Nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng ức chế enzym alpha amylase và alpha glucosidase của phân đoạn dịch chiết lá cây đinh lăng polyscias fruticosa (l ) harms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HỒ LƯƠNG NHẬT VINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α- AMYLASE VÀ α- GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒ LƯƠNG NHẬT VINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α- AMYLASE VÀ α- GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH

CHIẾT LÁ CÂY ĐINH LĂNG

POLYSCIAS FRUTICOSA (L.)HARMS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HỒ LƯƠNG NHẬT VINH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α- AMYLASE VÀ α- GLUCOSIDASE CỦA PHÂN ĐOẠN DỊCH

CHIẾT LÁ CÂY ĐINH LĂNG

POLYSCIAS FRUTICOSA (L.)HARMS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN

MÃ SỐ: 60 72 04 06

Người hướng dẫn: TS ĐÀO THỊ THANH HIỀN

TS NGUYỄN TIẾN ĐẠT

HÀ NỘI 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia trong nhiều lĩnh vực, các anh chị kĩ thuật viên, cùng đồng nghiệp, bạn bè và gia đình

Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng sau đại học, các thầy cô giáo, kỹ thuật viên bộ môn Dược học cổ truyền - Trường ĐH Dược Hà Nội

đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:

TS Đào Thị Thanh Hiền, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong

suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Tiến Đạt, cùng các cán bộ ở Phòng

Hoạt chất sinh học –Viện hóa sinh biển - Viện hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi làm thực nghiệm tại cơ sở

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè - những người

đã luôn ở bên giúp đỡ, động viên, ủng hộ và tạo điều kiện tốt cho tôi trong suốt thời gian học tập cũng như trong cuộc sống

Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Thái Nguyên, ngày 26 tháng 8 năm 2014

Hồ Lương Nhật Vinh

MỤC LỤC

KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về thực vật 3

1.1.1 Tổng quan về chi Polyscias 3

1.1.1.1 Vị trí phân loại 3

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Polyscias 3

1.1.2 Tổng quan về loài Polyscias fruticosa (L.) Harms 4

1.1.2.1 Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật 4

1.1.2.2 Thành phần hóa học 6

1.1.2.3 Tác dụng sinh học 11

1.1.2.4 Một số bài thuốc y học cổ truyền 12

1.2 Tổng quan về enzym α - amylase và enzym α - glucosidase 13

1.2.1 Khái niệm enzym 13

1.2.2 Chất ức chế enzyme 13

1.2.3 Enzyme amylase 15

1.2.3.1 Đặc tính của enzyme α - amylase 15

1.2.3.2 Đặc tính của enzym α - glucosidase 16

1.2.4 Chất ức chế α - amylase và α - glucosidase 17

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương tiện nghiên cứu 20

2.2.1 Hóa chất, thuốc thử 20

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu 20

2.2.3 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc 20

2.2.4 Dụng cụ thiết bị thử hoạt tính in vitro 21

2.2.5 Dụng cụ và thiết bị thử loại hoạt tính in vivo 21

2.3 Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học 21

2.3.1.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ chính 21

2.3.1.2 Chiết xuất và phân lập 21

2.3.1.3 Xác định cấu trúc 24

2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym α - amylase và α - glucosidase in vitro 24

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết in vivo 26

2.3.3.1 Mô hình chuột uống đường sucarose liều cao 27

2.3.3.2 Mô hình chuột gây tiểu đường bằng Streptozocin 27

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 29

3.1 Xác định tên khoa học của cây Đinh lăng nghiên cứu 29

3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 29

3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong lá Đinh lăng 29

3.2.2 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn chiết lá Đinh lăng 30

3.2.3 Phân lập các chất trong phân đoạn nghiên cứu 30

3.3 Nhận dạng cấu trúc các chất phân lập được 32

3.3.1 Nhận dạng chất PFW1 32

3.3.2 Nhận dạng PFW8 35

3.3.3 Nhận dạng PFW2 37

3.4 Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym α - amylase và α - glucosidase invitro 39

3.4.1 Nghiên cứu in vitro tác dụng ức chế enzym α - amylase 38

3.4.2 Nghiên cứu in vitro tác dụng ức chế enzym α - glucosidase 40

3.5 Nghiên cứu tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết in vivo 41

3.5.1 Mô hình chuột dung nạp đường sucarose liều cao 41

3.5.2 Mô hình chuột gây tiểu đường bằng Streptozocin 43

Chương 4: BÀN LUẬN 46

4.3 Về tác dụng sinh học 48

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 53

1 Kết luận 53

2 Đề xuất 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

ĐTĐ Đái tháo đường

ESI-MS Electrospray ionisation mass

1H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

HMBC Heteronuclear mutiple Bond Connectivity

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tóm tắt các saponin triterpenoid trong cây Đinh lăng 7

Bảng 1.2 Một số acid amin có trong cây Đinh lăng 8

Bảng 1.3 Một số vitamin có trong cây Đinh lăng 9

Bảng 1.4 Một số Polyacetylen có trong cây Đinh lăng 9

Bảng 1.5 Một số tinh dầu có trong cây Đinh lăng 10

Bảng 1.6 Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzyme α - amylase 17

