Để giám định chính xác tên khoa học của loài nghiên cứu, cành mang hoa và cành mang lá của cây Gạo đƣợc thu hái để tiến hành quan sát, phân tích.
Đối chiếu đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu với tiêu bản lƣu trữ của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), dƣới sự giúp đỡ của TS. Đỗ Thị Xuyến (cán bộ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), mẫu nghiên cứu đƣợc giám định tên khoa học là Bombax ceiba L, còn có tên đồng danh là
Bombax malabaricum DC, thuộc họ Gạo (Bombacaceae) (Phụ lục 1). 3.2. CHIẾT XUẤT.
Cân chính xác khoảng 360,85 g bột hoa Gạo, chiết bằng phƣơng pháp ngâm lạnh trong dung môi methanol ở nhiệt độ phòng. Dịch chiết đƣợc lọc và cất thu hồi dung môi dƣới áp suất giảm thu đƣợc 19,45 g cắn.
Hiệu suất chiết: X = 5,39%.
Cắn đƣợc hòa tan vào nƣớc cất nóng 600C. Bằng phƣơng pháp chiết lỏng-lỏng, dịch chiết nƣớc đƣợc chiết lần lƣợt với các dung môi có độ phân cực tăng dần là: n-hexan, chloroform, ethylacetat và còn lại dịch nƣớc sau khi đã lắc với các dung mối trên.
Kết quả: thu đƣợc 4 phân đoạn dịch chiết kí hiệu lần lƣợt là BBH-A, BBH-B, BBH-C, BBH-D. Các dịch chiết đƣợc cất thu hồi dung môi đến cắn có khối lƣợng không đổi. Cân cắn đƣợc khối lƣợng lần lƣợt là 2,78 g; 6,25 g; 4,17 g; 6,25 g. Quá trình chiết xuất đƣợc mô tả ở hình 3.1.
Hình 3.1: Sơ đồ chiết xuất cắn các phân đoạn từ hoa cây Gạo
Bột hoa Gạo
Ngâm chiết methanol 3 lần, lọc
Dịch chiết methanol
Dịch chiết nƣớc Cắn toàn phần MeOH thu hồi
Nƣớc cất 600 C n-hexan Dịch chiết n- hexan Dịch chiết 1 CHCl3 Dịch chiết CHCl3 Dịch chiết 2 Dịch chiết ethylacetat Dịch nƣớc EtOAc
EtOAc thu hồi
Cắn BBH-C Cắn BBH-A Cắn BBH-B CHCl3 thu hồi Cắn BBH-D n-hexan thu hồi
Hiệu suất chiết của cắn 3 phân đoạn so với cắn toàn phần đƣợc tổng hợp trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Hiệu suất chiết các cắn từ hoa cây Gạo
STT Phân đoạn Khối lượng cắn
(g) % so với cắn toàn phần (kl/kl) 1 n-hexan 2,78 14,29 2 Chloroform 6,25 32,13 3 Ethylacetat 4,17 21,44 3.3. ĐỊNH TÍNH CẮN TOÀN PHẦN METHANOL BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG
Bản mỏng: silicagel GF254, hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
Dung dịch chấm sắc ký: cắn methanol hòa tan trong methanol. Các hệ dung môi khai triển:
Hệ I: toluen- aceton - ethylacetat (4:1:1) Hệ II: n-hexan- ethylacetat (5:2)
Hệ III: chloroform- aceton- methanol (6:1:1) Hệ IV: toluene- aceton-methanol (6:1:1)
Thuốc thử: dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
Điều kiện phát hiện vết: ánh sáng thƣờng, UV254nm và UV365nm
Tiến hành: chấm mẫu thử lên bản mỏng, sấy nhẹ cho bay hết dung môi, đặt vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi. Quan sát kết quả thu đƣợc ở các điều kiện ánh sáng thƣờng, UV254nm và UV365nm. Sau đó phun thuốc thử, sấy ở 110oC, quan sát ở ánh sáng thƣờng.
Hệ I Hệ II Hệ III Hệ IV
Hình 3.2: Sắc ký đồ cắn methanol với 4 hệ dung môi ở UV365nm
Sau nhiều lần khai triển thấy hệ I cho sắc ký đồ tách tốt nhất. Hệ I tiếp tục đƣợc triển khai SKLM cho cắn methanol. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.3 và bảng 3.2.
