Phân lập một số thành phần từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ rễ ngưu bàng

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Với vị trí địa lý và thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, thích hợp cho việc phát triển hệ thực vật phong phú và đa dạng, trong đó đặc biệt kể đến nhóm tài nguyên cây thuốc. Y học dân gian có nhiều cây vừa được dùng làm rau ăn lại vừa được dùng làm thuốc như ngải cứu, cải cúc, rau diếp, …và trong đó có rễ Ngưu bàng. Tại Nhật Bản, rễ Ngưu bàng được sử dụng phổ biến như một loại thức ăn, phối hợp với củ cải trắng, cà rốt và nấm đông cô tạo thành một loại thức ăn bổ dưỡng dưới tên gọi “canh dưỡng sinh”, và được coi như là một phương thuốc chữa bách bệnh. Ở các nước khác trên thế giới (Trung Quốc, Canada, Ấn Độ,…), rễ Ngưu bàng lại là một vị thuốc được dùng để điều trị đái tháo đường, đau xương khớp, trị các bệnh ngoài da, bệnh Gout; có tác dụng làm ra mồ hôi, lọc máu, lợi tiểu, kích thích tiêu hóa. Tại Việt Nam, Ngưu bàng mới chủ yếu dùng quả (Ngưu bàng tử) trong y học cổ truyền làm thuốc điều trị cảm cúm, trị viêm phổi, viêm amidan, trị sốt, chữa hầu họng sưng đau, có tác dụng cầm máu, giải độc, nhuận tràng… còn rễ Ngưu bàng (Ngưu bàng căn) thì hầu như chưa thấy được sử dụng (trước khi xuất hiện “phong trào” nấu canh dưỡng sinh 12) và nghiên cứu. Từ năm 2006, Nguyễn Thái An và cộng sự đã tiến hành khảo sát, nghiên cứu thành phần hóa học của rễ Ngưu bàng có nguồn gốc khác nhau và đã thu được các kết quả bước đầu. Nhằm khai thác nguồn nguyên liệu sẵn có ứng dụng vào phòng và điều trị bệnh song song với việc chứng minh kinh nghiệm sử dụng rễ Ngưu bàng trong dân gian góp phần bổ sung vào kho tàng cây thuốc Việt Nam một dược liệu mới, đề tài: “Phân lập một số thành phần từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ rễ cây Ngưu bàng” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Chiết xuất, phân lập một số thành phần từ phân đoạn chloroform.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN TỪ PHÂN ĐOẠN CHLOROFORM CHIẾT XUẤT TỪ RỄ NGƯU BÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN TỪ PHÂN ĐOẠN CHLOROFORM CHIẾT XUẤT TỪ RỄ NGƯU BÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. Nguyễn Thái An 2. ThS. NCS. Nguyễn Văn An Nơi thực hiện: 1. Bộ môn dược liệu HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS. TS. Nguyễn Thái An ThS. NCS. Nguyễn Văn An những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành khóa luận. Đồng thời tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: PGS. TS. Thái Nguyễn Hùng Thu, DS. Ngô Thị Thu đã cho tôi những đóng góp quý giá về đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành Dược trong suốt 5 năm học. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, động viên tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hằng MỤC LỤC Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình Chương 1: Tổng quan …………………………………………………… 3 1.1. Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật ……………………………… 3 1.1.1. Vị trí phân loại của loài Arctium lappa L. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật họ Cúc (Asteraceae) 3 1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Arctium. 