Bảng 1.7 Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzyme α - glucosidase 18

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong lá Đinh lăng 29

Bảng 3.2 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn F2 31

Bảng 3.3 Số liệu phổ 13C - NMR của các hợp chất PFW1 32

Bảng 3.4 Số liệu phổ 13C - NMR của các hợp chất PFW1 và PFW8 36

Bảng 3.5 Số liệu phổ 13C - NMR của các hợp chất PFW8 và PFW2 38

Bảng 3.6 Kết quả IC50 hoạt tính ức chế α - amylase 39

Bảng 3.7 Kết quả IC50 hoạt tính ức chế enzyme α - glucosidase 40

Bảng 3.8 Nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình chống dung nạp sucarose tại các thời điểm nghiên cứu 42

Bảng 3.9 Khối lượng của chuột ở các thời điểm nghiên cứu 43

Bảng 3.10 Nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình gây tăng đường huyết bằng STZ tại các thời điểm nghiên cứu 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái thực vật cây Đinh Lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) 5

Hình 1.2 Công thức saponin triterpenoid của cây Đinh lăng 6

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể 17

Hình 2.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn nghiên cứu 22

Hình2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất PFW1, PFW2, PFW8 24

Hình 3.3 Cấu trúc hóa học của chất PFW1 35

Hình 3.4 Tương tác HMBC của hợp chất PFW1 35

Hình 3.5 Cấu trúc hóa học của chất PFW8 37

Hình 3.6 Cấu trúc hóa học của chất PFW2 39

Hình 3.7 Biểu đồ so sánh hoạt tính ức chế α - amylase của cao chiết và chất PFW1 40

Hình 3.8 Biểu đồ so sánh hoạt tính ức chế α - glucosidase của cao chiết và chất PFW1 41

Hình 3.9 Biểu đồ so sánh nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình chống dung nạp sucarose liều cao tại các thời điểm nghiên cứu 42

Hình 3.10 Biểu đồ so sánh nồng độ glucose trong huyết thanh chuột trên mô hình gây tăng đường huyết bằng STZ tại các thời điểm nghiên cứu 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) typ 2 là một bệnh mạn tính do rối loạn chuyển hóa đang có chiều hướng ngày càng phổ biến và gia tăng trên thế giới và ở Việt Nam Bệnh gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm như tim mạch, đột quỵ, mù mắt, suy thận, liệt dương, hoại thư [5]… Các thuốc tân dược điều trị ĐTĐ đều có chi phí cao, nhiều tác dụng phụ và số lượng bệnh nhân sử dụng thuốc kiểm soát được đường huyết còn hạn chế Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm kiếm các thuốc mới từ dược liệu có tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ hiệu quả, an toàn, giá rẻ, ít tác dụng phụ và đường huyết của bệnh nhân ổn định hơn đang là vấn đề được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm

Có nhiều nhóm thuốc được sử dụng trong các phác đồ điều trị ĐTĐ typ 2 trong đó nhóm ức chế men α-glucosidase, là nhóm thuốc có tác dụng làm chậm tiêu hóa và hấp thu carbohydrate làm glucose máu tăng chậm hơn sau ăn, giảm nguy cơ tăng glucose máu và nồng độ glucose máu ban ngày ít dao động Tuy nhiên, thuốc gây ra một số tác dụng không mong muốn như đầy bụng, phân nát, ỉa chảy, buồn nôn, gây bất thường chức năng gan, ngứa da, ngoại ban…[10]

Cây Đinh lăng Polyscias fruticosa (L.) Harms thuộc họ Ngũ gia bì được sử

dụng từ lâu trong y học phương Đông với tác dụng bổ dưỡng, kích thích tiêu hóa, giải độc, kháng khuẩn, tiêu viêm, tăng thể lực và tăng sức bền [18] Bộ phận rễ củ của cây Đinh lăng đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu khá chi tiết cả về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học Tuy nhiên lại không có nhiều nghiên cứu trên bộ phận lá mặc dù lá Đinh lăng cũng có thành phần hóa học giống rễ [12], mà đây lại là nguồn dược liệu phong phú, dễ khai thác Trong chương trình sàng lọc tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh tiểu đường từ nguồn dược liệu thiên nhiên, chúng tôi đã phát hiện dịch chiết toàn phần lá Đinh lăng thể hiện hoạt tính ức chế α-amylase và α-glucosidase, đây là những enzyme đóng vai trò thủy phân carbohydrate có liên quan trực tiếp đến việc tăng đường huyết

Với mong muốn nghiên cứu ra các loại thuốc điều trị ĐTĐ mới có nguồn gốc

từ dược liệu với tác dụng điều trị bệnh ĐTĐ hiệu quả, an toàn, giá rẻ và ít tác dụng

phụ mà vẫn bảo tồn được nguồn dược liệu quý trong nước, đề tài “Nghiên cứu

thành phần hóa học, tác dụng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase của phân đoạn dịch chiết lá cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)” được

thực hiện với các mục tiêu chính sau:

1 Nghiên cứu thành phần hóa học của lá Đinh lăng và một phân đoạn dịch

chiết lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms)

