Nghiên cứu thành phân hóa học và thử độc tính cấp, tác dụng tăng lực của cây sâm cau (curculigo orchioides gaertn , hypoxidaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP, TÁC DỤNG TĂNG LỰC CỦA CÂY SÂM CAU Curculigo orchioides G

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP, TÁC DỤNG TĂNG LỰC

CỦA CÂY SÂM CAU

(Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN BÍCH NGỌC

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP, TÁC DỤNG TĂNG LỰC

CỦA CÂY SÂM CAU

(Curculigo orchioides Gaertn., Hypoxidaceae)

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Phương Thiện Thương (Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu) và PGS.TS Nguyễn Mạnh Tuyển

(Bộ môn Dược cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội), là những người thầy

đã hướng dẫn, chỉ bảo em, luôn góp ý và giúp đỡ em, đưa ra những ý kiến quý báu để hoàn thiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Khiêm (Trung tâm Nghiên

cứu trồng và chế biến cây thuốc) đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi

để em hoàn thành luận văn đúng thời hạn

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ, nhân viên khoa Hóa Phân tích –

Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đặc biệt là ThS Vũ Văn Tuấn - người đã luôn theo

sát, hướng dẫn cho em trong quá trình thực hiện đề tài này

Em xin chân thành cảm ơn các chị khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu đã luôn tận tình, tạo điều kiện thuận lợi và hết lòng giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn này

Sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, anh trai và bạn bè

đã luôn ở bên cạnh ủng hộ, động viên em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu này!

Hà Nội, ngày 30 tháng 8 năm 2015

Học viên

DS Nguyễn Bích Ngọc

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 TỔNGQUANVỀCHICURCULIGOGAERTN 2

1.1.1 Vị trí phân loại 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Curculigo Gaertn 2

1.1.3 Phân bố của chi Curculigo Gaertn 2

1.1.4 Đặc điểm một số loài thuộc chi Curculigo Gaertn ở Việt Nam 3

1.2 TỔNGQUANVỀCÂYSÂMCAU 5

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 5

1.2.2 Thành phần hóa học 6

1.2.3 Độc tính và tác dụng sinh học của Curculigo orchioides Gaertn 14

1.2.4 Công dụng của sâm cau 19

1.2.5 Các vấn đề cần nghiên cứu 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VẦ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1.NGUYÊNLIỆUNGHIÊNCỨU 21

2.2.PHƯƠNGTIỆNNGHIÊNCỨU 21

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất 21

2.2.2 Trang thiết bị và máy móc 21

2.2.3 Động vật thí nghiệm 22

2.3.PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU 22

2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 22

2.3.2 Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng tăng lực 23

2.4.ĐỊAĐIỂMNGHIÊNCỨU 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26

3.1.THÀNHPHẦNHÓAHỌC 26

3.1.1 Định tính bằng các phản ứng ống nghiệm 26

3.1.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng 28

3.2.CHIẾTXUẤT,PHÂNLẬPMỘTSỐHỢPCHẤTTỪTHÂNRỄSÂMCAU 29

3.2.1 Chiết xuất 29

3.2.2 Phân lập 29

3.2.3 Kiểm tra độ tinh khiết của các chất phân lập được 32

3.3. ĐỘCTÍNHCẤP 38

3.4.TÁC DỤNGTĂNGLỰCCỦACAO ETHANOLSÂM CAUTRÊNMÔHÌNHTRỤ QUAYROTA-ROD 39

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 42

4.1.VỀTHÀNHPHẦNHÓAHỌC 42

4.1.1 Kết quả định tính 42

4.1.2 Kết quả phân lập các chất từ thân rễ sâm cau 43

4.2.VỀĐỘCTÍNHVÀTÁCDỤNGTĂNGLỰC 46

4.2.1 Độc tính cấp 46

4.2.2 Tác dụng tăng lực 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AchE : Acetylcholin esterase

ALP : Alkalin phosphatase

ALT : Alanin aminotransferase

AMPA : α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionic acid AST : Aspartat aminotransferase

BDNF : Yếu tố dinh dưỡng thần kinh xuất phát từ não

HPA : Hạ đồi - Tuyến yên - Tuyến thượng thận

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IC50 : Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibitor concentration)

HMG-CoA : Hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A

1H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của proton

13C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của 13C

m-RNA : ARN thông tin

r-RNA : ARN ribosom

ROS : Gốc tự do (Reactive Oxygen Spieces)

UV : Phổ tử ngoại (Ultra Violet Spectroscopy) VEGF : Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu

YHCT : Y học cổ truyền

βAP : β-amyloid peptid

δ : Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị tính là ppm)

4 Bảng 3.4 Kết quả thử độc tính cấp của cao đặc sâm cau 38

5 Bảng 3.5 Thời gian bám trung bình trên trụ quay của chuột tại thời

điểm trước và sau khi uống cao đặc sâm cau 60 phút 39

6 Bảng 3.6 Thời gian bám trung bình trên trụ quay của chuột tại thời

điểm trước và sau khi uống cao đặc sâm cau 7 ngày 39

7 Bảng 3.7 Thời gian bám trung bình trên trụ quay của chuột tại thời

điểm trước và sau khi uống cao đặc sâm cau 14 ngày 40

8 Bảng 3.8 Trọng lượng trung bình chuột tại thời điểm ngày 0, ngày 7,

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 Hình 1.1 Curculigo orchioides Gaertn 6

2 Hình 2.1 Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) 21

3 Hình 3.1 Sắc ký đồ định tính nhóm phenolic trong thân rễ sâm cau 28

4 Hình 3.2 Sắc ký đồ định tính nhóm saponin trong thân rễ sâm cau 29

5 Hình 3.3 Sơ đồ chiết xuất, phân đoạn các chất từ thân rễ sâm cau 31

6 Hình 3.4 Quy trình phân lập các chất từ cắn ethyl acetat thân rễ

7 Hình 3.5 Kiểm tra các chất phân lập được bằng hệ dung môi số 1 33

8 Hình 3.6 Kiểm tra các chất phân lập được bằng hệ dung môi số 2 33

9 Hình 3.7 Công thức cấu tạo các hợp chất SC1, SC2, SC3 và tương

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây sâm cau còn gọi là cây ngải cau, cồ nốc lan, có tên khoa học là Curculigo

orchioides Gaertn thuộc họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae) là cây thân cỏ, mọc hoang ở

các tỉnh vùng núi phía Bắc nước ta Ở Trung Quốc, thân rễ sâm cau được tán thành bột, sắc nước làm thuốc bổ, trị suy nhược cơ thể, đau lưng, viêm khớp và viêm thận mạn tính Ở Ấn Độ, Nepal và Philippines thân rễ sâm cau dùng làm thuốc lợi tiểu, tăng cường chức năng tình dục, chữa bệnh ngoài da, loét dạ dày tá tràng, trĩ, lậu…; sâm cau còn là thành phần chính trong bài thuốc cổ truyền điều trị sỏi tiết niệu của Ấn Độ [16]

Ở Papua New Guinea, thân rễ và lá sâm cau được hơ nóng cho mềm rồi chà xát trên cơ thể để tránh thụ thai [42]

Theo Y học cổ truyền Việt Nam, sâm cau có vị cay, tính ấm, có tác dụng trợ dương, trừ hàn, cường dương, mạnh gân xương [16] Đồng bào các dân tộc thường sử dụng thân rễ cây sâm cau (thường gọi là tiên mao) như một loại thuốc bổ - có thể dùng riêng hoặc kết hợp cùng với các vị thuốc khác - để điều trị các bệnh như: liệt dương, đau lưng, viêm khớp, viêm thận, vàng da, vô sinh [15] Mặc dù đã được người dân

sử dụng từ rất lâu trong dân gian, nhưng ở Việt Nam vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của dược liệu này Năm 2001, tác giả Nguyễn Thị Phương Lan công bố kết quả định tính sơ bộ về thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và tác dụng tăng lực của dược liệu sâm cau thu hái tại Tuyên Quang [12]

Để có thêm cơ sở khoa học cho việc sử dụng sâm cau làm thuốc, đồng thời phát huy hơn nữa giá trị, vai trò của cây sâm cau trong y dược học, chúng tôi tiến hành đề

tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và thử độc tính cấp, tác dụng tăng lực của

cây sâm cau – Curculigo orchioides Gaertn., họ Hypoxidaceae” với các mục tiêu:

- Nghiên cứu thành phần hóa học của thân rễ sâm cau (Curculigo orchioides

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ CHI CURCULIGO GAERTN

1.1.1 Vị trí phân loại

Theo tài liệu Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín ở Việt Nam

của tác giả Nguyễn Tiến Bân thì chi Curculigo thuộc ngành Ngọc lan

(Magnoliophyta), lớp Hành (Liliopsida), phân lớp Hành (Liliidae), nằm trong bộ Hành Liliales thuộc họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae) [1]

Theo tài liệu Tóm tắt đặc điểm các họ cây thuốc của tác giả Vũ Văn Chuyên,

chi Curculigo trước đây được xếp vào họ Thủy tiên (còn gọi là họ Lan - Huệ) (Amaryllidaceae) nhưng hiện giờ được tách ra thành họ Hypoxidaceae [9] Phạm

Hoàng Hộ, Đỗ Tất Lợi xếp chi này trong họ Amaryllidaceae [11], [13], việc phân loại như vậy cũng giống như phân loại trong Flora of China [25]

Việc phân loại chi Curculigo G dựa trên hệ thống phân loại của A L

Takhtajan năm 1987 về nhóm thực vật có hoa và các nhóm thực vật bậc cao có mạch

khác, chỉnh lý một phần theo hệ thống năm 1996 của A L Takhtajan: chi Curculigo Gaertn được xếp vào họ Tỏi voi lùn (Hypoxidaceae) trong bộ Haemodorales, phân lớp Hành (Liliidae), lớp Hành (Liliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [2], [8]

1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Curculigo Gaertn

Cây thảo, sống lâu năm thường có thân rễ củ Lá hình ngọn giáo hoặc hình dải, thường xếp nếp, thường mọc từ rễ Cụm hoa chùm, hình trứng hoặc hình đầu, ở ngọn một cán hoa mọc từ rễ, dài nhiều hay ít Hoa có cuống hoặc không, màu vàng, bao hoa đính trực tiếp trên bầu hoặc trên một mỏ dài nằm trên bầu Lá đài 3, tràng 3, rời, hầu như giống nhau về hình dạng và kích thước, trải ra thành hình sao Nhị 6 xếp hai dãy, không có chỉ nhị hoặc trên một chỉ nhị dài; bao phấn dài có 2 ô sát nhau, song song, hướng trong Bầu hạ, 3 ô có nhiều noãn Quả không mở, có vỏ quả mỏng có mỏ hoặc không [8], [25]

1.1.3 Phân bố của chi Curculigo Gaertn

Chi Curculigo Gaertn có khoảng 20 loài phân bố tại các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trong đó có 7 loài đã được tìm thấy tại Trung Quốc là Curculigo capitulata (Lour.) O Ktze., Curculigo breviscapa S C Chen., Curculigo gracilis (Kurz), C

orchioides Gaertn., C sinensis S C Chen., C glabrescens (Ridley) Merrill và C crassifolia (Baker) J D Hooker [25], [42] Theo M Asif chi Curculigo Gaertn có

khoảng 10 loài trong đó có 3 loài được tìm thấy ở Ấn Độ là Curculigo capitulata (Lour) O Ktze., Curculigo orchioides Gaertn và Curculigo latifolia Dryand Ex Ait

[19]

Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Curculigo ở Việt Nam hiện có khoảng 7 loài [11] Theo Võ Văn Chi, chi Curculigo Gaertn gồm 14 – 15 loài phân bố chủ yếu ở vùng

nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á, ở Việt Nam có 7 - 8 loài, nhưng thường thấy 5 loài

sau là: C capitulata (Lour.) Kuntze, C disticha Gagnep., C latifolia Dryand., C

gracilis (Kurz) Hook.f., C orchioides Gaertn [8]

Tác giả Đỗ Tất Lợi chỉ đề cập đến 1 loài là Curculigo orchioides Gaertn [13] Trong chi Curculigo thì loài Curculigo orchioides Gaertn được phân bố rộng rãi, phổ

biến hơn cả Nó được tìm thấy ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Malaysia, Philippines, Indonesia, Pakistan, Papua New Guinea… Ở nước

ta, Curculigo orchioides Gaertn hay còn gọi là sâm cau (ngải cau…) phân bố ở Sơn

La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Hòa Bình, Ninh Bình, Hà Nam, Đà Nẵng, Quảng Nam, Kon Tum, Lâm Đồng, Bà Rịa - Vũng Tàu [8], [13] Mặc dù phân bố ở nhiều địa phương nhưng trữ lượng sâm cau trong tự nhiên đang giảm do bị khai thác thường xuyên (các tỉnh phía Bắc) Ngoài ra môi trường sống của cây bị tàn phá do mở rộng canh tác Tại các tỉnh Sơn La, Hòa Bình, Cao Bằng, ngải cau đã trở nên hiếm thấy rõ rệt, có nơi đã bị mất hẳn, cây đang bị đe dọa ở mức nguy cấp (mức EN) và đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam

1.1.4 Đặc điểm một số loài thuộc chi Curculigo Gaertn ở Việt Nam

 Curculigo capitulata (Lour) O Ktze

Tên Việt Nam: sâm cau lá lớn, cồ nốc lan

Cây thảo, sống nhiều năm, có thân rễ to và nhiều rễ Lá 5 - 6 mọc từ gốc, có lông, bẹ và cuống dài 30 – 60 cm Phiến lá thon, thuôn dài 30 - 80 cm, rộng 7 - 15 cm, xếp theo gân dọc, không lóng Cụm hoa có trục nhiều lông, mang nhiều hoa màu vàng, sít nhau và nhiều lá bắc, hoa có lông dày, phiến hoa hình trứng, mặt trong không có

lông Nhị 6, chỉ nhị dài, bầu có vòi nhụy dài Quả mọng, xoan, đường kính 4 - 5 mm [7], [8], [11], [25]

Phân bố: Trong rừng, ở những nơi ẩm ướt, độ cao từ 300 – 2200 m; Nam Trung Quốc,

Bangladesh, Bhutan, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, Papua New Guinea, Philippines, Sikkim, Sri Lanka, Thái Lan, Việt Nam Ở Việt Nam: phân bố ở Lạng Sơn, Hà Nội, Hòa Bình, Đồng Nai [1], [9]; cây thường mọc dưới tán rừng xanh, ẩm

 Curculigo latifolia Dryand Ex Ait

Tên thường gọi: cồ nốc lá rộng, sâm cau lá rộng

Cây thảo, cao tới gần 1 m, nhẵn Lá mọc từ rễ, phiến lá dài 30 - 40 cm, rộng 6 -

8 cm, nhọn hai đầu, cuống lá dài 20 - 30 cm, có khía, có bẹ ở gốc Cụm hoa mọc từ gốc, làm thành một đầu dày đặc đính trên một cán hoa ngắn (3 – 4 cm), có lông; đầu hình trứng bao bởi nhiều lá bắc hình nhọn, có nhiều hoa Bao hoa màu vàng, nằm trên một cái mỏ dài ở phía trên bầu, lá đài 3 hình thuôn, có vài cái lông xám rải rác ở lưng Cánh hoa 3 hơi ngắn và hẹp hơn lá đài, nhẵn Nhị 6, xếp hai dãy bằng nhau, chỉ nhị bằng bao phấn Bầu có lông không rậm lắm thót lại thành mỏ dài mang bao hoa ở ngọn, đầu nhụy hình đầu chia 3 thùy lõm Ra hoa vào tháng 6 - 7 [8]

Phân bố: Ấn Độ, Myanma, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Malaysia Ở nước ta có

gặp ở Kontum, Lâm Đồng, Ninh Thuận và Bình Dương [8]

 Curculigo disticha Gagn

Tên Việt Nam: cồ nốc song đính, cồ nốc hai hàng, rau báo rừng

Cây cỏ cao 60 – 80 cm, gốc có sợi Lá mọc từ rễ có cuống, có bẹ, phiến lá hình ngọn giáo, thon hẹp ở hai đầu, dài 30 - 40 cm, rộng 4,5 - 6 cm, không lông, gân nhiều, cuống lá dài 15 - 20 cm Cụm hoa mọc từ rễ, trên cán dài 3 cm, có lông rải rác thành bó; đầu hoa dẹp, ít dày đặc, dài 4 cm, gần dạng ngù Lá bắc xếp hai dãy, hình dải - ngọn giáo, dài 4 - 2 cm, rộng 6 - 3 mm, không lông, có 9 gân song song Hoa 10 - 12, dài bằng lá bắc, với bao hoa có chân dài Lá đài xoan – tù, dài 3,5 mm rộng 2,5 mm có lông ở lưng Cánh hoa giống và gần bằng lá đài, có ít lông ở lưng Nhị 6 xếp hai hàng, chỉ nhị hầu như không có Bầu dài 6 mm phía trên có mỏ dài, có lông nhung rậm, vòi dạng sợi, đầu nhụy dạng chấm, xẻ 2 - 3 thùy rất ngắn Quả hình thoi dài 2 cm [8], [11]

Phân bố: Việt Nam, Lào Ở nước ta có gặp từ Quảng Trị vào Gia Lai và Đồng Nai, có

trồng ở thảo cầm viên ở Thành phố Hồ Chí Minh

 Curculigo tokinensis Gagn

Tên Việt Nam: cồ nốc Bắc Bộ

Cây cỏ cao 20 cm, thân rất ngắn Lá cao 20 - 30 cm, rộng 0,5 - 1,2 cm, xếp dọc; cuống không phân biệt với phiến Hoa giữa đáy lá, không cọng, có lá hoa không lông, dài 2 - 4 cm Hoa ít, vàng, noãn có lông, nhị 6, nuốm hình cầu [11]

Phân bố: Ở Việt Nam cây được phân bố ở Đà Lạt

 Curculigo gracilis (Kurz) Hook.f

Tên Việt Nam: tam lăng, cồ nốc mảnh, lòng thuyền, tiên mao hoa thưa

Cây thảo sống lâu năm, có thân giả do các bẹ lá áp sát nhau Lá dài, phiến dài

45 - 60 cm, rộng 5 - 7 cm, nhọn hai đầu, gân nhiều Cụm hoa ở đầu một cán hoa có lông đen, dài 20 cm, đầu cong lại thành dạng nón, bao bởi nhiều lá bắc hình dải nhọn

và có nhiều lông rậm ở mặt lưng Chùm hoa cao 8 - 10 cm, với 10 - 20 hoa, có cuống 1

- 2,5 cm, có lông Bao hoa đính trên bầu Lá đài 3, thuôn, nhọn, có lông nhiều ở mặt lưng Cánh hoa cũng giống lá đài nhưng hơi tiêu giảm hơn Nhị 6 xếp hai dãy bằng nhau, bao phấn thuôn, không có chỉ nhị Bầu không có mỏ, nằm ngay dưới bao hoa, có lông rất rậm, vòi mảnh Quả hình bầu dục dài 2 cm, có cọng Hạt nhiều, màu đen, có sọc [8], [11], [25]

Phân bố: Cây mọc trong rừng rậm ở những nơi ẩm ướt có độ cao 1000 m Loài

Curculigo gracilis phân bố ở một số nơi như Trung Quốc, Campuchia, Nepal, Thái

Lan, Việt Nam [8], [25] Ở Việt Nam: gặp ở Lào Cai, Hà Tây, Ninh Bình vào đến Quảng Trị [8], [11]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÂY SÂM CAU

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Tên Việt Nam: sâm cau, ngải cau, cồ nốc lan [8]

Cây thảo, lâu năm, cao khoảng 20 - 40 cm Thân rễ mập, hình trụ dài, mọc thẳng, thót lại hai đầu, mang nhiều rễ phụ [8] Lá 3 - 6 hình , mọc tụ họp thành túm, xếp nếp tựa như lá cau, dài 20 - 30 cm, rộng 2,5 – 3 cm, gốc thuôn, đầu nhọn, hai mặt nhẵn gần như cùng màu, gân song song rất rõ, bẹ lá to và dài, cuống lá dài khoảng 6 -

10 cm Cụm hoa nằm trên một trục ngắn và mảnh giữa các bẹ lá, gồm 3 – 5 hoa màu vàng Lá bắc hình trái xoan nhọn, lá đài 3, có lọng dài ở lưng; tràng 3 cánh nhẵn; nhị 6 xếp thành hai dãy, chỉ nhị ngắn; bầu hình thoi có lông rậm kéo dài thành mỏ; đầu nhụy hình trái xoan, chia 3 nhánh mập [7], [8], [13], [16] Quả nang, thuôn, dài 1,2 – 1,5 cm chứa 1 – 4 hạt Cây sinh trưởng tốt trong mùa mưa ẩm, ra hoa quả hàng năm, mùa hoa

là tháng 5 - 7 [16] Bộ phận dùng: thân rễ

Phân bố: cây mọc ở những vùng núi cao 1600 m, phía Nam và Tây Nam Trung Quốc;

Campuchia, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Lào, Myanma, Pakistan, Papua New Guinea, Philippines, Thái Lan, Việt Nam [8], [25] Ở Việt Nam: cây mọc trên các đồi

cỏ, nơi ẩm mát, ở một số địa phương như Lai Châu, Tuyên Quang, Cao Bằng [8]

Hình 1.1: Curculigo orchioides Gaertn

1.2.2 Thành phần hóa học

Các kết quả nghiên cứu trên thế giới đã công bố và cho biết thành phần hóa học chính trong sâm cau và có tác dụng dược lý bao gồm: phenolic glycosid [62], [67]; các hợp chất aliphatic hydroxyl ceton; các saponin thuộc nhóm cycloartan và nhóm ursan [24]; flavon; alcaloid [24], [42] Bên cạnh đó cây còn chứa một số thành phần khác như: steroid; đường tự do như glucose, manose, xylose; chất nhầy; hemicellulose; polysaccharid và acid glucuronic [24], [64]

Ở Việt Nam, nghiên cứu về cây sâm cau (Curculigo orchioides) nói chung và

thành phần hóa học của loài này nói riêng là một vấn đề mới Cho đến nay, chỉ có một nghiên cứu về cây sâm cau của tác giả Nguyễn Thị Phương Lan (2001) đã được công

bố Nghiên cứu đã xác định được tên khoa học của cây sâm cau (Curculigo orchioides

Gaertn.) mọc hoang ở Sơn Dương, Hà Giang, xác định sơ bộ thành phần hóa học, tác dụng chống oxy hóa và tăng lực của thân rễ sâm cau Theo đó, kết quả định tính cho thấy thân rễ sâm cau Việt Nam có chứa phytosterol, đường khử, saponin, chất béo, caroten Ngoài ra nghiên cứu cũng phân lập được một hợp chất tinh khiết là acid 4-hydroxy-3-methoxybenzoic từ dịch chiết aceton – nước của cây sâm cau [12]

Năm 1983, Michinor Kubo (Nhật) cùng các cộng sự đã phân lập được từ thân rễ

sâm cau một phenolic glucosid mới đặt tên là curculigoside A (1) có cấu trúc hóa học:

5-hydroxy-2-O-β-D-glucopyranosylbenzyl-2,6-dimethoxybenzoat [24] Theo Fu Daxu

và công sự (2004), thân rễ sâm cau có chứa curculigoside C (3), curculigoside A (1), curculigoside B (2) và acid 2,6-dimethoxylbenzoic [26] Trong nghiên cứu của Josep

Vall và cộng sự (2006), đã phân lập từ cây sâm cau hai phenolic cũ là curculigoside A

(1), curculigoside B (2) và hai glucosid mới là benzylbenzoat – curculigoside C (3) và curculigoside D (4) [55]

STT R 1 R 3 R 5 Tài liệu Curculigoside (1) OH H OCH3 [24]

((5-D-glucopyranosid]benzoat) (5) và chất còn lại là đồng phân quang học của crassifoside

B (một hợp chất phenolic đƣợc tìm thấy trong thân rễ loài Curculigo crassifolia) [37],

đƣợc đặt tên là orchioside D (6) [24]

Các nhà khoa học Trung Quốc dựa trên HRMS, FAB-MS, NMR đã xác định đƣợc cấu trúc của curculigine B, curculigine C lần lƣợt là: 2,4-dichloro-3-methyl-5-

methoxyphenol-O-β-D-apiofuranosyl-(16)-β-D-glucopyanosid (7); 2,4,6 -trichloro

xylopyranosyl-(16)-β-D-glucopyranosid (9) [27], [29] Zuo A.X cũng nghiên cứu

thành phần hóa học dịch chiết ethanol của thân rễ sâm cau Curculigo orchioides và thu

đƣợc các phenolic glycosid là orcinoside A, B, C [68]

R 1 R 2 R 3 R 4

Orcinoside A OH CH3 OGlc CH3

Orcinoside B OH CH3 CH3 OGlc Orcinoside C CH3 OH CH3 OGlc

Từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của cao chiết ethanol 95o của cây sâm cau, Zhen-Hui Wang và các cộng sự (2013) đã phân lập đƣợc 5 dẫn chất chlorophenolic glucosid Chúng lần lƣợt đƣợc xác định là các curculigine E, F, G, I, H và một hợp chất phenolic glycoside là orcinoside H, trong đó hợp chất orcinoside là hợp chất mới tại thời điểm công bố [65]

STT Tên hợp chất Công thức

1 Curculigine E (C14H18Cl2O7) (10)

R1 = OCH3 ; R2 = CH3

O HO

HO

OH O

R 2

R1

1 2

HO

OH O

Các hợp chất aliphatic hydroxyceton phân lập đƣợc trong thân rễ C orchioides:

3 27-hydroxytriacontan-6-on (20) CH3(CH2)4CO(CH2)20CHOH(CH2)2CH3 [40]

4 23-hydroxytriacontan-2-on (21) CH3CO(CH2)20CHOH(CH2)6CH3 [40]

5 21-hydroxytetracontan-20-on

(22) CH3(CH2)18CHOHCO(CH2)18CH3 [38]

6 4-methylheptadecanoic acid (23) CH3(CH2)12CH(CH3)(CH2)2COOH [38]

1.2.2.3 Hợp chất saponin triterpennoid

Các triterpen tìm thấy trong thân rễ sâm cau đa số là thuộc nhóm cycloartan, có duy nhất một triterpen thuộc nhóm ursan có tên là: 31-methyl-3-oxo-20-ursen-28-oic

acid (24) [16] Misra Triguna N., Singh Ram S (1990) đã phân lập được curculigol

từ thân rễ của loài C orchioides Gaertn Cấu trúc của hợp chất này được xác định là:

(24-methylcycloart-7-en-3β,20-diol) (25) [16], [39]

Hỗn hợp các saponin thu được từ cao ethanol của thân rễ sâm cau, Xu Junping

và Xu Rensheng (1992) sử dụng sắc ký cột silica gel, cột RP-18 và HPLC đã tách được các aglycon, tiếp theo dùng phương pháp MS, 1D-NMR, 2D-NMR đã xác định được cấu trúc của aglycon mới này là curculigenin A, B, C [64] Sau đó 13 curculigosaponin được tìm ra và được ký hiệu từ A đến M, trong đó curculigosaponin

AJ đều mang khung chung của curculigenin A; curculigosaponin KM có phần genin là curculigenin B [63], [64]

Tiwari và Misra (1976) tìm thấy trong thân rễ loài C orchioides hai hợp chất

flavonoid [54] Các hợp chất này đều thuộc nhóm flavon

Curculigenin C (37) Curculigenin B

Có 1 alcaloid duy nhất đƣợc Rao và cộng sự (1978) phân lập đƣợc từ thân rễ

sâm cau là lycorin Tuy nhiên, hàm lƣợng alcaloid này ở chi Curculigo vẫn chƣa đƣợc

nghiên cứu kỹ Ngoài ra còn có các hợp chất chứa nitơ khác cũng đã đƣợc tìm thấy ở

NH O

O

O

[44]

Ngoài ra, một lƣợng lớn các acid béo đƣợc phân lập từ dịch chiết dầu của rễ

loài C orchioides bằng TLC - GLC, gồm: palmitic (48), oleic (49), linoleic (50), arachidic (51) và behenic acid (52) [50] Có 3 hợp chất steroid tìm đƣợc từ thân rễ C

1.2.3 Độc tính và tác dụng sinh học của Curculigo orchioides Gaertn

1.2.3.1 Độc tính

Theo Dược điển Trung Quốc (2010), Curculigo orchioides có độc tính và liều

lâm sàng khuyến cáo cho người trưởng thành là 3 – 9 g/ngày Liều LD50 của cao chiết

ethanol là 215,9 g/kg Trong thử nghiệm độc tính trường diễn của Curculigo

orchioides, sử dụng mức liều 120 g/kg trong 6 tháng trên chuột cống thấy xuất hiện

những tổn thương trên gan, thận và cơ quan sinh sản của chuột [22]

Nie Y và cộng sự (2013) cho rằng tác dụng gây độc cho gan có thể do thành phần triterpenoid ceton có trong cao ethanol [42] Thông thường khi uống sâm cau ở liều khuyến cáo không gây ra bất kỳ tác dụng phụ hay độc tính nào Tuy nhiên nếu uống nhiều trong khoảng thời gian dài có thể xuất hiện một số tác dụng như ra mồ hôi lạnh, tê cóng chân tay Vì vậy, chỉ sử dụng ở mức liều mà đã chắc chắn tính an toàn của chế phẩm Chống chỉ định với những người âm hư, những người bị nhiễm lạnh do các tác nhân ngoại cảnh [42]

Nghiên cứu về độc tính của C orchioides tại Việt Nam còn ít và đa số các

nghiên cứu đều thực hiện với dạng trà tan Tiên mao 3 g/gói, do khoa Dược bệnh viện YHCT Trung ương sản xuất “Nghiên cứu độc tính cấp diễn và bán trường diễn của trà thuốc Tiên mao” do Dương Minh Sơn và cộng sự thực hiện (2007) trên chuột nhắt

trắng chủng Swiss và trên thỏ Kết quả nghiên cứu độc tính cấp trên 5 nhóm chuột

trong 7 ngày với mức liều tăng dần từ 10 g/kg tới 30 g/kg là đa số các chuột chỉ giảm hoạt động, nằm và ngủ trong 2 - 3 giờ, sau đó tất cả đều hoạt động và ăn uống bình thường, không có chuột nào chết Do đó nghiên cứu vẫn chưa xác định được liều LD50bằng đường uống Kết quả thử độc tính bán trường diễn trên thỏ với mức liều uống 9 g/3 lần/ngày, theo dõi trong 6 tuần, chưa thấy có các dấu hiệu thay đổi về các thành

phần máu và chức năng gan, thận có ý nghĩa thống kê so với trước điều trị [15]

Kết quả “Khảo sát tính an toàn của trà Tiên mao trên bệnh nhân bị rối loạn cương dương” của Trần Quốc Bình và Dương Minh Sơn thực hiện (2011) trên 31 bệnh nhân bị mắc bệnh rối loạn cương dương tại Khoa ngoại Bệnh viện Y học cổ truyền Trung ương trong 3 tháng cho thấy uống trà tiên mao với liều 9 g chia 3 lần/ngày

không gây ra các tác dụng không mong muốn, không làm thay đổi các chỉ số cận lâm sàng, huyết học, sinh hóa [3]

1.2.3.2 Tác dụng sinh học

Tác dụng chống oxy hóa

Nghiên cứu in vitro của Bafna và Mishra (2005) đã thấy cao methanol của thân

rễ Curculigo orchioides có hiệu quả rất tốt trong việc dọn các gốc tự do nhóm

superoxid, có tác dụng trung bình đối với các gốc tự do DPPH, nitric oxid và có tác

dụng ức chế quá trình peroxid lipid [20] Theo Wu và cộng sự, các hợp chất phenolic

là yếu tố chính tạo nên tác dụng chống oxy hóa của C orchioides [60]

Bằng những thực nghiệm của mình Wang đã chỉ ra các curculigoside cản trở tác dụng phá hủy tế bào nội mô tĩnh mạch rốn người của H2O2 đồng thời cũng làm giảm quá trình apoptosis tế bào Apoptosis là một chu trình hoạt động của sự lão hóa, chết tế bào, sự tích lũy H2O2 trong tế bào chính là tác nhân châm ngòi cho quá trình apoptosis Các curculigoside ức chế hoạt động của caspase-3 (một protease tham gia vào quá trình phân hủy DNA) và protein p53 mRNA (đây là hai yếu tố được coi là chìa khóa

khởi động quá trình apoptosis tế bào) nên có tác dụng ức chế quá trình apoptosis [59]

Các curculigoside còn tác động lên protein ở tế bào da người: làm tăng biểu hiện của protein procollagen type I và làm giảm biểu hiện của protein MMP-1, điều này cho thấy các curculigoside có thể có tác dụng tốt trong điều trị sự lão hóa da người [34]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Phương Lan (2001) cũng đã

cho thấy tác dụng chống oxy hóa in vitro của polyphenol chiết từ thân rễ sâm cau khá

cao (64,1%) [12]

Tác dụng bảo vệ, chống độc cho gan

Qua các nghiên cứu của Rao và cộng sự (1996) đã cho thấy tác dụng chống

nhiễm trùng và bảo vệ gan của C orchioides Nhóm tác giả đã chỉ ra tác dụng bảo vệ,

chống độc cho gan là do sâm cau có tác dụng đối kháng với một số chất có khả năng

gây độc cho gan như rifampicin [47], [48] Các curculigenin A và curculigol đã được

nghiên cứu và sàng lọc thấy có tác dụng chống độc cho gan do chúng đối kháng với

Nghiên cứu của Venukurma và Latha (2002) thực hiện trên chuột cống đã được tiêm CCl4, sau đó cho dùng cao đặc chiết từ thân rễ C orchioides cho thấy: cao

methanol có tác dụng làm tăng lượng tiêu thụ thức ăn và làm chuột tăng cân đồng thời làm giảm tới mức bình thường nồng độ của AST, ALT, ALP, GGT, lipid, triglycerid,

cholesterol trong huyết thanh [57] Ngoài việc chỉ ra tác dụng đối kháng của cao

methanol với một số chất gây độc ở gan như paracetamol, rifampicin, CCl4, Venukurma còn chỉ ra cơ chế bảo vệ gan của cao methanol cũng tương tự như Silymarin là thông qua các tác dụng: chống oxy hóa nên có thể vô hiệu hóa các gốc tự

do gây hại; ổn định màng tế bào gan và ngăn chặn chất độc từ ngoài nhiễm vào trong

tế bào gan; tăng cường tổng hợp rRNA, giúp sự tổng hợp protein nhằm thúc đẩy phục hồi các tế bào gan bị tổn thương và kích thích sự phát triển các tế bào gan mới; ức chế

sự biến đổi gan thành tổ chức xơ, giảm sự hình thành các sợi collagen đưa đến xơ gan Ngoài ra, cao chiết methanol còn chứa một số enzym chống oxy hóa như glutathion

transferase [49], [56]

Rajesh và cộng sự (2000) cũng nghiên cứu về Kamilari - một sản phẩm của

Ayurvedic có chứa thành phần là C orchioides, có hiệu quả tốt trong hỗ trợ điều trị xơ

gan do rượu [45]

Tác dụng điều hòa miễn dịch

Nghiên cứu của Bafna và cộng sự chỉ ra rằng cao methanol của thân rễ C

orchioides có tác dụng làm tăng số lượng bạch cầu, tăng lượng kháng thể dịch thể ở

những chuột được điều trị ức chế miễn dịch bằng cyclophosphamid Điều này cho thấy cao methanol của thân rễ sâm cau có tác dụng kích thích miễn dịch bằng cả hai cơ chế

miễn dịch là thông qua trung gian tế bào và thông qua kháng thể dịch thể [21] Các

glucosid phenolic từ sâm cau đóng vai trò khá quan trọng trong việc điều hòa miễn dịch cơ thể do chúng có tác dụng làm tăng hàm lượng kháng thể dịch thể [33]

Lacaille - Dubois và Wagner cũng nghiên cứu tác dụng sinh học của các curculigosaponin - cycloartan loại saponin triterpen từ thân rễ sâm cau, kết quả cho thấy các curculigosaponin kích thích sự tăng sinh của tế bào lympho ở lách chuột nhắt trắng, tác dụng của curculigosaponin trên kháng thể vẫn chưa rõ rệt [42] Các curculigosaponin C và F thúc đẩy sự tăng sinh tế bào lympho ở lách chuột nhắt trắng,

còn curculigosaponin G làm tăng trọng lượng tuyến ức in vivo ở chuột nhắt trắng [16],

[49] Ngoài ra, lycorin – alcaloid có trong sâm cau cũng đã được chứng minh là có tác

dụng kích thích tế bào lympho T in vitro và in vivo

Hoạt tính tăng cường chức năng sinh lý

Cao ethanol của thân rễ Curculigo orchioides có tác dụng kích thích sinh dục

đáng kể ở thỏ đực, làm tăng lượng glycogen, tăng độ ẩm ở tử cung của chuột cái trưởng thành, tăng nồng độ hormon FSH, LH và hormon testosteron trên chuột cống

[58]; tác dụng làm tăng số lần, tăng tần suất giao phối trên động vật Điều này đã gợi ý

cho các nhà nghiên cứu có thể dùng thân rễ sâm cau như một vị thuốc để điều trị chứng rối loạn cương dương [23], [42] Đã thử nghiệm trên nam giới có các chứng giảm tinh trùng, tinh trùng chết, tinh trùng kém chuyển động và tinh trùng yếu bài thuốc gồm sâm cau và hai vị dược liệu khác uống với sữa và đường trong 3 tháng Kết quả có sự thay đổi đáng kể về khả năng sống của tinh trùng sau một tháng điều trị Ở tháng thứ hai có sự tăng về số lượng và khả năng chuyển động của tinh trùng, đồng thời số lượng tinh trùng non giảm Sau 3 tháng điều trị, tinh trùng bình thường phát triển ở 80% bệnh nhân nam giới [16]

Tác dụng chống loãng xương

Cao ethanol của thân rễ C orchioides có tác dụng chống loãng xương thông

qua việc kích thích sự tăng sinh nguyên bào xương tạo cốt bào, thúc đẩy hoạt động của ALP, đồng thời làm giảm vùng tế bào hủy xương tại hố tiêu xương

Curculigoside trong dịch chiết ethanol có tác dụng kích thích, thúc đẩy hoạt động của các phosphatase kiềm và làm tăng canxi lắng đọng trong xương; làm giảm nồng độ của các ROS và lipid peroxid; thúc đẩy hoạt động của các enzym chống oxy hóa trong tế bào tạo xương Ngoài ra, các phenolic glycoside này còn kích thích sự phát triển và làm tăng biểu hiện của các yếu tố như: VEGF, tyrosine kinase-1 và một

số các đích sinh học khác trong điều trị các bệnh xương chuyển hóa thường gặp như tế bào MC3T3-E1

Tác dụng kháng khuẩn

Dịch chiết dầu từ thân rễ C orchioides có tác dụng kháng lại một số chủng vi khuẩn như Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Salmonella pullorum, Salmonella

newport, Staphylococcus aureus và một số chủng nấm như Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Aspergillus flavus, Cladosporium spp [24]

Dịch chiết nước của C orchioides có tác dụng chống lại tác dụng gây bệnh của một số chủng tụ cầu Gram (+) như: Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis; các chủng Gram (-) như: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium và có tác dụng chống nhiễm trùng như một thuốc kháng

khuẩn [41]

Tác dụng kháng histamin

Cao ethanol của thân rễ sâm cau có tác dụng chống co thắt hồi tràng cô lập ở chuột lang do histamin gây ra Một số nghiên cứu khác chỉ ra rằng, cao ethanol có tác dụng bảo vệ chống lại cơn co thắt khí quản trên chuột lang, các phản xạ thụ động ở chân chuột cống và chứng giữ nguyên tư thế gây ra bởi haloperidol trên chuột nhắt Các tiêu chí này phần nào cho thấy hiệu quả của cao ethanol của thân rễ sâm cau trong việc điều trị hen [16], [43]

Tác dụng kháng tiểu đường

Dịch chiết nước và cao ethanol sâm cau đều có tác dụng chống tăng đường huyết trong điều kiện bình thường và trong điều kiện tăng đường huyết do alloxan trên chuột cống Tác dụng hạ đường huyết phụ thuộc liều của cao ethanol đã được so sánh với glimepirid - thuốc điều trị tiểu đường đường uống, liều 500 µg/kg [35]

Tác dụng trợ đẻ

Sharma và cộng sự (1975) đã quan sát, nghiên cứu tác dụng trợ đẻ của các hợp chất flavon glycosid từ sâm cau [51] Các thử nghiệm trên chuột cống, chuột lang và thỏ đã cho thấy hợp chất flavon glycosid có tác dụng kích thích, co bóp tử cung mạnh,

vì vậy có tác dụng hỗ trợ trong quá trình sinh đẻ của phụ nữ [49]

Hoạt tính chống ung thư:

Dịch chiết sâm cau đã được Singh & Gupta (2008) phát hiện có tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư MCF-7

Tác dụng chống viêm:

Dode và cộng sự đã chỉ ra tác dụng chống viêm của thành phần gel trong thân

rễ sâm cau bằng mô hình nghiên cứu chống viêm thực nghiệm là mô hình gây phù bàn

chân chuột bằng carragenin [42] Rễ sâm cau thử nghiệm trên chuột nhắt dưới dạng cao ethanol thấy có hoạt tính làm tăng khả năng thích nghi, chống viêm, chống co giật,

an thần, có hoạt tính hormon sinh dục nam và kích thích miễn dịch [16], [42]

Một số nghiên cứu khác cho thấy, sâm cau có tác dụng làm giảm ngưỡng nghe, cải thiện chức năng trung tâm thính giác, tổ chức ốc tai của chuột, vì vậy mà sâm cau

có thể được sử dụng như một sản phẩm tự nhiên điều trị chứng giảm thính lực do tiếng

ồn ở chuột [30]

1.2.4 Công dụng của sâm cau

Tính vị, công năng: sâm cau vị cay tính ấm, độc vào hai kinh tỳ và thận, cường

dương, mạnh gân xương [7]

Công dụng:

Sâm cau đã được sử dụng từ rất lâu trong nền Y học cổ truyền Trung Quốc để điều trị liệt dương, tê nhức chân tay, viêm cột sống và đầu gối, trị tiêu chảy [8], [42] Thân rễ có thể nấu với thịt trị chứng bất lực và ù tai; có thể ngâm trong rượu vang trị đái dầm, hoặc nghiền thành bột mịn dùng với rượu vang trị chảy máu tử cung Y học dân gian Trung Quốc còn sử dụng sâm cau để điều trị áp xe nhọt, đau do chấn thương

và nhiễm trùng

Trong nền y học cổ truyền Ấn Độ, sâm cau là một vị thuốc khá quan trọng, nó

có mặt trong đa số các công thức Ayurvedic, được sử dụng thay thế cho “safed musli”

và được biết đến như là một vị thuốc bổ, có tác dụng giảm đau, lợi tiểu và tác dụng cường dương [24], [42] Sâm cau kết hợp với các loại thảo mộc khác để điều trị ho mạn tính, viêm phế quản, hen suyễn và viêm gan Sâm cau còn có tác dụng kích thích tiêu hóa, kích thích sự thèm ăn; các chế phẩm của thảo dược này rất hữu ích trong việc điều trị trĩ và hội chứng ruột kích thích Thân rễ sâm cau ép lấy nước có tác dụng chống nhiễm trùng, làm lành vết thương, hoặc có thể trộn lẫn với nước ép tỏi dùng nhỏ mắt để trị mù lòa Lá của sâm cau được biết là có đặc tính chống ung thư [24], [42] Các thầy lang Ấn Độ đã sử dụng sâm cau để điều trị rối loạn niệu như tiểu khó, tiểu ra máu, lậu và giang mai Lấy thân rễ sâm cau đập nát cùng với quả ajwain (một loại quả

của loài Trachyspermum ammi, Fam Umbelliferae) nghiền, đem sắc, có tác dụng

chống bất tỉnh ở trẻ em Y học dân gian Ấn Độ sử dụng thân rễ sâm cau để gây sẩy thai dưới dạng thuốc sắc hoặc thuốc bột uống với đường trong một cốc sữa [16], [24]

Tại Mariana, sâm cau được sử dụng như một loại thực phẩm Tại Philippines, thân rễ sâm cau được sử dụng đơn độc hoặc phối hợp với các loại thuốc khác và được dùng như một loại thuốc bổ, lợi tiểu và kích thích tình dục; thân rễ giã nát đắp trên da

để trị ngứa [42]

Tại Việt Nam, cây sâm cau được trồng làm cảnh, thân rễ được dùng làm thuốc [8] Thường dùng chữa nam giới tinh lạnh, liệt dương, phụ nữ đái đục, bạch đới; người già đái són, lạnh dạ, kém ăn; thần kinh suy nhược; phong thấp, lưng gối lạnh đau, vận động khó khăn [7], [8], [16] Ngày dùng 3 - 9 g phối hợp với các vị khác dạng thuốc sắc hay ngâm rượu

Phụ chú: Tiên mao dùng nhiều gây cường dương, làm tinh hao kiệt sức, người hư yếu

cấm dùng Uống sâm cau thì kiêng ăn thịt trâu bò [7]

1.2.5 Các vấn đề cần nghiên cứu

Các nghiên cứu trên thế giới đều sử dụng nguồn nguyên liệu là dược liệu từ Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanka, Nepal Qua các tài liệu đã công bố ở trong nước đã cho thấy, mặc dù theo kinh nghiệm dân gian sâm cau đã được dùng để làm thuốc như chữa nam giới tinh lạnh, liệt dương, thần kinh suy nhược; phong thấp, lưng gối lạnh đau… nhưng đến nay ở Việt Nam mới chỉ có rất ít nghiên cứu về dược liệu sâm cau được công bố và nghiên cứu này vẫn chưa xác định được thành phần hóa học chính (nhóm curculigoside) và tác dụng theo y học cổ truyền của dược liệu sâm cau Bên cạnh đó,

loài Curculigo orchioides ở Trung Quốc đã được xác định là có độc tính và đã xác

định được LD50 Tuy nhiên, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu về độc tính của dược liệu sâm cau

Vì những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài này với đối tượng nghiên cứu là

dược liệu sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn., họ Hypoxidaceae) được thu hái tại

Việt Nam với mục tiêu là làm rõ hơn về thành phần hóa học chính của thân rễ sâm cau; thử độc tính cấp và thử tác dụng tăng lực nhằm xác định độ an toàn của dược liệu, tạo thêm cơ sở khoa học cho việc giải thích công dụng của sâm cau trong y học cổ truyền và định hướng cho việc phát triển thuốc từ dược liệu này trong y học hiện đại

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu là thân rễ của cây sâm cau thu hái tại Kon Tum, Tây Nguyên vào tháng 8 năm 2013 Tên khoa học của mẫu nghiên cứu được Tiến sĩ Phạm

Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu giám định là Curculigo

orhioides Gaertn (phụ lục 1)

Hình 2.1: Cây sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.)

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thuốc thử, dung môi, hoá chất

Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn

phân tích đã ghi trong Dược điển Việt Nam IV [6]

Dung môi phân tích, các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2.2 Trang thiết bị và máy móc

- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích Statorius độ chính xác 0,001 g

- Tủ sấy

- Sắc ký cột Silica gel F254 cỡ hạt 60 - 200 µm (Merck), Sephadex LH-20, sắc

ký cột pha đảo (RP-18)

- Máy đo phổ hồng ngoại (IR) FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer (Viện Hóa học, VAST)

- Máy đo phổ khối lượng LC/MS/MS – Water – API – ISI (Viện Hóa học, VAST)

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- và 13C-NMR) của hãng Bruker (500MHz), Viện Hóa học, VAST

- Trụ quay Rotarod của UgoBasil

- Máy lắc xoáy

- Chì dạng sợi

2.2.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng Swiss albino, trọng lượng 20 ± 2 g do Học viện Quân y cung

cấp và được để ổn định 3 ngày trước thực nghiệm Động vật được nuôi bằng thực

phẩm viên được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và cho uống đầy đủ

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.1.1 Định tính các nhóm hoạt chất trong dược liệu

Định tính các nhóm chất theo tài liệu [4],[5]

2.3.1.2 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập các hợp chất

Xác định hàm ẩm của dược liệu, cao đặc dược liệu

Cao đặc dược liệu là cao đặc được bào chế từ dịch chiết ethanol sâm cau, sau đây gọi tắt là cao đặc sâm cau (CĐ)

Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu (hoặc CĐ) vào cốc (đã biết chính xác khối lượng), sấy ở 105oC, dưới áp suất thường trong 3 giờ Sau đó lấy cốc ra, làm

nguội tới nhiệt độ phòng bằng cách cho vào bình hút ẩm 15 phút, rồi cân ngay

Làm lại nhiều lần đến khối lượng không đổi [6]

Độ ẩm dược liệu (hoặc CĐ) tính theo công thức:

X = x 100%

Trong đó:

X: hàm ẩm dược liệu (hoặc CĐ) tính ra phần trăm

m1: khối lượng dược liệu (hoặc CĐ) khi chưa sấy

m2: khối lượng dược liệu (hoặc CĐ) sau khi sấy đến khối lượng không đổi

Phân lập

Các phân đoạn được phân lập trên sắc ký cột silica gel pha thường (Merck), sắc

ký cột silica gel pha đảo RP-18, cột Sephadex LH-20 Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn 60 GF254 (Merck), RP18 (Merck) Sắc ký lớp mỏng dùng để theo dõi vết các chất từ các phân đoạn Sắc ký đồ được quan sát dưới ánh đèn tử ngoại

ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% trong ethanol

2.3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết của chất phân lập

Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm; 366 nm và hơ nóng ở 110oC) với tối thiểu 2 hệ dung môi khác nhau

2.3.1.4 Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập

Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa vào các tính chất hóa lý (trạng thái, màu sắc, nhiệt độ nóng chảy, độ quay cực ) và dữ liệu các phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC, HMQC, COSY, NOESY) và so sánh các dữ liệu thu được từ thực nghiệm với các tài liệu đã công bố

2.3.2 Nghiên cứu độc tính cấp và tác dụng tăng lực

2.3.2.1 Đánh giá độc tính cấp

Đánh giá độc tính cấp của CĐ sâm cau qua đường uống theo Phương pháp

nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ Dược thảo của Viện Dược liệu (2006) [17],

và Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc theo tác giả Đỗ Trung Đàm (1996)

[10]

Chuột nhắt trắng thực nghiệm được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí

Tiến hành thử nghiệm trên các lô chuột (mỗi lô 10 con) theo mức liều 10,0 g CĐ/kg thể trọng; 20,0 g CĐ/kg thể trọng; 30,0 g CĐ/kg thể trọng; 45,0 g CĐ/kg thể trọng

Cho chuột nhịn ăn, không nhịn uống 16 giờ trước khi tiến hành thí nghiệm

Theo dõi chuột liên tục trong vòng 6 giờ, 24 giờ, số chuột chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi dùng mẫu thử Các chỉ tiêu theo dõi gồm:

- Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu

- Tỷ lệ chuột chết trong 72 giờ và các dấu hiệu khác trong vòng 7 ngày sau khi thử nghiệm

- Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Litchfield –Wilcoxon

2.3.2.2 Nghiên cứu tác dụng tăng lực

Chúng tôi đánh giá tác dụng tăng lực trên mô hình trụ quay Rotarod theo tài liệu [32]

Nguyên tắc: Chuột nhắt trắng được cặp chì vào đuôi với trọng lượng bằng 6%

trọng lượng của chuột, sau đó cho chuột bám trên trụ quay, xác định thời gian từ khi đưa chuột lên đến khi chuột bị rơi xuống

Tiến hành: Chuột mua về được nuôi 3 ngày trước khi thí nghiệm để chuột thích

nghi điều kiện thí nghiệm Trước khi tiến hành thí nghiệm 1 ngày, cho chuột làm quen với trụ quay Rotarod bằng cách cho chuột bám vào trụ đang quay với tốc độ tối thiểu trong 2 phút và lặp lại một lần nữa sau 2 giờ Bố trí thí nghiệm:

+ Ngày thứ 1: Chuột đã được nhịn ăn, không nhịn uống qua đêm, cặp chì vào đuôi từng chuột (trọng lượng chì bằng 6% trọng lượng chuột) Cho trụ quay với tốc độ

24 vòng/phút, thả cho từng chuột bám vào mỗi ngăn riêng biệt, ghi lại thời gian bám của từng con kể từ khi bám vào trụ quay cho đến khi chuột bị rơi xuống Sau lần chạy thứ nhất, chia đều chuột vào 3 lô thí nghiệm và tính thời gian bám trung bình ( ) của chuột theo từng lô:

Lô 1 (lô chứng): uống nước cất

Lô 2 (lô điều trị): chuột uống CĐ liều 0,2 g/kg thể trọng

Lô 3 (lô điều trị): chuột uống CĐ liều 0,5 g/kg thể trọng

Mẫu thử đều được pha trong nước cất, ở nồng độ phù hợp để đảm bảo thể tích 1 lần cho uống đều ở tất cả các lô là 0,2 ml/10 g thể trọng chuột với liều thử như trên

Sau khi uống 60 phút, kẹp chì vào đuôi chuột và cho chuột bám vào trụ quay và ghi lại thời gian bám của từng con Tính thời gian bám trung bình ( ) của chuột theo từng lô Tiếp tục cho chuột uống nước, cao đặc sâm cau hàng ngày với liều như trên

+ Ngày thứ 7: Sau khi cho chuột uống 60 phút, kẹp chì vào đuôi và cho chuột bám vào trụ quay tốc độ 30 vòng/phút Ghi lại thời gian bám của từng chuột và tính thời gian bám trung bình của chuột ở ngày thứ 7 theo từng lô ( ) Tiếp tục cho chuột uống nước hoặc cao chiết ethanol sâm cau hàng ngày với liều như trên

+ Ngày thứ 14: Sau khi cho chuột uống 60 phút, kẹp chì vào đuôi và cho chuột bám vào trụ quay tốc độ 24 vòng/phút Ghi lại thời gian bám của từng chuột và tính thời gian bám trung bình của chuột ở ngày thứ 14 theo từng lô ( )

Kết quả thực nghiệm: được biểu thị dưới dạng (M ± SE)

Xử lý số liệu: phương pháp thống kê sinh học, sử dụng phần mềm SPSS; sự

khác biệt có ý nghĩa khi p<0,05

Đánh giá kết quả: tỷ lệ % thời gian bám trên trụ quay của từng chuột sau khi

uống thuốc 1 giờ, 7 ngày và 14 ngày so với trước khi uống thuốc

T =

x 100% (i = 1; 7; 14)

2.4 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Nghiên cứu hóa học tại Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thử độc tính cấp và nghiên cứu tác dụng tăng lực tại Khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.1.1 Định tính bằng các phản ứng ống nghiệm

Tiến hành định tính, xác định sơ bộ thành phần hóa học của dược liệu thân rễ sâm cau bằng các phản ứng hoá học đặc trưng cho từng nhóm hoạt chất Kết quả định tính được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả định tính dược liệu thân rễ sâm cau bằng phản ứng hóa học STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả Kết luận

Phản ứng với kiềm (NaOH 10%) ++

có

5 Coumarin Mở, đóng vòng lacton - Không

có Phản ứng với T.T Diazo +

6 Alcaloid

Phản ứng với TT Mayer +

Có Phản ứng với TT Dragendorff +

Phản ứng với TT Bouchardat -

7 Tanin Phản ứng với dung dịch gelatin 1% - Không

có Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% ++

8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không

có

9 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling +++ Có

Bảng 3.2 Kết quả định tính cắn phân đoạn thân rễ sâm cau bằng các phản ứng hóa học

Nhận xét:

Cắn ở phân đoạn n-hexan cho phản ứng dương tính rất rõ với nhóm phytosterol,

dương tính nhẹ với nhóm phenolic; âm tính với nhóm hợp chất saponin

Cắn phân đoạn ethyl acetat cho phản ứng dương tính rất rõ với hai nhóm hợp

chất là saponin và phenolic Cắn n-butanol cho phản ứng dương tính nhẹ với nhóm

phenolic, dương tính với nhóm saponin

3.1.2 Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

Kết quả định tính sâm cau bằng các phản ứng ống nghiệm cho thấy trong thân

rễ sâm cau chứa hợp chất phenolic, saponin, alcaloid, phytosterol, đường khử tự do, chất béo Do đó, chúng tôi tiến hành định tính, phát hiện các nhóm chất này trong dược liệu bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

a Định tính sự có mặt của hợp chất phenolic

Dịch chấm sắc ký: dịch chiết ethyl acetat

Hệ dung môi khai triển: Toluen : ethyl acetat : aceton : acid formic (5:2:2:1)

Thuốc thử: AlCl3 10%/ethanol

Hình 3.1: Sắc ký đồ định tính nhóm phenolic trong thân rễ sâm cau

Nhận xét: sắc ký đồ hình 3.1 cho thấy có các vết hấp thụ màu đen trên nền sáng khi

quan sát ở UV254, quan sát ở UV366 thì thấy các vết đó phát quang xanh, đó chính là các vết của hợp chất phenolic

b Định tính nhóm saponin

Dịch chấm sắc ký: dịch chiết ethyl acetat

Hệ dung môi khai triển: CHCl3 : MeOH : H2O (65:35:10, lớp dưới)

Thuốc thử: H2SO4 10%/ethanol

Hình 3.2: Sắc ký đồ định tính nhóm saponin trong thân rễ sâm cau

Nhận xét: sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy có các vết màu hồng đến tím quan sát ở ánh

sáng thường sau khi phun thuốc thử H2SO4 10%/ethanol

Kết luận: Từ kết quả định tính sơ bộ cho thấy trong thân rễ sâm cau có chứa

hợp chất phenolic, saponin, alcaloid, phytosterol, đường khử tự do, chất béo Trong đó nhóm chất chính là hợp chất phenolic tập trung chủ trong cắn phân đoạn ethyl acetat

3.2 CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ THÂN RỄ SÂM CAU 3.2.1 Chiết xuất

3,6 kg thân rễ sâm cau đã phơi khô (độ ẩm 8,49%), được cắt nhỏ, chiết nóng với ethanol 96% ở nhiệt độ 65oC (chiết 3 lần, mỗi lần 4 giờ) Dịch chiết được gộp lại

và cất loại cồn nước dưới áp suất giảm thu được cắn chiết cồn đã cô khô (540 g) Cắn chiết được hòa tan vào nước cất (0,5 lít) thành hỗn dịch rồi lắc, chiết phân đoạn lần

lượt với n-hexan (0,5 lít × 3 lần), ethyl acetat (0,5 lít × 3 lần), n-butanol (0,5 lít × 3 lần) Các dịch chiết n-hexan, ethyl acetat và n-butanol được tách riêng, cất loại dung

môi dưới áp suất giảm thu được các phần cắn tương ứng: cắn phân đoạn n-hexan (48 g), cắn phân đoạn ethyl acetat (55 g) và cắn phân đoạn n-butanol (105 g) Quy trình chiết xuất, phân đoạn các chất từ thân rễ sâm cau được mô tả tóm tắt trong hình 3.3

Kết quả hàm ẩm của dược liệu sâm cau: 8,49%; của cao đặc được bào chế từ dịch chiết ethanol sâm cau: 20,88%

3.2.2 Phân lập

Cắn phân đoạn ethyl acetat (55 g) được chạy qua cột sắc ký silica gel pha thường (200 g silica gel, đường kính cột 10 cm; chiều dài 1m), rửa giải bằng hệ dung

môi dichloromethan/methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ 0 % đến 100 % Kiểm tra

thành phần dịch rửa giải bằng sắc ký lớp mỏng, thu được 8 phân đoạn chính

(PĐ1-PĐ8)

Phân đoạn PĐ6 (2,3 g) được đưa lên cột sephadex (100 g hạt sephadex LH-20,

đường kính cột 3 cm; chiều dài 80 cm) rửa giải bằng methanol thu được 4 phân đoạn

PĐ6.1 đến PĐ6.4 Phân đoạn PĐ6.2 (0,638 g) tiếp tục được phân tách bằng cột

silicagel pha đảo RP18 (50 g silicagel pha đảo, cột có đường kính 2 cm; chiều dài 80 cm) sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O (1/2) thu được hợp chất SC1 (38 mg)

Phân đoạn PĐ4 (4,8 g) được phân tách bằng cột silica gel pha thường (100 g

silica gel, đường kính cột 4 cm; chiều dài 80 cm) rửa giải gradient bằng hệ dung môi

CH2Cl2/MeOH với các tỷ lệ (15/1; 10/1; 5/1; v/v) thu được 6 phân đoạn (PĐ4.1 đến

PĐ4.6) Phân đoạn PĐ4.5 (0,548 g) được đưa lên cột silica gel pha đảo (50 g silica gel

pha đảo, đường kính cột 2 cm; chiều dài 80 cm) sử dụng hệ dung môi MeOH/H2O

(1/2) làm pha động thu được lần lượt hai hợp chất SC2 (12 mg) và SC3 (14 mg) Hình 3.4 mô tả quy trình phân lập các chất từ cắn phân đoạn ethyl acetat thân rễ sâm cau

Hình 3.3: Sơ đồ chiết xuất và phân đoạn các chất từ thân rễ sâm cau

Chiết nóng với ethanol 96%, 3lần x 4 giờ/lần; thu hồi dung môi

Cắn chiết ethanol (540 g)

Hòa thành hỗn dịch, lắc phân đoạn với

n-hexan (0,5 lít x 3 lần)

Thu hồi dung môi

Cắn n-hexan (48g) Phân đoạn H 2 O

Cắn ethyl acetat (55g) Phân đoạn H 2 O

Thu hồi dung môi

Thu hồi dung môi

Lắc phân đoạn với ethyl acetat (0,5 lít x 3 lần)

Lắc phân đoạn với

n-butanol (0,5 lít x 3 lần)

Cắn n-butanol (105 g) Cắn H

2 O còn lại Dƣợc liệu

(thân rễ sâm cau, 3,6 kg)