(1) (2) (3) (4)
Hình 3.3. Sắc ký đồ của cắn methanol với hệ dung môi I
(1) AST, không phun TT (2) UV254nm, không phun TT (3) UV365nm, không phun TT (4) AST, phun TT
Bảng 3.2. Kết quả định tính cắn methanol bằng SKLM với hệ I
STT Trƣớc khi phun TT Sau khi phun
TT Rf×100 AST UV254nm UV365nm AST 1 Xanh lơ (++) Xám (+) 2,70 2 Xám (++++) Xanh nhạt (+) Tím đen (++) 20,27 3 Xám (++) Trắng hồng (++) Nâu (++) 28,38 4 Xám (+) 32,43 5 Xám (+++) Trắng hồng (++++) Nâu đen (+) 47,30 6 Xám (++) Xanh đậm (++++) Nâu (+++) 39,05 7 xám (+++) Nâu (+++) 50,00
8 Xanh lam (+++) Nâu đen (+++) 71,62
9 Xám (++) Xanh lơ (++) Vàng nâu
(++++) 79,75 10 Xám (+) Nâu (++) 86,49 11 Xám đen (++++) Trắng hồng (++++) 95,95 Ghi chú: (+): rất mờ (++): mờ (+++): rõ (++++): rất rõ
Nhận xét: sau khi khai triển sắc ký lớp mỏng cắn methanol trên 4 hệ dung môi, nhận thấy hệ I cho sắc ký đồ tách tốt nhất và cắn methanol khai triển với hệ I cho kết quả nhƣ sau:
Ánh sáng thƣờng: không có vết.
Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 254 nm: 9 vết Ánh sáng tử ngoại bƣớc sóng 365 nm: 8 vết + Sau khi phun thuốc thử:
Ánh sáng thƣờng: 9 vết 3.4. PHÂN LẬP
3.4.1. Phân lập lần thứ 1
Mẫu phân lập: 4,17 g cắn BBH-C.
Dung môi phản hấp phụ: aceton-nƣớc (6:1).
Kiểm tra thành phần dịch hứng ở các ống bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan - ethylacetat (2:1), gộp những ống có sắc ký đồ gần giống nhau thành các phân đoạn mới. Lựa chọn phân đoạn gồm các ống từ 24 đến 29 để tiến hành phân lập tiếp, kí hiệu là BBH-C2. Để bay hơi tự nhiên đến khối lƣợng không đổi thu đƣợc khối lƣợng 1,28 g.
3.4.2. Phân lập lần thứ 2
Mẫu phân lập: 1,28 g cắn BBH-C2.
Dung môi phản hấp phụ: n-hexan- ethylacetat (5:2).
Kiểm tra thành phần dịch hứng các ống bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan - aceton (5:1), gộp những ống có sắc ký đồ gần giống nhau thành các phân đoạn mới. Sau khi để bay hơi tự nhiên nhận thấy có một phân đoạn gồm các ống từ 32 đến 46 xuất hiện một chất lỏng dạng dầu, ký hiệu chất đó là BBH-2. Cân đƣợc khối lƣợng 4,2 mg. Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM. Quá trình phân lập đƣợc tiến hành nhƣ hình 3.4.
Hình 3.4. Sơ đồ phân lập các chất từ hoa cây Gạo
Kiểm tra độ tinh khiết của BBH-2 bằng sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng: silicagel GF254 của Merck đã đƣợc hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
Dung dịch chấm sắc ký: Hòa tan BBH-2 bằng methanol. Các hệ dung môi khai triển:
Hệ I: toluen- aceton-ethyl acetat (4:1:1)
Hệ II: n-hexan- ether ethylic- acid acetic (5:5:0,1 ) Hệ III: n-hexan- aceton (5:1)
Thuốc thử: dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
Điều kiện phát hiện vết: ánh sáng thƣờng, UV254nm và UV365nm
Trƣớc khi phun thuốc thử, quan sát bản mỏng dƣới ánh sáng thƣờng, UV254 và UV365 thấy không xuất hiện vết. Sau khi phun thuốc thử, quan sát dƣới ánh sáng thƣờng đều chỉ thấy xuất hiện một vết. Vì vậy sơ bộ kết luận BBH-2 là một hợp chất tinh khiết. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.5 và
Cắn EtOAc BBH-C (4,17g) CC, silicagel Aceton : nƣớc (6:1) BBH-C2 (1,28g) BBH-2 (4,2 mg) CC, silicagel n-hexan : ethylacetat (5:2)
bảng 3.3.
