Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, ta tiến hành nhuộm
Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
-Hút 10μl nước cất vơ trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
-Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
Chuyên ngành Vi sinh vật học 35 Viện NC & PT Cơng nghệ Sinh học
-Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
-Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật cĩ chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
-Rửa lại bằng nước cất vơ trùng, chậm nhẹ cho khơ nước.
-Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trải đều bằng que cấy và để
trong 1 phút.
-Rửa lại bằng nước cất vơ trùng, chậm nhẹ cho khơ.
-Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật cho đến khi giọt cồn cuối cùng khơng cịn màu tím nữa.
-Rửa lại bằng nước cất vơ trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khơ.
-Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trải đều bằng que cấy sau đĩ để 1 phút.
-Rửa lại bằng nước cất vơ trùng cho đến giọt nước cuối cùng khơng cịn màu của fushin.
-Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khơ nước.
-Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn cĩ màu tím xanh của crystal violet là mẫu Gram dương, cĩ màu hồng đỏ của fushin là mẫu Gram âm.