3 1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố loài Arctium lappa L 4 1.2. Thành phần hóa học …………………………………………… 5 1.2.1. Quả 5 1.2.2. Lá 6 1.2.3. Rễ 6 1.3. Tác dụng, công dụng của rễ cây Ngưu bàng …………………11 1.3.1. Tác dụng dược lý của rễ Ngưu bàng 11 1.3.2. Công dụng của rễ Ngưu bàng 14 Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ……………… 15 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị …………………………………… 15 2.1.1. Nguyên liệu 15 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 16 2.2. Phương pháp nghiên cứu …………………………………… 17 2.2.1. Định tính các thành phần hóa học 17 2.2.2. Chiết xuất và phân lập 17 2.2.3. Nhận dạng chất tinh khiết 17 Chương 3: Thực nghiệm, kết quả và bàn luận ……………………… 18 3.1. Chiết xuất ………………………………………………………….18 3.1.1. Xác định độ ẩm dược liệu 18 3.1.2. Chiết xuất 18 3.1.3. Định tính một số nhóm chất trong phân đoạn chloroform bằng phản ứng hóa học 20 3.1.4. Định tính cắn phân đoạn chloroform bằng SKLM 20 3.2. Phân lập ………………………………………………………….23 3.2.1. Chuẩn bị cột 23 3.2.2. Tiến hành 23 3.2.3. Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 26 3.3. Nhận dạng các chất phân lập …………………………………… 30 3.4. Bàn luận …………………………………………………………35 Kết luận và đề xuất ………………………………………………… 38 Kết luận …………………………………………………………………38 Đề xuất ……………………………………………………………… 38 Tài liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ 1 AST Ánh sáng thường 2 H Cắn n-hexan 3 C Cắn chloroform 4 E Cắn ethyl acetat 5 CC Column chromatography 6 PTLC Preparative thin layer chromatography 7 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer 8 EtOAc Ethyl acetat 9 13 C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance 10 1 H-NMR Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance 11 MeOH Methanol 12 MS Mass Spectroscopy 13 Pđ Phân đoạn 14 R f Hệ số di chuyển 15 SKLM Sắc ký lớp mỏng 16 TT Thuốc thử 17 UV 254nm Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 18 UV 365nm Ánh sáng tử ngoại bước sóng 365 nm 19 KHV Kính hiển vi DANH MỤC BẢNG STT Ký hiệu Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1 Một số hợp chất phân lập từ các bộ phận dùng khác nhau của cây Ngưu bàng. 8 2 Bảng 1.2 Tác dụng dược lý của một số hợp chất phân lập từ Ngưu bàng 13 3 Bảng 3.1 Hàm lượng % của các cắn so với khối lượng dược liệu 19 4 Bảng 3.2 Kết quả định tính 1 số nhóm chất trong cắn chloroform 20 5 Bảng 3.3 Kết quả định tính cắn C bằng SKLM khai triển với hệ dung môi III 22 6 Bảng 3.4 Kết quả SKLM của TA05 với 3 hệ dung môi ở AST sau khi phun TT 26 7 Bảng 3.5 Kết quả SKLM của TA06 với 3 hệ dung môi ở AST sau khi phun TT 28 8 Bảng 3.6 Kết quả SKLM của TA07 với 3 hệ dung môi ở UV 365nm khi chưa phun TT 29 9 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR của TA05 30 10 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR của TA06 30 DANH MỤC HÌNH STT Ký hiệu Tên hình Trang 1 Hình 2.1 Ảnh cây Ngưu bàng và một số bộ phận của cây Ngưu bàng 15 2 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ rễ Ngưu bàng 19 3 Hình 3.2 Sắc ký đồ của cắn chloroform với hệ dung môi III ở các điều kiện 22 4 Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ rễ Ngưu bàng 25 5 Hình 3.4 Hình ảnh SKLM của TA05 với 3 hệ dung môi ở AST sau khi phun TT 26 6 Hình 3.5 Sắc ký so sánh TA05 với cắn chloroform 27 7 Hình 3.6 Hình ảnh SKLM của TA06 với 3 hệ dung môi ở AST sau khi phun TT 27 8 Hình 3.7 Sắc ký so sánh TA06 với cắn chloroform 28 9 Hình 3.8 Hình ảnh SKLM của TA07 với 3 hệ dung môi ở UV 365nm 29 10 Hình 3.9 Sắc ký so sánh TA07 với cắn chloroform 29 11 Hình 3.10 Ảnh chụp tinh thể TA05 dưới KHV vật kính 40 30 12 Hình 3.11 Cấu trúc hóa học của hợp chất TA05 32 13 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học của hợp chất TA06 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Với vị trí địa lý và thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng và ẩm, thích hợp cho việc phát triển hệ thực vật phong phú và đa dạng, trong đó đặc biệt kể đến nhóm tài nguyên cây thuốc. Y học dân gian có nhiều cây vừa được dùng làm rau ăn lại vừa được dùng làm thuốc như ngải cứu, cải cúc, rau diếp, …và trong đó có rễ Ngưu bàng. Tại Nhật Bản, rễ Ngưu bàng được sử dụng phổ biến như một loại thức ăn, phối hợp với củ cải trắng, cà rốt và nấm đông cô tạo thành một loại thức ăn bổ dưỡng dưới tên gọi “canh dưỡng sinh”, và được coi như là một phương thuốc chữa bách bệnh. Ở các nước khác trên thế giới (Trung Quốc, Canada, Ấn Độ,…), rễ Ngưu bàng lại là một vị thuốc được dùng để điều trị đái tháo đường, đau xương khớp, trị các bệnh ngoài da, bệnh Gout; có tác dụng làm ra mồ hôi, lọc máu, lợi tiểu, kích thích tiêu hóa. Tại Việt Nam, Ngưu bàng mới chủ yếu dùng quả (Ngưu bàng tử) trong y học cổ truyền làm thuốc điều trị cảm cúm, trị viêm phổi, viêm amidan, trị sốt, chữa hầu họng sưng đau, có tác dụng cầm máu, giải độc, nhuận tràng… còn rễ Ngưu bàng (Ngưu bàng căn) thì hầu như chưa thấy được sử dụng (trước khi xuất hiện “phong trào” nấu canh dưỡng sinh [12]) và nghiên cứu. Từ năm 2006, Nguyễn Thái An và cộng sự đã tiến hành khảo sát, nghiên cứu thành phần hóa học của rễ Ngưu bàng có nguồn gốc khác nhau và đã thu được các kết quả bước đầu. Nhằm khai thác nguồn nguyên liệu sẵn có ứng dụng vào phòng và điều trị bệnh song song với việc chứng minh kinh nghiệm sử dụng rễ Ngưu bàng trong dân gian góp phần bổ sung vào kho tàng cây thuốc Việt Nam một dược liệu mới, đề tài: “Phân lập một số thành phần từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ rễ cây Ngưu bàng” được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Chiết xuất, phân lập một số thành phần từ phân đoạn chloroform. 2 2. Nhận dạng chất phân lập. Để thực hiện các mục tiêu đề ra đề tài được tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau: 1. Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu. 2. Chiết xuất phân đoạn chloroform. 3. Phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn chloroform. 4. Nhận dạng chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ MS, NMR ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT). [...]... giống nhập từ Úc 1.1.4.3 Bộ phận dùng Theo [13], [17] các bộ phận của Ngưu bàng được sử dụng: Quả (Ngưu bàng tử) Rễ ( Ngưu bàng căn) Lá 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 Quả Ngưu bàng: Năm 1994 từ dịch chiết phân đoạn butanol của lá Ngưu bàng, Han BH và cộng sự đã phân lập được arctigenin, arctiin, diarctigenin [28] Theo Min Yong, Gu Kun & Min-Hua Qiu, năm 2007, từ dịch chiết n-BuOH của quả Ngưu bàng, các... học, sắc ký lớp mỏng và phân lập chất tinh khiết Bột rễ Ngưu bàng n-hexan Dịch chiết n-hexan Bã dược liệu Chloroform n-hexan thu hồi Cắn H Dịch chiết chloroform Bã dược liệu Choloroform thu hồi ethylacetat Cắn C Dịch chiết Ethylacetat Bã dược liệu Ethylacetat thu hồi Cắn E Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn từ rễ Ngưu bàng 20 3.1.3 Định tính một số nhóm chất trong phân đoạn chloroform bằng phản... thô, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo, thoáng mát làm nguyên liệu nghiên cứu a b d c e f Hình 2.1 Ảnh cây Ngưu bàng và một số bộ phận của cây Ngưu bàng a) Cây Ngưu bàng lúc mới gieo b) Cây Ngưu bàng 2 năm tuổi c) Lá Ngưu bàng d) Cụm hoa Ngưu bàng e) Quả Ngưu bàng f) Rễ Ngưu bàng 16 - Nơi thu hái: Hà Nội - Thời điểm thu hái: 2/2012 - Mẫu nghiên cứu đã được PGS TS Nguyễn Khắc Khôi - Viện Sinh... các tác giả đã phân lập được mairesinol, lappaol A, lappaol E, lappaol