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.5: Sắc ký đồ hợp chất BBH-2 ở AST, phun TT.
Bảng 3.3. Kết quả SKLM của BBH-2 với 3 hệ dung môi.
Hệ dung môi I II III
Rf ×100 42 26 14
Màu sắc Tím Tím Tím
Ngoài ra, tiến hành sắc ký so sánh cắn toàn phần và cắn BBH-2 trên cùng một bản mỏng, hệ dung môi khai triển là hệ I, kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.6.
Hình 3.6: Sắc ký đồ so sánh cắn toàn phần với cắn BBH-2 ở AST, phun TT
Nhận dạng BBH-2:
Hợp chất BBH-2 là chất lỏng dạng dầu, không màu (hình 3.7).
Hình 3.7: Ảnh hợp chất BBH-2 đã được phân lập
Phổ 1H-NMR cho thấy đây là một hợp chất có mạch thẳng chứa 2 nối đôi với 4 proton nằm ở 5,40 ppm.
Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 18 nguyên tử carbon. Trong đó dựa vào kết quả của phổ DEPT cho thấy hợp chất này có 1 carbon methyl (-CH3), 12 carbon methylen (-CH2), 4 carbon methin (-CH).
Nhóm carboxylic (-COOH) đƣợc xác nhận bởi tín hiệu của 1 carbon tại 179,8 ppm. Nhƣ vậy đây là một acid béo không no mạch thẳng. Các dữ kiện phổ này cho phép dự đoán BBH-2 là octadeca-9,12-dienoic acid.
COOH (1) m/ z: 235.0 (2) m/z: 265.1 m/ z: 170.2 (3) (4) m/ z: 210.5
Hình 3.8: Sơ đồ cắt mảnh trên phổ ESI-MS của phân tử BBH – 2
Để xác định chính xác dộ dài mạch carbon và vị trí của nối đôi trong phân tử hợp chất BBH-2, phổ khối lƣợng đã đƣợc đo. Trên phổ ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 281,5 [M+H]+ tƣơng ứng với công thức phân tử C18H32O2 (M = 280).
Trên phổ khối lƣợng bắn mảnh xuất hiện mảnh phân tử tại m/z 265,1 tƣơng ứng công thức C17H29O2, phân tử BBH-2 bị cắt mảnh ở vị trí (1); mảnh phân tử tại m/z 235,0 tƣơng ứng với công thức C17H31, phân tử BBH-2 bị cắt tại vị trí (2) chứng tỏ một đầu mạch của BBH-2 là gốc -COOH và một đầu mạch là gốc -CH3. Mảnh phân tử tại m/z 107,2 tƣơng ứng với công thức C10H18O2 và mảnh m/z 112,0 tƣơng ứng với công thức C8H16, chứng tỏ phân tử BBH-2 bị cắt mảnh ở vị trí (3) trên hình; mảnh phân tử m/z 210,5 tƣơng ứng với công thức C13H22O2 phân tử BBH-2 bị cắt mảnh ở vị trí (4). Từ vị trí
cắt (3) và (4) của phân tử suy ra nối đôi đƣợc xác định ở vị trí C-9/C-10 và C- 12/C-13 của phân tử BBH-2. Các vị trí cắt mảnh trên phổ ESI-MS của phân tử BBH-2 đƣợc mô tả ở hình 3.8.
Từ tất cả các phân tích nêu trên, cùng với số liệu phổ khối lƣợng ESI-MS cho phép khẳng định hợp chất BBH-2 là một acid mạch dài có CTPT C18H32O2 có cấu trúc nhƣ hình 3.9 và có tên gọi là Octadeca-9,12-dienoic acid.