2 Thử tác dụng ức chế α-amylase và α-glucosidase in vitro của phân đoạn nghiên cứu

3 Thử tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết của chất phân lập được từ phân đoạn nghiên cứu

Để đạt được 3 mục tiêu trên, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:

¾ Nghiên cứu về thành phần hóa học:

- Định tính các nhóm chất hữu cơ có trong dịch chiết tổng và một phân đoạn dịch chiết của lá Đinh lăng

- Chiết xuất và phân lập một số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết nghiên cứu

- Xác định cấu trúc các chất phân lập được

¾ Nghiên cứu về tác dụng sinh học:

- Khảo sát tác dụng ức chế α-amylase và α-glucosidase in vitro của phân đoạn nghiên cứu và một chất phân lập được

- Khảo sát tác dụng giảm sự gia tăng đường huyết in vivo của chất phân lập

được

1.1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Polyscias

Cây gỗ nhỏ hay nhỡ có dáng mảnh và có tán lá đẹp, thường xanh, không gai

Lá kép lông chân vịt hay lá đơn có thùy chân vịt hoặc lá kép lông chim với các lá chét có hình dạng thay đổi; lá kèm không có hay hợp lại ở gốc thành một phần phụ nhỏ Cụm hoa tán tạo thành chùm hay chùy; cuống hoa có khớp rụng hay hơi có khớp; đài nguyên hay có 5 răng; cánh hoa 5, tiền khai van Bộ nhị 5, bao phấn hình trứng hay thuôn Bầu dưới 2 ô, ít khi 3-4 ô; vòi nhụy 2-4 rời hay hợp ở gốc Quả dẹt, ít khi gần hình cầu Hạt dẹt [3]

Chi Polyscias có gần 100 loài trên thế giới phân bố rải rác ở vùng nhiệt đới và

cận nhiệt đới, nhiều nhất là ở vùng đảo Thái Bình Dương [13] Ở Việt Nam, hiện nay có hơn 10 loài Đinh lăng [16], đa số Đinh lăng hiện này được sử dụng làm cây cảnh, chỉ có vài loài được sử dụng làm thuốc, loài Đinh lăng được sử dụng làm

thuốc phổ biến nhất là Polyscias fruticosa (L.) Hams Đây là loài có nhiều tác dụng

dược lý giống Nhân sâm [2]

1.1.2 Tổng quan về loài Polyscias fruticosa (L.) Harms

1.1.2.1 Nguồn gốc, phân bố và đặc điểm thực vật

Cây Đinh lăng còn có tên khác là cây gỏi cá, nam dương lân [18]

Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Hams

Tên đồng nghĩa: Panax fruticosum L, Nothopanax fruticosum (L.) Miq,

Tieghenopanax fruticosus (L.) R Vig [18]

Họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

Cây nhỏ quanh năm xanh tốt, cao 0,8-2m [3], [13] Thân nhẵn, không gai, ít

phân nhánh, mang nhiều vết sẹo to, màu xám [3], [8] Lá kép lông chim 3 lần xẻ, mọc so le, dài 20-40cm, không có lá kèm rõ; lá chét có cuống gầy dài 3 - 10mm, phiến lá chét có răng cưa không đều, đôi khi chia thùy, gốc và đầu thuôn nhọn, có mùi thơm, cuống lá dài phát triển thành bẹ to ở phần cuối [3, 18] Hoa thường nở vào tháng 4-7; cụm hoa hình chùy ngắn mang nhiều tán ở ngọn, lá bắc rộng, sớm rụng, hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, đài hợp, mép uốn lượn, tràng năm cánh dài trái xoan, nhọn đầu, nhị năm với chỉ nhị gầy, bầu hạ 2 ngăn [13], [18] Quả dẹt, hình trứng rộng, có vòi, màu trắng bạc [16], [18] Rễ cong queo, dài khoảng 30

cm, rộng khoảng 2,5 cm, đầu trên to, đầu dưới thuôn; mặt ngoài màu trắng xám, có nhiều nếp nhăn dọc, nhiều lỗ bì nằm ngang, nhiều vết tích của rễ con và các đoạn rễ con còn sót lại [4]

Rễ Đinh lăng nên thu hoạch vào mùa đông ở những cây trồng từ 3 năm trở lên (trồng càng nhiều năm thì hệ rễ càng phát triển và lượng hợp chất thu được càng

nhiều) Lá có thể thu hoạch quanh năm, thường dùng lá tươi [3], [12]

Cây Đinh lăng có nguồn gốc từ vùng đảo Polynesie (Thái Bình Dương), thuộc

họ Araliaceae, chi Polyscias, được trồng khắp nơi từ đồng bằng đến miền núi Cây

ưa sáng, ưa ẩm và bóng mát Tái sinh mạnh bằng hạt và cành Thường được trồng chủ yếu bằng cách giâm cành: Chọn những cành bánh tẻ, chặt thành đoạn dài 10-

tỷ lệ hàm lượng là: rễ 0,49%; vỏ rễ 1,00%; lõi rễ 0,11% [21]