F, lappaol H, arctignan A, arctignan G, arctignan H, neoarctin A [59] Năm 2007, Park SY và cộng sự (Nhật Bản) đã phân lập được isolappaol C, lappaol C, lappaol D, lappaol F, diarctigenin từ dịch chiết phân đoạn dichloromethan [47] chiết xuất từ quả Ngưu bàng Từ quả Ngưu bàng, các nhà khoa học Trung Quốc cũng đã phân lập được arctigenin,... chính xác khoảng 500 g dược liệu , chiết bằng phương pháp chiết nóng với dụng cụ chiết liên tục (Soxhlet) lần lượt với các dung môi n- hexan, chloroform, ethyl acetat Bã dược liệu được để bay hơi tự nhiên và sấy trong tủ sấy dược liệu trước khi cho chiết tiếp với phân đoạn tiếp theo Gộp dịch chiết từng phân đoạn và thu được 3 phân đoạn dịch chiết Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi tới... dopicrin, arctiin và arctigenin Năm 2012, S.Jeelani và M.A Khuroo (Ấn Độ) từ dịch chiết phân đoạn chloroform của lá cây Ngưu bàng, bằng phương pháp chạy sắc ký đã phân lập được 2 hợp chất là 3-hydroxylanosta-5,15-diene và 3-acetoxy-hop-22(29)-ene [35] Ngoài ra trong lá còn chứa men oxydase [13] 1.2.3 Trong rễ Ngưu bàng (Ngưu bàng căn) Rễ Ngưu bàng có chứa: 70% nước [19]; nhóm polysaccharide (inulin khoảng 50%... Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ rễ Ngưu bàng 26 3.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 3.2.3.1 Hợp chất TA05 TA05 được kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM triển khai với 3 hệ dung môi: Hệ I: n – hexan - ethyl acetate (8:1) Hệ II: n – hexan - aceton (8:2) Hệ III: Chloroform - methanol (19:1,5) Quan sát dưới AST sau khi phun thuốc thử valinin trong H2SO4 10% thấy xuất hiện... dụng dược lý của một số hợp chất phân lập từ Ngưu bàng Hợp chất Bộ phận Arctigenin Lá, quả, rễ, hạt Tanin Rễ Tác dụng dược lý Chống ung thư, chống virus Lá, quả, rễ Chống ung thư, ức chế miễn dịch Quả Hoạt động đối kháng Ca++, chống HIV Lappaol F Quả, hạt Ức chế sản xuất NO Diarctigenin Quả, rễ, hạt Ức chế sản xuất NO Beta-eudesmol Quả Caffeic acid Chlorogenic acid Thân cây, vỏ rễ Lá, vỏ rễ [41] [24],... liệu - Phần hóa học [3] - Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [11] 2.2.2 Chiết xuất và phân lập - Chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với dụng cụ chiết liên tục (Soxhlet) sử dụng dung môi: n-hexan, chloroform, ethyl acetat - Sử dụng phương pháp sắc ký cột (CC) với chất phụ là silicagel - Sử dụng sắc ký điều chế (PTLC) - Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập bằng SKLM với một số hệ dung... Tiến hành • Cắn chloroform (10,36 g) được phân lập trên cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n – hexan- aceton (20:1) Các phân đoạn được kiểm tra bằng SKLM, thu được 4 phân đoạn C1 (1,15 g), C2 (3,21 g) , C3 (1,09 g), C4 (0,23g) Phân đoạn C2 (3,21g) tiếp tục được chạy cột silicagel, rửa giải với hệ dung môi n-hexan: aceton (6:1) Các phân đoạn được kiểm tra bằng SKLM, thu được 3 phân đoạn C21 (2,03 . dụng rễ Ngưu bàng trong dân gian góp phần bổ sung vào kho tàng cây thuốc Việt Nam một dược liệu mới, đề tài: Phân lập một số thành phần từ phân đoạn chloroform chiết xuất từ rễ cây Ngưu bàng . phận của Ngưu bàng được sử dụng: Quả (Ngưu bàng tử). Rễ ( Ngưu bàng căn). Lá. 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC. 1.2.1 Quả Ngưu bàng: Năm 1994 từ dịch chiết phân đoạn butanol của lá Ngưu bàng, Han. TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THU HẰNG PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN TỪ PHÂN ĐOẠN CHLOROFORM CHIẾT XUẤT TỪ RỄ NGƯU BÀNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI