Mẫu phân lập: 1,28 g cắn BBH-C2.
Dung môi phản hấp phụ: n-hexan- ethylacetat (5:2).
Kiểm tra thành phần dịch hứng các ống bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexan - aceton (5:1), gộp những ống có sắc ký đồ gần giống nhau thành các phân đoạn mới. Sau khi để bay hơi tự nhiên nhận thấy có một phân đoạn gồm các ống từ 32 đến 46 xuất hiện một chất lỏng dạng dầu, ký hiệu chất đó là BBH-2. Cân đƣợc khối lƣợng 4,2 mg. Tiến hành kiểm tra độ tinh khiết bằng SKLM. Quá trình phân lập đƣợc tiến hành nhƣ hình 3.4.
Hình 3.4. Sơ đồ phân lập các chất từ hoa cây Gạo
Kiểm tra độ tinh khiết của BBH-2 bằng sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng: silicagel GF254 của Merck đã đƣợc hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ.
Dung dịch chấm sắc ký: Hòa tan BBH-2 bằng methanol. Các hệ dung môi khai triển:
Hệ I: toluen- aceton-ethyl acetat (4:1:1)
Hệ II: n-hexan- ether ethylic- acid acetic (5:5:0,1 ) Hệ III: n-hexan- aceton (5:1)
Thuốc thử: dung dịch H2SO4 10% trong ethanol.
Điều kiện phát hiện vết: ánh sáng thƣờng, UV254nm và UV365nm
Trƣớc khi phun thuốc thử, quan sát bản mỏng dƣới ánh sáng thƣờng, UV254 và UV365 thấy không xuất hiện vết. Sau khi phun thuốc thử, quan sát dƣới ánh sáng thƣờng đều chỉ thấy xuất hiện một vết. Vì vậy sơ bộ kết luận BBH-2 là một hợp chất tinh khiết. Kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.5 và
Cắn EtOAc BBH-C (4,17g) CC, silicagel Aceton : nƣớc (6:1) BBH-C2 (1,28g) BBH-2 (4,2 mg) CC, silicagel n-hexan : ethylacetat (5:2)
bảng 3.3.
Hệ I Hệ II Hệ III
Hình 3.5: Sắc ký đồ hợp chất BBH-2 ở AST, phun TT.
Bảng 3.3. Kết quả SKLM của BBH-2 với 3 hệ dung môi.
Hệ dung môi I II III
Rf ×100 42 26 14
Màu sắc Tím Tím Tím
Ngoài ra, tiến hành sắc ký so sánh cắn toàn phần và cắn BBH-2 trên cùng một bản mỏng, hệ dung môi khai triển là hệ I, kết quả đƣợc thể hiện trên hình 3.6.
Hình 3.6: Sắc ký đồ so sánh cắn toàn phần với cắn BBH-2 ở AST, phun TT
Nhận dạng BBH-2:
Hợp chất BBH-2 là chất lỏng dạng dầu, không màu (hình 3.7).
Hình 3.7: Ảnh hợp chất BBH-2 đã được phân lập
Phổ 1H-NMR cho thấy đây là một hợp chất có mạch thẳng chứa 2 nối đôi với 4 proton nằm ở 5,40 ppm.
Phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu của 18 nguyên tử carbon. Trong đó dựa vào kết quả của phổ DEPT cho thấy hợp chất này có 1 carbon methyl (-CH3), 12 carbon methylen (-CH2), 4 carbon methin (-CH).
Nhóm carboxylic (-COOH) đƣợc xác nhận bởi tín hiệu của 1 carbon tại 179,8 ppm. Nhƣ vậy đây là một acid béo không no mạch thẳng. Các dữ kiện phổ này cho phép dự đoán BBH-2 là octadeca-9,12-dienoic acid.
COOH (1) m/ z: 235.0 (2) m/z: 265.1 m/ z: 170.2 (3) (4) m/ z: 210.5
Hình 3.8: Sơ đồ cắt mảnh trên phổ ESI-MS của phân tử BBH – 2
Để xác định chính xác dộ dài mạch carbon và vị trí của nối đôi trong phân tử hợp chất BBH-2, phổ khối lƣợng đã đƣợc đo. Trên phổ ESI-MS xuất hiện pic ion tại m/z 281,5 [M+H]+ tƣơng ứng với công thức phân tử C18H32O2 (M = 280).
Trên phổ khối lƣợng bắn mảnh xuất hiện mảnh phân tử tại m/z 265,1 tƣơng ứng công thức C17H29O2, phân tử BBH-2 bị cắt mảnh ở vị trí (1); mảnh phân tử tại m/z 235,0 tƣơng ứng với công thức C17H31, phân tử BBH-2 bị cắt tại vị trí (2) chứng tỏ một đầu mạch của BBH-2 là gốc -COOH và một đầu mạch là gốc -CH3. Mảnh phân tử tại m/z 107,2 tƣơng ứng với công thức C10H18O2 và mảnh m/z 112,0 tƣơng ứng với công thức C8H16, chứng tỏ phân tử BBH-2 bị cắt mảnh ở vị trí (3) trên hình; mảnh phân tử m/z 210,5 tƣơng ứng với công thức C13H22O2 phân tử BBH-2 bị cắt mảnh ở vị trí (4). Từ vị trí
cắt (3) và (4) của phân tử suy ra nối đôi đƣợc xác định ở vị trí C-9/C-10 và C- 12/C-13 của phân tử BBH-2. Các vị trí cắt mảnh trên phổ ESI-MS của phân tử BBH-2 đƣợc mô tả ở hình 3.8.
Từ tất cả các phân tích nêu trên, cùng với số liệu phổ khối lƣợng ESI-MS cho phép khẳng định hợp chất BBH-2 là một acid mạch dài có CTPT C18H32O2 có cấu trúc nhƣ hình 3.9 và có tên gọi là Octadeca-9,12-dienoic acid.
O OH
Hình 3.9. Công thức cấu tạo của BBH – 2