Trong lá Đinh lăng cũng có các thành phần hóa học như trong rễ Đinh lăng nhưng hàm lượng ít hơn [12] Hàm lượng saponin toàn phần trong lá là 0,38% [21] Ngoài ra còn có tinh dầu với thành phần chính là β-elemen, α-bergamoten, germacren, γ-bisabolen [33] Gần đây nhất, năm 2012, viện hóa sinh biển-Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã phân lập được 3 hợp chất flavonoid từ lá Đinh lăng là quercitrin, afzelin và kaempferol-3-O-rutonosid [19]

Các loại saponin có trong lá và rễ đã phân lập được [27], [32], [46]:

▪ Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)- β-D-glucuronopyranosyloleanolic (1)

▪ Acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)- β-D-glucuronopyranosyloleanolic (2)

▪ Acid 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2),

β-D-glucopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucuronopyranosyloleanolic (3)

▪ Acid 3-O-[α-L-arabinopyranosyl-(1→2), β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D-

Bảng 1.1 Tóm tắt các saponin triterpen trong cây Đinh lăng

Bảng 1.2 Một số acid amin có trong cây Đinh lăng [23]

Arginin Alanin

H2N

OHO

Acid Glutamic Leucin

H2N

OHO

Bảng 1.3 Một số vitamin có trong cây Đinh lăng [23]

Vitamin B2

(Pyridoxamine)

Vitamin B6 (Pyridoxine) Vitamin B6 (Pyridoxal)

Bảng 1.4 Một số Polyacetylen có trong cây Đinh lăng [31]

Nước sắc rễ Đinh lăng có tác dụng làm tăng sức dẻo dai của cơ thể trên thí

nghiệm cấp tính tương tự như nhân sâm [18]

Các thí nghiệm trên chuột cho thấy cây Đinh lăng có tác dụng lợi tiểu, làm tăng tiết niệu gấp năm lần so với bình thường, làm tăng sức đề kháng của chuột đối với các bức xạ siêu cao tần [3], [18]

Cây Đinh lăng có tác dụng tăng lực, tăng cân, tăng khả năng chịu đựng của bộ đội, vận động viên thể thao [17], [17]

Các hợp chất polyacetylen như (8E)-heptadeca-1,8-dien-4,6-diyn-3,10-diol phân lập được từ cây Panax vietnamensis và Polycias fruticosa cho thấy có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (+), kháng nấm Candida albican nhưng không kháng

được vi khuẩn Gram (-) [31]

Năm 2001, Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã dùng chuột nhắt trắng để thử nghiệm tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng Kết quả cho thấy cao Đinh lăng có tác dụng chống trầm cảm và phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress với liều 45-180 mg/kg thể trọng, khoảng liều này cũng có tác dụng khác như tăng lực, kích thích hoạt động của não bộ và nội tiết, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống viêm và xơ vữa động mạch [17] Dịch chiết cồn của rễ Đinh lăng được nuôi cấy mô trong 6 tháng đã thể hiện tác dụng tăng lực dài ngày, chống stress nóng và kháng viêm thực nghiệm tương tự như dịch chiết cồn của rễ cây Đinh lăng 5 năm tuổi trồng trong điều kiện tự nhiên [14]

Dịch chiết n-butanol của lá cây Đinh lăng với liều 500mg/kg có tác dụng hạ sốt, giảm đau, chống viêm và diệt nhuyễn thể trên chuột nhắt trắng [29]

Cao lá Đinh lăng ở liều 200mg/kg và 500mg/kg làm giảm lượng Malondialdehyde trong não và gan chuột nhắt trắng sau khi được gây tăng bằng CCl4 và làm giảm nồng

độ cholesterol trong máu so với lô không điều trị Cao lá Đinh lăng ở liều 200mg/kg có tác dụng chống oxy hóa và hạ cholesterol ở chuột nhắt cao hơn so với liều 500mg/kg [1].

Năm 2011, Varadharajan và cộng sự đã chứng minh được hoạt tính lợi tiểu của dịch chiết dầu hỏa rễ Đinh lăng trên động vật thí nghiệm [39]

Gần đây nhất, năm 2012, viện Hóa sinh biển- Viện khoa học công nghệ Việt

Nam đã chứng minh trên in vitro tác dụng ức chế enzyme α-amylase của 2 flavonoid

phân lập là quercitrin và kaempferol-3-O-rutonosid với giá trị IC50 tương ứng là 4,61 µg/ml và 59,4 µg/ml [19]

1.1.2.4 Một số bài thuốc y học cổ truyền

Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình [9]

Lá Đinh lăng có vị nhạt, hơi đắng, tính bình [12]

Theo dân gian, rễ Đinh lăng được dùng làm thuốc bổ, chữa cơ thể suy nhược, gầy yếu mệt mỏi, tiêu hóa kém, ho, ho ra máu, đau tử cung, kiết lỵ, làm thuốc lợi tiểu Thân và cành dùng chữa phong thấp, đau lưng Lá dùng chữa cảm sốt, mụn nhọt sưng tấy, sưng vú [13] Dưới đây là một số bài thuốc dân gian có Đinh lăng: Chữa mệt mỏi, biếng hoạt động: Rễ Đinh lăng phơi khô thái mỏng 0,50 g thêm

100 ml nước, đun sôi trong 15 phút, chia 2-3 lần uống trong ngày [18]

Thông tia sữa, căng vú sữa: Rễ Đinh lăng 30-40g Thêm 500ml nước sắc còn

250 ml Uống nóng Uống luôn 2-3 ngày, vú hết nhức, sữa chảy ra bình thường [18] Chữa vết thương: Giã nát lá Đinh lăng đắp lên [18]

Lợi sữa: Lá Đinh lăng tươi 50-100g, bong bóng lợn 1 cái, băm nhỏ, trộn với gạo nếp, nấu cháo ăn Hoặc rễ Đinh lăng tươi 30-40g, thêm 500 ml nước, sắc còn

250 ml, uống nóng, ngày uống 1-2 lần, uống trong 2-3 ngày [12], [16]

Lá Đinh lăng phơi khô đem lót gối hoặc trải giường cho trẻ em nằm giúp phòng bệnh kinh giật [18]

Ở Ấn Độ, người ta cho là cây có tính làm săn, dùng trong điều trị sốt [13]

Ở Campuchia, người ta dùng lá phối hợp với các cây thuốc khác làm bột hạ nhiệt, thuốc giảm đau Lá dùng xông để ra mồ hôi và chữa chứng chóng mặt, dùng

1.2 Tổng quan về enzyme α- amylase và enzyme α-glucosidase

1.2.1 Khái niệm enzyme [15]

Trong cơ thể sống (các tế bào) luôn luôn xảy ra quá trình trao đổi chất Sự trao đổi chất ngừng thì sự sống không còn tồn tại Quá trình trao đổi của một chất là tập hợp của rất nhiều các phản ứng hóa học phức tạp Các phản ứng này có liên quan chặt chẽ với nhau và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme là hợp chất protein xúc tác cho các phản ứng hóa học đó Chúng có khả năng xúc tác đặc hiệu các phản ứng hóa học nhất định và đảm bảo cho các phản ứng xảy ra theo một chiều hướng nhất định với tốc độ nhịp nhàng trong cơ thể sống

Enzyme có trong hầu hết các loại tế bào của cơ thể sống Chính do những tác nhân xúc tác có nguồn gốc sinh học nên enzyme còn được gọi là các chất xúc tác sinh học (biocatalysators) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học

Chất ức chế không thuận nghịch thường phản ứng với enzyme và thay đổi

nó về mặt hóa học Những chất ức chế đó làm thay đổi dư lượng các acid amin quan trọng cần thiết cho hoạt động của enzyme Ngược lại, chất ức chế thuận nghịch liên kết không đồng hóa trị và theo những kiểu khác nhau tùy thuộc vào liên kết chất ức chế-enzyme, phức enzyme-chất nền, hoặc cả hai

Chất ức chế thuận nghịch liên kết với enzyme bằng các tương tác không đồng hóa trị chẳng hạn như liên kết hydrogen, tương tác kị nước và liên kết

ion Nhiều liên kết yếu giữa các chất ức chế và tâm hoạt tính mạnh mẽ và đặc biệt Ngược lại, đối với các chất nền và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuận nghịch thường không trải qua phản ứng hóa học khi liên kết với enzyme và có thể dễ dàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc thẩm tách

Có 4 kiểu của ức chế enzyme thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theo tác động của sự thay đổi nồng độ chất nền của enzyme trên chất ức chế:

- Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition): chất nền và chất ức chế không liên kết với enzyme cùng một lúc Điều này có thể là do chất ức chế có

ái lực với tâm hoạt động của một loại enzyme nên xảy ra sự cạnh tranh giữa chất nền và chất ức chế cạnh tranh vào tâm hoạt động của enzyme Đây là loại

ức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ đủ cao của chất nền bởi vì những chất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự như cấu trúc của chất nền thật

- Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition): chất ức chế chỉ kết hợp với phức enzyme-chất nền mà không kết hợp với enzyme tự do Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzyme làm giảm hoạt tính của nó nhưng không ảnh hưởng đến liên kết của enzyme-chất nền Kết quả là mức độ của sự ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế

- Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibition): chất ức chế kết hợp với enzyme ở vị trí khác với vị trí kết hợp của chất nền tạo thành phức enzyme-chất nền-chất ức chế không bị chuyển hóa tiếp Như vậy, enzyme có thể đồng thời kết hợp cả chất ức chế và chất nền Chất nền và chất ức chế không cạnh tranh với nhau để kết hợp với enzyme và cũng không thể loại trừ tác dụng kìm hãm bằng cách tăng nồng độ chất nền

- Ức chế hỗn tạp (mixed inhibition): là chất ức chế không những liên kết với enzyme tự do mà còn liên kết với cả phức hợp enzyme-chất nền tạo thành phức hợp enzyme-chất ức chế-chất nền nên không tạo được sản phẩm Hiện

tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế Tốc độ ức chế cực đại đo được khi không có chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế

1.2.3 Enzyme amylase [9]

Enzyme amylase là một hệ enzyme phổ biến trong hệ sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước

RR’ + H-OH → RH + R’OH

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin hạn chế Các enzyme amylase có trong nước bọt (còn được gọi là ptyalin), trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Ptyalin bắt đầu thủy phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất ở ruột non nhờ amylase của tuyến tụy

Có 6 loại enzyme được chia vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào)

+ Endoamylase gồm: α-amylase, pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase), transglucosilase (hay oligo-1,6-glucosidase), amylo-1,6-glucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaacharide

+ Exoamylase gồm: β-amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

1.2.3.1 Đặc tính của enzyme α-amylase [33]

Enzyme α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4-glucoside nằm bên trong của phân tử cơ chất (tinh bột, glycogen) một cách ngẫu nhiên và vì thế gọi là enzyme nội bào Enzyme α-amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn song với tốc độ rất chậm Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme α-amylase là quá trình đa giai đoạn + Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin)

+ Giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không màu với iode Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-

7 gốc glucose

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải tới maltotetrose và maltotriose và maltose

Qua một thời gian tác dụng dài sản phẩm thủy phân của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose Tác dụng của enzyme này với amylopectin cũng tương tự nhau nhưng vì không phân cắt được liên kết 1,6-glucoside nên sản phẩm sẽ là 72% maltose, 19% glucose, dextrin thấp phân tử và 8% isomaltose

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp

1.2.3.2 Đặc tính của enzyme α-glucosidase [11], [15]

Enzyme α-glucosidase còn có những tên gọi khác như maltase, transglucosidase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, oligo-1,6-glucosidase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D-glucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α- D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân) Khi thức ăn được hấp thu vào cơ thể thì các carbohydrat trong thức ăn được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzyme ở ruột non Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzyme α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành olisaccharid Enzyme α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếp tục phân hóa các olisaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể 1.2.4 Chất ức chế α-amylase và α-glucosidase

Các chất ức chế 2 enzyme này có ý nghĩa quan trọng trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm… Các nhà khoa học đã tìm thấy rất nhiều hợp chất trong tự nhiên và trong tổng hợp hóa học có khả năng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase

Các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế α-amylase, α-glucosidase như: flavonoid (flavone, flavononol, isoflavone), proanthocyanidin, alcaloid, saponin, triterpenoid, phenolic, tanin, dẫn xuât của cinnamic acid,…

Bảng 1.6 Một số hợp chất tự nhiên ức chế enzyme α-amylase [47]

1 Flavonoid Quercetin, kaempferol, myricetin, hesperetin,

daidzein, rutin, Luteolin, scutellarein, eupafolinCyanidine, (-)-3-O-galloylepicatechin …

α-amylase

Maltose (glucose + Glucose

Tinh bột

Glucose Glucose

Saccharose (Glucose + Fructose)

Glucose Fructose

Glucose huyết tăng α-glucosidase

2 Phenolic (-)-3-O–galloylepicatechin, (-) – 3-O –

galloylcatechin, ellagic acid, gallic acid, gentisic acid, caffeic acid, ferulic acid,…

3 Saponin

và triterpenoid

Betulinic acid, lupeol, squalene, oleanoic acid, ursolic acid, 3-O-[(9Z)-9exadec-9-enoyl]-amyrin…

4 Tanin Strictinin, gallotanin, pedunculagin, 1 (α)- galloyl

pedunculagin, rubusuaviin, lambertianin,…

1 Flavonoid Quercetin 3-O-β-d-xylopyranosyl

(1′′′→2″)-β-d-galactopyranoside, Luteolin, Apigennin, Hesperetin, (+)-catechin, Cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-

galactoside,

2R,3R,4R,5R)2,5-bis(hydroxymethyl)-3,4-dihydroxypyrrolidine, 1-deoxynojirimycin …

2 Alcaloid Piperumbellactam A, piperumbellactam B,

piperumbellactam C, 3,5-dicaffeoylquinic acid, dicaffeoylquinic acid, castanospermin

4,5-3 Saponin

và triterpenoid

3b-Acetoxy-16b-hydroxybetulinic acid, acid l-arabinopyranosyl-(1→4)-α-l-arabinopyranosyl-(1→3)-β-d-xylopyranosyl-(1→4)-α-l-

28-O-α-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-d-fucopyranosyl ester, …

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu cây tươi cả rễ, thân, lá Đinh lăng có độ tuổi trên 1 năm được thu hái ở Đại Từ- TP Thái Nguyên để phân tích hình thái và giám định tên khoa học

- Lá cây Đinh lăng để nghiên cứu thành phần hóa học và thử tác dụng sinh học

2.2 Phương tiện nghiên cứu

p-nitrophenyl-α-2.2.2 Dụng cụ và thiết bị chiết tách mẫu

Dụng cụ tách chiết và tinh chế chất phân lập được sử dụng bao gồm: bình chiết, máy chiết siêu âm JAC Ultrasonic 2010, bình cầu cất quay, bình tam giác, cốc thuỷ tinh, ống đong chia vạch, máy cất quay chân không, máy sấy, bình triển khai sắc ký, bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck), bản sắc ký pha đảo RP18

(Merck, RP C-18 F254), cột sắc ký silicagel pha thường (Merck, Kielselgel 60), pha đảo (30-50 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.), cột sắc ký diaion HP-20,…

