I. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN
1.Phân lập vi khuẩn
1.1. Quy trình phân lập vi khuẩn
Cách chuẩn bị đĩa mơi trường phân lập:
Sau khi pha mơi trường PDA vào bình tam giác thì tiến hành khử trùng ở 121oC, 1atm trong 20 phút cho cả mơi trường và đĩa petri. Khi mơi trường đã nguội khoảng 45 -50oC thì ta tiến hành rĩt vào đĩa petri. Sau đĩ khử trùng bằng tia UV, để mơi trường nguội ta đem ủ ở 30o
C trong 24 giờ để kiểm tra cĩ bị nhiễm (nhiễm nấm men và nấm mốc) hay khơng. Chỉ được sử dụng nếu đĩa khơng bị nhiễm (Nguyễn Thị Diệu Hiền, 2009).
Tiến hành thu hoạch các cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.) trong tự nhiên, thu hoạch những cây diệp hạ châu (Phyllanthus amarus L.) này ở giai đoạn cây đang tăng trưởng tối đa, thu tồn bộ cây và tiến hành các bước sau:
Rửa thật sạch đất bám ở rễ, thân, lá, hạt.
Cắt riêng từng phần cho vào những cốc khác nhau
Khử trùng mẫu bằng dung dịch ethanol 70% trong 3 phút. Tiếp tục dùng dung dịch H2O2 3% trong 2-3 phút.
Rửa mẫu bằng nước cất tiệt trùng 4 lần (trong tủ cấy vơ trùng).
Lấy nước cất lần thứ 4 cấy lên mơi trường PDA để xem cĩ vi khuẩn xuất hiện hay khơng. Nếu cĩ vi khuẩn xuất hiện, mẫu cần khử trùng triệt để hơn để loại bỏ các vi sinh vật cĩ trong đất.
Tiếp tục làm khơ mẫu bằng giấy thấm.
Cắt mẫu thành những đoạn thật nhỏ rồi đem nghiền mịn trong cối cùng với 1mL nước cất vơ trùng.
Lấy 100µL dung dịch nghiền ở trên pha lỗng nồng độ 100, 10-1, 10-2,..tiến hành vortex.
Hình 5: Phƣơng pháp pha lỗng
Hút 50µL dung dịch pha lỗng ở trên cho vào ống nghiệm chứa mơi trường NFb bán đặc khơng bổ sung đạm rồi đem ủ ở 30oC để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 1 - 2 ngày nuơi, khi thấy mơi trường nuơi vi khuẩn xuất hiện một lớp màng mỏng trắng đục (pellicle) cách mặt mơi trường bán đặc khoảng 3 - 6mm, lấy 5µL dung dịch nuơi vùng này trải sang đĩa petri chứa mơi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30oC trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Sau khoảng 24 giờ, khi thấy mơi trường nuơi vi khuẩn xuất hiện những khuẩn lạc, lấy khuẩn lạc vùng này cấy truyền sang đĩa petri chứa mơi trường PDA đặc rồi tiếp tục đem ủ ở 30oC trong tủ ủ để vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Tiếp tục theo dõi thường xuyên sự tăng trưởng của vi khuẩn và phân lập đến khi rịng vi khuẩn.
1.2. Quan sát, mơ tả hình dạng, khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi phân lập và tách rịng vi khuẩn, tiến hành quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong mơi trường nước cất vơ trùng. Các mẫu vi khuẩn sống được làm bằng phương pháp giọt ép rồi quan sát dưới kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002).
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
Nhỏ 5μL nước cất vơ trùng lên kính mang vật.
Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật.
Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 gĩc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật khơng cĩ bọt khí.
Quan sát mẫu vật dưới kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần để thấy được các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
1.3. Quan sát và đo kích thƣớc tế bào vi khuẩn nội sinh
Sau khi quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong mơi trường nước cất vơ trùng, đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần.
Tiến hành chụp hình vi khuẩn nội sinh dưới kính hiển vi điện tử quét ở độ phĩng đại 20.000 lần để thấy rõ hơn hình dạng tế bào, các chiên mao ở đầu và chiên mao bên của vi khuẩn.
Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn như sau:
Nhỏ 10μL nước cất vơ trùng lên kính mang vật.
