Phân lập một số thành phần từ hoa cây gạo và thử độc tính cấp của cao lỏng hoa gạo

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ TRUNG ĐỨC PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN TỪ HOA CÂY GẠO VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CAO LỎNG HOA GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ TRUNG ĐỨC PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN TỪ HOA CÂY GẠO VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CAO LỎNG HOA GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: NCS. Hồ Thị Thanh Huyền Nơi thực hiện: Bộ môn Dược liệu – Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Dược lý – Đại học Y Hà Nội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình làm khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ từ thầy cô, gia đình, bạn bè. Những sự giúp đỡ quý báu đó đã giúp tôi hoàn thành khóa luận, đồng thời cũng cho tôi hiểu biết thêm nhiều điều về cách tƣ duy trong nghiên cứu khoa học. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn NCS. Hồ Thị Thanh Huyền đã trực tiếp hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Tôi cũng xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Thái An đã giúp đỡ và cho tôi những ý kiến đánh giá về đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, kỹ thuật viên trong Bộ môn Dƣợc liệu, Dƣợc học cổ truyền, Bộ môn Dƣợc lý – Đại học Y Hà Nội và các phòng ban khác trong nhà trƣờng đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi thực hiện khóa luận này. Tôi xin trân cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện để tôi có thể lĩnh hội những kiến thức quý giá về ngành Dƣợc trong suốt 5 năm học. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều để tôi có thêm sự nhiệt tình và say mê trong nghiên cứu khoa học. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Vũ Trung Đức MỤC LỤC Trang DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng 1. TỔNG QUAN……………………………………….…………… 3 1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật……………………………………….3 1.1.1. Vị trí phân loại của chi Bombax L…………………………………………… 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật của họ Gạo……………………………………………3 1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Bombax L……………………………3 1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Bombax malabaricum DC………4 1.2. Thành phần hóa học……………………………………………… 6 1.3. Tác dụng dƣợc lý………………………………………………………… 12 1.4. Tính vị, công dụng……………………………………………… 14 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………… 16 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU……………………….16 2.1.1. Nguyên liệu………………………………………………………………16 2.1.2. Phƣơng tiện nghiên cứu………………………………………… 16 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………………… 17 2.2.1. Định tính…………………………………………………………………17 2.2.2. Chiết xuất……………………………………………………………… 17 2.2.3. Phân lập………………………………………………………… 18 2.2.4. Nhận dạng phân lập…………………………………………………… 19 2.2.5. Đánh giá độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo……………………………19 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ………………………………….20 3.1. GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY ………………………… 20 3.2. CHIẾT XUẤT……………………………….………………………… 20 3.3. ĐỊNH TÍNH CẮN TOÀN PHẦN METHANOL BẰNG SKLM……… 22 3.4. PHÂN LẬP………………………………………………………………. 25 3.4.1. Phân lập lần thứ 1……………………………………………………… 25 3.4.2. Phân lập lần thứ 2……………………………………………………… 25 3.5. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CAO LỎNG HOA GẠO………… 30 3.6. BÀN LUẬN……………………………………………………………… 33 Chƣơng 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………… 36 4.1. KẾT LUẬN……………………………………………………………….36 4.2. ĐỀ XUẤT…………………………………………………………………36 Tài liệu tham khảo Phụ lục DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ đầy đủ 1 13 C-NMR Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance 2 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance 3 AST Ánh sáng thƣờng 4 DEPT Distortionless Enhacement by Polarization Tranfer 5 DMSO Dimethyl sulfoxid 6 DPPH 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl 7 HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation 8 HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence 9 LD 50 Lethal dose 50% 10 MS Mass spectrometry 11 SKLM Sắc ký lớp mỏng 12 STT Số thứ tự 13 TLTK Tài liệu tham khảo 14 TT Thuốc thử 15 UV Ultra Violet DANH MỤC BẢNG STT Ký hiệu Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1 Một số hợp chất hóa học phân lập từ hoa cây Gạo 8 2 Bảng 3.1 Hiệu suất chiết các cắn từ hoa cây Gạo 22 3 Bảng 3.2 Kết quả định tính cắn methanol bằng SKLM với hệ I 24 4 Bảng 3.3 Kết quả SKLM của BBH-2 với 3 hệ dung môi 27 5 Bảng 3.4 Tỷ lệ chuột chết theo liều dùng thuốc trong 72 giờ sau uống cao lỏng toàn phần hoa Gạo 31 DANH MỤC HÌNH STT Ký hiệu Tên hình Trang 1 Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất cắn các phân đoạn từ hoa cây Gạo 21 2 Hình 3.2 Sắc ký đồ cắn methanol với 4 hệ dung môi ở UV 365nm 23 3 Hình 3.3 Sắc ký đồ của cắn methanol với hệ dung môi I 23 4 Hình 3.4 Sơ đồ phân lập các chất từ hoa cây Gạo 26 5 Hình 3.5 Sắc ký đồ hợp chất BBH-2 ở AST, phun TT 27 6 Hình 3.6 Sắc ký đồ so sánh cắn toàn phần với cắn BBH-2 ở AST, phun TT 28 7 Hình 3.7 Ảnh hợp chất BBH-2 đã đƣợc phân lập 28 8 Hình 3.8 Sơ đồ cắt mảnh trên phổ ESI-MS của phân tử BBH- 2 29 9 Hình 3.9 Công thức cấu tạo của BBH-2 30 10 Hình 3.10 Hình ảnh thực nghiệm quá trình đánh giá độc tính cấp trên chuột 32 11 Hình 3.11 Đồ thị tƣơng quan tuyến tính giữa liều dùng cao lỏng toàn phần hoa Gạo và tỷ lệ chuột chết 32 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam nằm trọn trong vành đai nhiệt đới ẩm gió mùa, tuy nhiên, do có sự ảnh hƣởng của địa hình phức tạp nên khí hậu nƣớc ta có sự khác nhau cơ bản giữa các vùng miền, chính điều đó đã tạo nên nguồn tài nguyên thực vật phong phú. Về thực vật, tổng số loài ƣớc đoán ở Việt Nam vào khoảng 12.000 loài [11]. Nguồn tài nguyên này đang đƣợc các cộng đồng thuộc 54 dân tộc khác nhau sử dụng trong chăm sóc sức khỏe, chữa trị bệnh tật cũng nhƣ phục vụ các nhu cầu sinh kế khác [5]. Theo các công bố gần đây, đã phát hiện 3.850 loài cây cỏ làm thuốc ở Việt Nam, trong đó có gần 1.000 loài thƣờng đƣợc sử dụng trong dân gian, 300 loài đƣợc sử dụng trong nền y học cổ truyền chính thống và khoảng 230 loài đƣợc sử dụng trong công nghiệp Dƣợc [5]. Nhân dân ta đã biết sử dụng nhiều cây cỏ để làm thuốc từ lâu đời, đi cùng với đó là một hệ thống những kinh nghiệm dân gian của việc thu hái, chế biến, bảo quản… Ngành y dƣợc học dân tộc của nƣớc ta có một lịch sử phát triển rực rỡ, với nhiều các bài thuốc cổ truyền, cùng với sự giao thoa của nền y học cổ truyền Trung Hoa… Tất cả những điều này đã cho thấy nghiên cứu phát triển thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu là hƣớng đi tƣơng lai của ngành y dƣợc Việt Nam. Cây Gạo còn có tên gọi khác là mộc miên, mày rừng… là loài cây khá thân quen với ngƣời dân Việt Nam, nhất là vùng nông thôn phía Bắc. Cây Gạo đã đi vào đời sống tinh thần của ngƣời dân qua những bài ca dao và câu tục ngữ dân gian. Đến cuối xuân, ở những cây Gạo cổ thụ, lá sẽ rụng hết và đó là lúc hoa bắt đầu nở rộ một màu đỏ tƣơi rực rỡ… Cây Gạo ngoài cái vẻ nên thơ đó còn đƣợc dùng phổ biến làm thuốc chữa bệnh theo kinh nghiệm dân gian, trong đó hoa Gạo đƣợc sử dụng cho ngƣời thiếu máu nhƣợc sắc, rong kinh, đa kinh, chảy máu dạ dày, mất máu sau mổ, giúp ăn ngủ tốt, tăng cân Bệnh viện Quân y 108 (Khoa Tiêu hóa và Huyết học) đã dùng cao lỏng hoa Gạo 2/1 để điều trị thiếu máu nhƣợc sắc do rong kinh, đa kinh, sau mổ, chảy máu do viêm loét dạ dày - tá tràng cho 75 bệnh nhân, thấy có kết quả tốt [14]. Tại Trung Quốc năm 2011, một số nghiên cứu khoa học 2 cho thấy hoa Gạo có tác dụng chống oxy hóa, và có thể đây sẽ là một nguồn cung cấp chất chống oxy hóa đầy tiềm năng [43]. Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã bƣớc đầu khảo sát thành phần hóa học của hoa cây Gạo và phân lập đƣợc hai hợp chất là 5α,8α-epidioxyergosta- 6,22-dien-3β-ol và aurantiamid acetat [10]. Nhằm nghiên cứu sâu hơn thành phần hóa học và hƣớng đến thử tác dụng sinh học của hoa cây Gạo, đề tài “Phân lập một số thành phần từ hoa cây Gạo và thử độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo” đƣợc tiến hành nhằm các mục tiêu sau: 1. Phân lập một số thành phần từ hoa cây Gạo. 2. Bƣớc đầu đánh giá độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo. Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài đƣợc tiến hành với các nội dung sau: 1. Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu. 2. Chiết xuất và phân lập một số thành phần từ dịch chiết methanol của hoa cây Gạo. 3. Nhận dạng chất phân lập dựa trên các dữ liệu phổ. 4. Đánh giá độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo bằng phƣơng pháp Litchfield – Wilcoxon. [...]... dạng chất phân lập Xác định một số tính chất hợp chất phân lập nhƣ màu sắc, dạng kết tinh, độ tan, nhiệt độ nóng chảy Dựa vào các dữ liệu phổ ESI-MS, NMR để xác định công thức phân tử và cấu trúc hóa học của các chất phân lập 2.2.5 Đánh giá độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo Thử độc tính cấp của dịch nƣớc sắc hoa Gạo theo phƣơng pháp Litchfield – Wilcoxon Chuột thí nghiệm đƣợc chia ngẫu nhiên thành các... hứng dịch rửa giải vào các bình nón hay ống nghiệm Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng, gộp những phân đoạn có thành phần tƣơng tự nhau thành các phân đoạn mới Tinh chế chất phân lập: sử dụng phƣơng pháp kết tinh lại hoặc rửa nhiều lần bằng dung môi ít hòa tan chất phân lập 19 Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập: sau quá trình phân lập, độ tinh khiết của chất phân lập đƣợc kiểm tra bằng... catechutannic [6] Nụ hoa và đài (tính theo dƣợc liệu tƣơi) chứa protein thô theo thứ tự lần lƣợt là 1,38 mg và 1,56 mg, carbohydrat 11,95 mg% và 13,87 mg%, chất vô cơ 1,09 mg% và 1,00 mg%, Ca 92,25 mg% và 95 mg%, P 49 mg% và 41 mg%, Mg 54 mg% và 24,64 mg% [14] Năm 2012, Phạm Văn Đức đã tiến hành định tính và xác định sự có mặt của một số nhóm chất trong hoa Gạo, kết quả cho thấy trong hoa Gạo có chứa các... cấp của hoa Gạo Rehman và các cộng sự đã đánh giá độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo qua đƣờng uống và đƣờng tiêm tĩnh mạch trên chuột nhắt và chuột cống trắng Kết quả đã cho thấy rằng mức độ và dấu hiệu độc phụ thuộc rất lớn vào liều dùng LD50 của đƣờng uống trên chuột cống là 6768,730mg/kg Đƣờng tiêm tĩnh mạch lần lƣợt là 889,496 và 467,84 mg ở chuột cống và chuột nhắt [31] 1.4 Tính vị, công dụng Trong... chung của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống chế phẩm thử đầu tiên 20 CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC CỦA CÂY Để giám định chính xác tên khoa học của loài nghiên cứu, cành mang hoa và cành mang lá của cây Gạo đƣợc thu hái để tiến hành quan sát, phân tích Đối chiếu đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu với tiêu bản lƣu trữ của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Viện Khoa... acid amin và acid hữu cơ [10] Năm 1972, Gopal H và Gupta RK đã phân lập đƣợc 6 hợp chất từ hoa Gạo bao gồm β-sitosterol, β-D-glucoside của β-sitosterol, hentriacontane, hentriacontanol, kaempferol và quercetin [23] Năm 1973, Niranjan GS đã phân lập đƣợc 7-methylether-3βglucopyranoside và pelargonidin-5β-glucopyranoside từ dịch chiết methanol của cánh hoa [27] Năm 1974, nghiên cứu của Rizvi SAI và Saxena... triển và duy trì sự sống của Lp và Bp tƣơng đƣơng với sự gia tăng nồng độ hoa Gạo, nhƣng lại ít làm tăng St Do đó có thể xem xét sử dụng dịch chiết này làm môi trƣờng nuôi cấy [26] Một cuộc khảo sát đƣợc tiến hành ở miền nam Punjab, Pakistan ngƣời ta còn thấy rằng ngƣời chăn nuôi gia súc còn cho thêm hoa Gạo vào thức ăn chăn nuôi để làm thuốc chữa giun sán cho động vật [16]  Độc tính cấp của hoa Gạo. .. khi phun thuốc thử:  Ánh sáng thƣờng: 9 vết 3.4 PHÂN LẬP 3.4.1 Phân lập lần thứ 1 Mẫu phân lập: 4,17 g cắn BBH-C Dung môi phản hấp phụ: aceton-nƣớc (6:1) Kiểm tra thành phần dịch hứng ở các ống bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan - ethylacetat (2:1), gộp những ống có sắc ký đồ gần giống nhau thành các phân đoạn mới Lựa chọn phân đoạn gồm các ống từ 24 đến 29 để tiến hành phân lập tiếp, kí hiệu... nƣớc ta, cây mọc tự nhiên và đƣợc trồng ở hầu khắp các tỉnh [8] Một số loài khác thuộc chi Bombax đƣợc phân bố nhƣ sau: B albidum: phân bố ở Việt Nam, Campuchia [45] B insigne: phân bố ở Ấn Độ, Việt Nam, Lào, Myanma [33] B cambodiense: phân bố ở Campuchia, Lào, Malaysia và Việt Nam [22] B buonopozense: phân bố ở phía tây bắc Sierra Leone, đông Uganda và nam Gabon [20] B costatum: phân bố từ đông Senegal... Dùng cho 75 bệnh nhân uống mỗi ngày 100 ml cao lỏng hoa Gạo từng đợt 30 ngày Kết quả đạt 90% tăng cân, ăn ngủ tốt [14] 16 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu - Mẫu nghiên cứu: + Cành mang hoa, lá tƣơi để giám định tên khoa học + Hoa cây Gạo, sấy ở 600C đến khô, nghiền thành bột thô, cho vào trong túi nilon kín, bảo quản ở nơi khô . đến thử tác dụng sinh học của hoa cây Gạo, đề tài Phân lập một số thành phần từ hoa cây Gạo và thử độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo đƣợc tiến hành nhằm các mục tiêu sau: 1. Phân lập một số. Chiết xuất và phân lập một số thành phần từ dịch chiết methanol của hoa cây Gạo. 3. Nhận dạng chất phân lập dựa trên các dữ liệu phổ. 4. Đánh giá độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo bằng phƣơng. BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ TRUNG ĐỨC PHÂN LẬP MỘT SỐ THÀNH PHẦN TỪ HOA CÂY GẠO VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CAO LỎNG HOA GẠO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SỸ