2.2.3 Dụng cụ thiết bị xác định cấu trúc

+ Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR AM500 FT–NMR Spectrometer

+ Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên máy AGILENT 1260 series single quadrupole LC-MS system

+ Thiết bị đo điểm nóng chảy Mel-Temp 3.0 (ThermoScientific)

2.2.4 Dụng cụ thiết bị thử hoạt tính in vitro

+ Phiến 96 giếng

+ Pipetman các loại

+ Máy ủ phiến 96 giếng

+ Máy đọc ELISA (Molecular devices Mỹ)

2.2.5 Dụng cụ và thiết bị thử hoạt tính in vivo

+ Kim cong đầu tù, kim tiêm và các thiết bị phụ trợ khác

+ Máy đo đường huyết Onetouch Ultra

+ Máy định lượng sinh hoá bán tự động AU680 của hãng Beckman Coulter…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu thành phần hóa học

2.3.1.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ chính

- Định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ chính có trong lá Đinh lăng và trong phân đoạn nghiên cứu: bằng các phản ứng đặc trưng của các nhóm chất [7]

2.3.1.2 Chiết xuất và phân lập

* Quy trình chiết xuất phân đoạn lá Đinh lăng

Lá Đinh lăng được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm và xay nhỏ thành bột (4 kg) Toàn bộ lượng bột cho vào bình chiết và được làm ẩm bằng methanol, để yên cho dược liệu được thấm ẩm và trương nở hoàn toàn Sau đó đổ methanol ngập dược liệu, cách bề mặt dược liệu khoảng 3cm rồi ngâm ở nhiệt độ phòng trong 24 h Tiến hành chiết 3 lần Dịch chiết gom lại và cô cạn dưới áp suất giảm ở nhiệt độ

500C thu được 470 g cắn chiết dạng cao đặc Cắn toàn phần này được chiết phân đoạn với dung môi hữu cơ cloroform

Phân tán cắn methanol với 1,5 lít nước sau đó thêm 1 lít cloroform Chiết lỏng-lỏng rồi gạn phần cloroform, lấy phần nước Phần nước tiếp tục được chiết với cloroform 2 lần nữa sẽ thu được phân đoạn nước và phân đoạn cloroform Cất thu hồi dung môi phân đoạn cloroform thu được cắn cloroform và dịch nước

Phần dung dịch nước để ở 500C cho bay hơi hết dung môi hữu cơ rồi đưa lên cột sắc ký diaion HP-20 và rửa giải bằng hệ dung môi methanol:nước (với tỷ lệ

0:100; 25:75; 100:0) thu được 3 phân đoạn ký hiệu F1-F3 Phân đoạn F2 được sử dụng để nghiên cứu

Quy trình chiết xuất phân đoạn nghiên cứu được trình bày ở hình 3.1

Bột dược liệu (4 kg)

Diaion HP-20, methanol:nước ( 0:100, 25:75, 100:0)

F3

Cắn MeOH (470 g)

Cô quay

t0, áp suất giảm

+ cloroform (1l x 3 lần)

Phân tán trong nước Chiết

phân

đoạn

™ Phân lập

Qua nghiên cứu tài liệu về tác dụng sinh học của cây Đinh lăng và của saponin triterpen, kết hợp với kết quả nghiên cứu dược lý (được trình bày ở phần 3.4) của dịch chiết (dịch tổng methanol, phân đoạn nước, phân đoạn F2) thấy phân đoạn F2

có tác dụng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase rất mạnh Do đó phân đoạn này được tiến hành chiết xuất, phân lập các hoạt chất tinh khiết

Cắn phân đoạn F2 được hòa tan vào một lượng tối thiểu methanol, sau đó tẩm với silicagel pha thường, tỷ lệ khối lượng 1:1 Khối silicagel ẩm này được quay cất thu hồi dung môi đến thể chất tơi mịn Bột khô thu được dùng để chiết pha rắn trong bước tiếp theo

Chuẩn bị cột: cột sắc ký được rửa sạch, tráng bằng methanol, để khô tự nhiên Lót bông ở đáy cột và cố định chắc chắn trên giá Cho silicagel pha thường lên cột sao cho bề dày lớp silicagel khoảng 1 cm, sau đó đưa lượng chất đã tẩm silicagel nói trên lên cột, gõ nhẹ để bột phân bố đều

Triển khai cột với hệ dung môi ethyl acetat:methanol:nước ( 3:1:0,2) Khảo sát các phân đoạn thu được bằng SKLM, những phân đoạn giống nhau gộp chung lại thì thu được 3 phân đoạn nhỏ F2a-F2c

Trong đó phân đoạn F2a thấy xuất hiện kết tinh Lọc lấy chất kết tinh rồi rửa

và kết tinh lại nhiều lần bằng methanol sau đó sấy khô thu được một chất kết tinh

màu trắng ngà ký hiệu là PFW1 (1 g)