Kim cấy được khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nước trên kính mang vật.
Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp xúc với kính mang vật 1 gĩc 45o rồi hạ kính đậy vật xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật khơng cĩ bọt khí.
Để đo kích thước vi khuẩn ta dùng thước trắc vi thị kính và thước trắc vi vật kính như sau:
Thước trắc vi thị kính là một miếng kính trịn trên đĩ chia thành 100 vạch, nĩ được đặt giữa hai thấu kính của thị kính.
Thước trắc vi vật kính được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng cĩ độ dài 10µm.
Phương pháp đo kích thước vi khuẩn như sau:
Đặt thước trắc vi vật kính vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ ảnh của thước.
Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính sao cho hai thước song song và gần sát nhau, tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và một vạch thứ hai nào của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính. Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo cơng thức sau: x: Trị số 1 khoảng cách của thước trắc vi thị kính
N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6 n: Số khoảng cách của thước trắc vi thị kính, n = 35
Ta cĩ:
Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu.
Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đĩ tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
Đếm số khoảng cách thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
Tính kích thước vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của hai thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính (Cao Ngọc Điệpvà Nguyễn Hữu Hiệp, 2002).
1.4. Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh
Sau khi quan sát và đo kích thước các tế bào vi khuẩn xong, tiến hành nhuộm Gram các vi khuẩn.
Trình tự nhuộm Gram được thực hiện như sau:
Lấy 10μL nước cất vơ trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trải mỏng vi sinh vật trên kính mang vật.
Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
Nhỏ từ một đến hai giọt Crystal violet lên kính mang vật cĩ chứa mẫu vi sinh vật đã cố định, trải đều Crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch Iod rồi trải đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
Rửa lại bằng nước cất vơ trùng, chậm nhẹ cho khơ.
Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau cho đến khi giọt cồn cuối cùng khơng cịn màu tím nữa.
Rửa lại bằng nước cất vơ trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khơ.
Nhỏ từ một đến hai giọt Fushin rồi trãi đều bằng que cấy sau đĩ để 1 phút. Rửa lại bằng nước cất vơ trùng cho đến giọt nước cuối cùng khơng cịn màu của fushin.
Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khơ nước.
Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phĩng đại 400 lần và ghi nhận Gram của vi khuẩn. Nếu mẫu vi khuẩn cĩ màu tím xanh của Crystal violet là mẫu Gram dương, cĩ màu hồng đỏ của Fushin là mẫu Gram âm.
2. Xác định khả năng tổng hợp NH4+ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
của các dịng vi khuẩn phân lập đƣợc
2.1. Nguyên tắc
Xác định nồng độ NH4+ nhờ phản ứng phenol và NH3 với sự hiện diện của tác nhân oxy hĩa là hypochlorite hình thành cĩ phức màu xanh, dưới pH kiềm. Sự hiện diện của sodium nitroprusside làm tăng hiệu quả của phản ứng giữa NH3 với phenol và lên khoảng 10 lần (Page et al., 1982).
2.2. Hĩa chất:
Chuẩn bị dung dịch KCl 2M: Hịa tan 15g KCl vào trong 100ml nước cất. Stock (NH4+): Hịa tan 0,4717g (NH4)2SO4 vào 1 lít nước. Trữ dung dịch trong tủ lạnh. Trước khi sử dụng pha lỗng 40 ml stock (NH4+) để được 200ml, sau cùng được dung dịch 2µg/ml
Thuốc thử phenol nitroprusside: hịa tan 5g phenol và 0,025g nitroprusside trong nước được 0.5 lít.
Hypochloride buffer: hịa tan 15ml NaOCl + 5g NaOH vào nước được 0,5 lít. Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và mơi trường NFb lỏng
Tiến hành thí nghiệm:
Nhân sinh khối các dịng vi khuẩn đã tách rịng trong mơi trường PDA lỏng. Ủ lắc trong 2 ngày.
Chủng 500µl các dịng vi khuẩn đã nuơi vào ống nghiệm chứa 8 ml mơi trường NFb lỏng khơng đạm, mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần.
Các ống nghiệm vừa được chủng vi khuẩn được ủ lắc (tốc độ 200 vịng/phút) ở nhiệt độ phịng.
Định lượng đạm do các dịng vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4 , 6, 8 (sau khi chủng).
2.3. Định lƣợng đạm do vi khuẩn sinh ra trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
Phương pháp định lượng:
Chuẩn bị thuốc thử phenol nitroprusside: cân chính xác 5g phenol và 0,025g nitroprusside hịa tan thêm nước cất vào đến 0,5 lít.
Pha buffer: cho 15ml NaOCl cĩ nồng độ (5 – 5,25 %) và 5g NaOH vào 0,5 lit nước cất.
Pha đường chuẩn 0, 1, 2, 3, 4, 5 ppm:
Đường chuẩn 0 ppm gồm cĩ: 5 ml H2O : 0 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 1 ppm gồm cĩ: 4 ml H2O: 1 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 2 ppm gồm cĩ: 3 ml H2O: 2 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 3 ppm gồm cĩ: 2 ml H2O: 3 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 4 ppm gồm cĩ: 1 ml H2O: 4 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đường chuẩn 5 ppm gồm cĩ: 0 ml H2O: 5 ml NH4+, 5 ml buffer, 5 ml thuốc thử
Đo nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn
Hút 1ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf (3 lần lặp lại). Ly tâm 13.000 vịng/phút trong 10 phút.
Hút 0,5ml dịch vi khuẩn đã ly tâm vào 4ml H2O, 5ml buffer, sau đĩ cho 5ml thuốc thử.
Dựa vào sự thay đổi màu của phản ứng giữa thuốc thử và NH4+, đo OD ở bước sĩng 636nm, sau đĩ vẽ đồ thị trên Excel cĩ thể tính được nồng độ NH4+ trong dịch vi khuẩn.
3. Thí nghiệm khảo sát khả năng tổng hợp IAA của một số dịng vi khuẩn phân lập khuẩn phân lập
3.1. Chuẩn bị
Chuẩn bị các dịng vi khuẩn đã tách rịng và mơi trường NFb lỏng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhân sinh khối các dịng vi khuẩn đã tách rịng trong mơi trường PDA lỏng, Ủ lắc trong 2 ngày.
500µl các dịng vi khuẩn đã nuơi vào ống nghiệm chứa 8ml mơi trường NFb lỏng khơng đạm, mỗi nghiệm thức lặp lại ba lần
Lắc các dịng vi khuẩn vừa được chủng vào ống nghiệm trên máy lắc 200 vịng/phút. Trùm kín các ống nghiệm trong bọc nylon đen để tránh IAA tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng (vì chúng dễ bị phân hủy dưới ánh sáng).
3.2. Định lƣợng IAA trong các ngày 2, 4, 6 (sau khi chủng)
Chuẩn bị thuốc thử Salkowski R2: 4,5g FeCl3 trong 1 l H2SO4 10,8M Chuẩn bị phosphat buffer 200 ml:
A: KH2PO4 0,136 g/100 ml nước cất. B: K2HPO4 0,174 g/100 ml nước cất.
Lấy 39ml A, 61ml B cho thêm nước cất vừa đủ 200ml, chỉnh pH = 7 Hút 1,5ml dịch vi khuẩn trong các ống nghiệm cho vào eppendorf. Ly tâm 5.500 vịng/phút trong 10 phút.
Hút cẩn thận 1ml phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào ống nghiệm chứa 2ml thuốc thử.
Ủ hỗn hợp trên trong tối 10 phút để phản ứng xảy ra hồn tồn sau đĩ đo quang phổ OD ở bước sĩng 536nm.
Chuẩn bị đường chuẩn IAA:
o Cân 0,0016g IAA thương mại hịa tan với 10ml phosphat buffer được nồng độ là 160 µg/l. Sau đĩ pha lỗng ra các nồng độ 2,5; 5; 10; 15; 20; 30; 40 µg/ml.
Kết quả đo phổ OD vẽ thành đường chuẩn IAA trên excel với trục tung là OD cĩ giá trị từ 0 – 3. Trục hồnh là nồng độ IAA cĩ giá trị từ 0 – 40µg/ml.
Kết quả đo OD các dịng vi khuẩn phân lập được thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ đĩ tính được nồng độ IAA đã được vi khuẩn tổng hợp.