O OH
Hình 3.9. Công thức cấu tạo của BBH – 2
3.5. ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA CAO LỎNG HOA GẠO Chuẩn bị cao 8:1 Chuẩn bị cao 8:1
Cân khoảng 1200 g hoa Gạo khô chia làm 5 lần sắc trên bình sắc thuốc. Mỗi lần sắc cho nƣớc ngập mặt dƣợc liệu và sắc đến khi còn khoảng 300 ml. Gạn nƣớc sắc vào cốc có mỏ, lọc nóng qua bông vào một cốc có mỏ khác. Tiếp tục cho nƣớc vào bã dƣợc liệu trên và sắc tiếp 2 lần nữa. Gộp các nƣớc sắc lại và cô trên bếp điện đến khi còn khoảng 150 ml, ta thu đƣợc cao 8:1.
Kết quả nghiên cứu
Sau khi uống cao lỏng toàn phần hoa Gạo ở các liều thấp dƣới 320 g dƣợc liệu/kg chuột không có hiện tƣợng gì đặc biệt: ăn uống, vận động bình thƣờng, chuột không bị khó thở, không bị tiêu chảy. Các liều cao, chuột có
hiện tƣợng khó thở sau uống thuốc thử 1 giờ, khó thở và co giật chủ yếu xảy ra trong 24 giờ đầu sau uống thuốc thử, xuất hiện chuột chết. Tỷ lệ chuột chết trong vòng 72 giờ đƣợc ghi lại trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Tỷ lệ chuột chết theo liều dùng thuốc trong 72 giờ
sau uống cao lỏng toàn phần hoa Gạo
STT Thể tích uống (ml/kg) Liều dùng (g dƣợc liệu/kg) Tỷ lệ chuột chết theo liều (%) 1 40,00 320 0 2 45,00 360 10 3 50,00 400 20 4 55,00 440 20 5 60,00 480 20 6 62,50 500 40 7 65,00 520 50 8 67,50 540 60 9 70,00 560 70 10 72,50 580 90 11 75,00 600 100
(1) (2)
Hình 3.10: Hình ảnh thực nghiệm quá trình đánh giá độc tính cấp trên chuột
(1): Một lô chuột được sử dụng để thực nghiệm (2): Chuột đang được cho uống cao lỏng hoa Gạo
Từ kết quả bảng 3.4 vẽ đƣợc đồ thị tƣơng quan tuyến tính sau
Hình 3.11: Đồ thị tương quan tuyến tính giữa liều dùng cao lỏng
toàn phần hoa Gạo và tỷ lệ chuột chết
Từ đồ thị trên tính đƣợc phƣơng trình tƣơng quan tuyến tính giữa liều dùng và tỷ lệ chuột chết: y = 0,3381x – 119,29
Vậy LD50 = 500,71 ± 28,28 (g dƣợc liệu/kg)
LD50 của cao lỏng hoa BB
y = 0.3381x - 119.29 R2 = 0.8726 -20 0 20 40 60 80 100 120 0 200 400 600 800 Liều dùng (g/kg) T ỷ lệ c h u ộ t ch ết ( % )
Kết luận:
- Liều cao nhất không gây chết chuột nhắt trắng là 320 g dƣợc liệu/kg chuột.
- Liều thấp nhất gây chết 100% số chuột nhắt trắng là 600 g dƣợc liệu/kg chuột.
- Xác định đƣợc LD50 của cao lỏng toàn phần hoa Gạo là 500,71 ± 28,28 (g dƣợc liệu/kg)
3.6. BÀN LUẬN
Cây Gạo là loài mọc phổ biến ở các vùng nông thôn từ Quảng Bình trở ra, , cây Gạo nói chung và hoa Gạo nói riêng trong y học cổ truyền đã đƣợc sử dụng để chữa một số loại bệnh nhƣ kiết lỵ, tiêu chảy, viêm ruột, thiếu máu suy nhƣợc [6]. Từ các kết quả nghiên cứu trên thế giới những năm vừa qua có thể thấy rằng hoa Gạo có nhiều tác dụng quý phù hợp với mô hình bệnh hiện đại nhƣ ung thƣ, tim mạch và đây là nguồn dƣợc liệu dồi dào có thể khai thác ở quy mô lớn; tuy nhiên dƣợc liệu này vẫn chỉ đƣợc sử dụng theo kinh nghiệm dân gian. Chính vì vậy việc nghiên cứu thêm về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của hoa Gạo là rất cần thiết.
Về chiết xuất, đã tiến hành chiết xuất các nhóm chất trong hoa cây Gạo bằng phƣơng pháp ngâm lạnh với dung môi methanol. Từ cắn toàn phần tách phân đoạn sử dụng lần lƣợt 3 dung môi là n-hexan, chloroform và ethylacetat thu đƣợc cắn n-hexan, cắn chloroform và cắn ethylacetat. Xác định đƣợc hàm lƣợng của cắn các phân đoạn so với cắn toàn phần và khối lƣợng dƣợc liệu ban đầu. Trong đó, hiệu suất chiết cắn chloroform cao hơn cắn ethylacetat và cắn n-hexan. Từ cắn ethylacetat, tiến hành phân lập các chất bằng cách sử dụng sắc ký cột với hỗn hợp dung môi aceton : nƣớc (6:1) thu đƣợc các phân đoạn mới, lựa chọn phân đoạn BBH-C2 trong số đó đem tiến hành phân lập tiếp thu đƣợc một chất là BBH-2. Dựa vào dữ liệu phổ MS, NMR xác định
đƣợc cấu trúc của BBH-2 là Octadeca-9,12-dienoic acid hay còn gọi là acid linoleic. Đây là công bố đầu tiên về sự có mặt của acid linoleic trong hoa cây Gạo. Do đó việc phân lập đƣợc acid linoleic là một đóng góp mới của khóa luận, bổ sung thêm các chất phân lập đƣợc từ cây Gạo nói chung và hoa Gạo nói riêng. Acid linoleic có nhiều trong các loài thực vật, trong đó có hàm lƣợng cao ở hạt các loài cây nhƣ vừng, hƣớng dƣơng, đậu tƣơng.
Octadeca-9,12-dienoic acid còn gọi là acid linoleic hay omega-6 là một acid béo không no thiết yếu, đƣợc sử dụng trong cơ thể để sinh tổng hợp acid arachidonic và sau đó là Prostagladin E1 - một loại prostaglandin trong cơ thể có tác dụng hủy fibrin và chống kết tập tiểu cầu, ức chế chức năng bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính do đó có tác dụng bảo vệ tim mạch, ngăn ngừa nhồi máu cơ tim và chống viêm [24], [29]. Thiếu hụt acid linoleic còn làm cho vết thƣơng chậm lành [34]. Trong các nghiên cứu gần đây cũng đã cho thấy hoa Gạo cũng có tác dụng bảo vệ tim mạch và chống viêm [28], [41]. Trong y học cổ truyền, hoa Gạo còn có tác dụng chữa bỏng [14]. Nhƣ vậy việc tìm ra acid linoleic trong hoa Gạo có ý nghĩa định hƣớng xác định mối quan hệ giữa thành phần hoá học với tác dụng sinh học của hoa Gạo.
Về đánh giá độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo, theo [31], kết quả cho thấy rằng mức độ và dấu hiệu độc phụ thuộc rất lớn vào liều dùng. LD50 của đƣờng uống trên chuột cống là 6768,730mg/kg. Đƣờng tiêm tĩnh mạch lần lƣợt là 889,496 và 467,84 mg lần lƣợt ở chuột cống và chuột nhắt. Vì sử dụng hoa Gạo trong y học cổ truyền ở nƣớc ta chủ yếu là đƣờng uống nên việc đánh giá độc tính cấp của hoa Gạo là cần thiết. Nhận thức đƣợc điều này, đề tài đã tiến hành thử độc tính cấp của cao lỏng hoa Gạo trên chuột nhắt trắng. Quá trình thực nghiệm cho kết quả LD50 trên chuột nhắt là 500,71 g dƣợc liệu/kg, liều này tƣơng đƣơng trên ngƣời là 41,73 g dƣợc liệu/kg. Nhƣ vậy nếu tính trọng lƣợng trung bình của ngƣời Việt Nam là 50 kg thì trên lý thuyết
mỗi ngày phải dùng đến 2086 g hoa Gạo khô mới gây tử vong trên ngƣời,