Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác
nhân oxy hĩa là hypochlorite hình thành cĩ phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện
diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982)
Hĩa chất:
- Chuẩn bị dung dịch KCl : Hịa tan 15 g KCl vào trong 100 ml nước cất.
- Stock (NH4+): Hịa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha lỗng 40ml stock (NH4+) để được 200ml, sau
Chuyên ngành Vi sinh vật học 36 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
- Thuốc thử phenol nitroprusside: hịa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside
trong nước được 0,5L.
- Hypochloride buffer: hịa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5L. - Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và mơi trường NFb lỏng
Tiến hành thí nghiệm:
- Cho 15ml mơi trường lỏng NFb, vào trong ống nghiệm đậy nắp lại, khử trùng nhiệt ướt 121oC trong 20 phút.
- Để nguội, chủng vi khuẩn, thí nghiệm lặp lại ba lần. - Nuơi cấy các dịng vi khuẩn trên máy lắc 200 vịng/phút.
* Định lượng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng) Phương pháp định lượng:
- Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hịa tan thêm nước cất vào đến 0,5L.
- Pha buffer: cho 1ml NaOCl cĩ nồng độ (5 – 5,25 %) và 5 g NaOH vào 0,5L
nước cất.
- Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 µg/ml
• Đường chuẩn 0 µg/ml gồm cĩ: 5ml H2O: 0ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 1 µg/ml gồm cĩ: 4ml H2O: 1ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 2 µg/ml gồm cĩ: 3ml H2O: 2ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 3 µg/ml gồm cĩ: 2ml H2O: 3ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 4 µg/ml gồm cĩ: 1ml H2O: 4ml NH4+, 5ml buffer, 5ml thuốc thử
• Đường chuẩn 5 µg/ml gồm cĩ: 0ml H2O: 5ml NH4+, 5ml buffer, 5 ml thuốc thử
- Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
• Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. • Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 37 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
• Hút 1ml dịch vi khuẩn đã ly tâm và 4ml H2O, 5ml buffer, 5ml thuốc thử. Tiến hành đo phổ OD.
• Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sĩng 636nm, sau đĩ vẽ đồ thị trên Excel cĩ thể tính được nồng độ
NH4+ trong dịch vi khuẩn.