4. Thí nghiệm khảo sát khả năng hịa tan lân
Chuẩn bị mơi trường NBRIP (Nautiyal, 1999).
Nuơi tăng sinh vi khuẩn trong mơi trường PDA lỏng trong 24 giờ, hút 5µl vi khuẩn nuơi tăng sinh nhỏ giọt vào đĩa mơi trường NBRIP đặc.
Ủ 30o
C trong 12h – 24h.
Quan sát khả năng tạo vịng halo. Đo đường kính halo và khuẩn lạc mỗi ngày Hiệu suất hịa tan lân E được tính theo cơng thức:
100 lạc khuẩn kính Đường halo kính Đường E (C. Nguyenet al., 1992)
5. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các dịng vi khuẩn phân lập đƣợc lập đƣợc
Chuẩn bị mơi trường LB.
Trải vi khuẩn gây bệnh Escherichia coli, Aeromonas hydrophyla lên bề mặt đĩa mơi trường.
Dùng giấy thấm đường kính 0,6cm nhúng vào vi khuẩn nuơi tăng sinh trong mơi trường PDA lỏng và đặt giấy thấm lên bề mặt mơi trường đã trải vi khuẩn gây bệnh.
Ủ ở nhiệt độ phịng trong 12h – 24h. Quan sát khả năng tạo vịng kháng khuẩn.
Đo đường kính vịng sáng kháng khuẩn và khuẩn lạc mỗi ngày. Đường kính (D) vịng sáng kháng khuẩn đươc tính theo cơng thức:
D = đường kính vịng sáng – đường kính khuẩn lạc
6. Nhận diện một số dịng vi khuẩn cĩ đặc tính kháng khuẩn
Sau khi phân lập được các dịng vi khuẩn nội sinh, chọn một số dịng vi khuẩn cĩ khả năng kháng khuẩn để nhận diện bằng phương pháp PCR sử dụng các đoạn mồi 16S rRNA (Lane, 1991) được thiết kế với trình tự sau:
Mồi xuơi 27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mồi ngược 1492R: 5’-TACGGTTACCTTGTTACGACT-3’ Quy trình trích DNA:
Nuơi vi khuẩn trong 6ml mơi trường LB khoảng 14-16h. Chuyển 2ml dung dịch vi khuẩn vào tube 2,2ml.
Ly tâm 13000rpm/5’ (để phá vỡ màng tế bào vi khuẩn). Loại bỏ phần trong, lấy phần tủa.
Hịa tan cặn với 250ul dung dịch TE pH8 (Dung dịch đệm, giữ ADN ổn định trong mơi trường, khơng bị biến tính).
Thêm 50µl dung dịch 10% SDS (Để phá hủy hồn tồn màng tế bào, loại bỏ polysaccharide và lipid) và 5µl Proteinase K (20mg/l) (Để làm phân hủy các protein giúp mẫu sạch hơn).
Ủ ở 65oC trong 20 phút (Xúc tác phản ứng), mỗi 5 phút đảo ngược tube một lần để trộn đều dung dịch.
Thêm 400µl 10% CTAB/0.7M NaCl, trộn đều (Giúp giải phĩng ADN). Ủ ở 65oCtrong 20 phút.
Thêm 600µl Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) (Giúp kéo những phần khơng phải AND xuống phía dưới, AND ở trên và ở giữa cĩ tạo màng protein ngăn cách).
Trộn đều và ly tâm 12000 vịng/phút trong 10 phút.
Dùng pipet chuyển phần trong phía trên vào một tube mới và thêm 1ml Isopropanol lắc đều (Nhằm làm tủa AND), giữ ở -20oC (giữ ADN khơng biến tính và bảo vệ chúng khỏi các enzyme phân huỷ) ít nhất 30 phút (thời gian đủ để phản ứng xảy ra hồn tồn.
Ly tâm trong 10 phút ở 13000 vịng/phút.
Rửa với 1 ml ethanol 70% (Giúp rửa sạch các hố chất đã dùng trước đĩ hay tạp chất cịn lẫn), ly tâm 12000 vịng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần).
Làm khơ ADN ở nhiệt độ phịng trong 1-2h hoặc sấy khơ bằng máy ly tâm chân khơng.
Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành phản ứng PCR. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn biến tính: Phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhệt độ cao (thường từ