo ra là thấp nhất (0,267 µg/ml), khác biệt cĩ ý
nghĩa so với các dịng khác. Lượng ammonium cịn lại nhiều nhất sau 6 ngày chủng là do dịng R3 và R7 tạo ra.
4.3.2. So sánh khả năng tạo ammonium của các dịng vi khuẩn nhĩm 2- nhĩm vi khuẩn sống nội sinh phân lập từ thân (T1 – T5).
Tương tự các dịng vi khuẩn ở nhĩm 1, đa số các dịng vi khuẩn ở nhĩm 2 đều đã tạo ra được một lượng ammonium nhất định sau 2 ngày chủng và lượng ammonium này tăng cao nhất vào ngày thứ 4 rồi giảm vào ngày thứ 6 (Bảng 14 ).
Chuyên ngành Vi sinh vật học 47 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
Nếu so sánh với các dịng vi khuẩn ở nhĩm 1 thì các dịng vi khuẩn ở nhĩm 2 tạo ra lượng ammonium ở ngày 2 cĩ phần thấp hơn (dưới 0.2µg/ml). Ở ngày 2, lượng ammonium được tạo ra cao nhất do dịng T5 tổng hợp với 0,229µg/ml khác biệt cĩ ý
nghĩa so với 4 dịng vi khuẩn cịn lại.
Mặc dù trong những ngày đầu các dịng vi khuẩn phân lập từ thân cố định đạm