Phân đoạn F2c được phân lập tiếp trên cột sắc ký pha đảo YMC-C18 với hệ dung môi rửa giải bằng methanol:nước (1:1) thu được 2 phân đoạn F2c1-F2c2 Phân đoạn F2c1 thử trên sắc ký đồ chỉ có 1 vết và xuất hiện kết tinh Lọc, rửa, kết tinh lại

nhiều lần bằng methanol và sấy khô thu được 1 hợp chất ký hiệu là PFW2 (20mg) Hợp chất PFW8 (10 mg) thu được từ phân đoạn F2b khi khai triển trên cột sắc

ký silicagel pha thường với hệ dung môi rửa giải cloroform:metanol:nước (1,5:1:0,1)

Hình 2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất PFW1, PFW2, PFW8

2.3.1.3 Xác định cấu trúc

- Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được dựa trên các thông số vật lý như thể chất, màu sắc, độ quay cực, điểm nóng chảy và các dữ liệu phổ cộng hưởng

từ hạt nhân (NMR), phổ khối lượng phun mù điện tử (MS) [25]

2.3.2 Nghiên cứu về tác dụng ức chế enzyme α-amylase và α-glucosidase in vitro

Hoạt tính ức chế α-amylase [35]

* Phương pháp

Hoạt tính ức chế α-amylase được thực hiện dựa vào phản ứng khử tinh bột của α-amylase trong sự có mặt/không có hoạt chất nghiên cứu Lượng tinh bột còn lại sau phản ứng được định lượng bằng cách bổ sung thêm dung dịch iod và đo mật độ quang trên máy đo ELISA ở bước sóng 650 nm

* Kết quả: được tính theo công thức sau:

F2

CC, Silicagel EMW (3:1:0,2)

Để kết tinh

Trong đó:

ODmẫu là giá trị mật độ quang của hỗn hợp tinh bột có ủ với enzyme và mẫu

ODâm là giá trị mật độ quang của hỗn hợp tinh bột ủ với enzyme và không có mẫu

ODdương là giá trị mật độ quang của hỗn hợp tinh bột không ủ với enzyme và mẫu

™ Quá trình tiến hành cụ thể

Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase được tiến hành thử in vitro trên 4 mẫu thử

(dịch chiết methanol tổng, phân đoạn nước, phân đoạn F2, chất PFW1) và chứng dương Acarbose

Với mỗi một mẫu thử và chứng dương Acarbose, ta tiến hành như sau:

Đun sôi 100 mg tinh bột trong 5 ml đệm phốt-phát (pH 7,0) trong 5 phút sau

đó để nguội đến nhiệt độ phòng Tiếp đó trộn 50 μl dung dịch tinh bột này với 30 μl mẫu thử nghiệm pha loãng trong đệm phốt-phát (pH 7,0) và ủ trong tủ ấm 37 oC Sau 5 phút bổ sung 20 μl dung dịch α-amylase (5 μg/ml pha trong đệm phốt-phát)

và ủ tiếp trong 15 phút

Lượng tinh bột còn lại sau phản ứng được định lượng bằng cách bổ sung thêm

50 μl dung dịch iod và đo mật độ quang trên máy đo ELISA ở bước sóng 650 nm Thực hiện 3 lần lặp lại ở mỗi nồng độ thử và thử ở 5 nồng độ khác nhau

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase [35]

* Phương pháp

- Hoạt tính ức chế α-glucosidase được thực hiện dựa vào phản ứng thủy phân p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNG) thành đường glucose và p-nitrophenol dưới xúc tác α-glucosidase trong sự có/không có mặt hoạt chất nghiên cứu Mật độ quang của p-nitrophenol sinh ra sau phản ứng được đo trên máy ELISA (Molecular Device-Mỹ) ở bước sóng 405 nm

* Kết quả: được tính theo công thức sau:

% ức chế = 100 - [(C - B)/(A - B) × 100]

Trong đó:

A: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu nghiên cứu,

có α-glucosidase và pNPG)

B: Mật độ quang trung bình của mẫu trắng (chỉ có dung dịch pNPG)

C: mật độ quang trung bình của mẫu thử

™ Quá trình tiến hành cụ thể

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được tiến hành thử in vitro trên 4 mẫu

thử ( methanol tổng, phân đoạn nước, phân đoạn F2, chất PFW1) và chứng dương Acarbose

Với mỗi mẫu thử và chứng dương, ta tiến hành như sau:

Tra vào phiến 96 giếng 10 μL mẫu (pha trong DMSO ở các nồng độ phù hợp) cùng với 45 μL enzyme α-glucosidase (10 U/ml) rồi ủ trong 5 phút Sau đó bổ sung

45 μL pNPG (5 mM pha trong đệm phosphate) rồi tiếp tục ủ hỗn hợp trong 30 phút

có chứa tỷ lệ thích hợp protein, carbohydrat, mỡ, chất khoáng, vitamin, chất xơ (0,8g thức ăn/con chuột/ngày)

+ Nước uống: nước máy sinh hoạt

+ Ánh sáng: chiếu sáng với chu kỳ 12 giờ sáng, 12 giờ tối

2.3.3.1 Mô hình chuột dung nạp đường sucarose liều cao

™ Phương pháp: Phương pháp xác định khả năng chống dung nạp sucarose của

các chất chiết [43]

Nghiên cứu khả năng chống dung nạp sucarose của các chất chiết được thực hiện theo phương pháp của Wu et al, 2011 [43] Theo đó, 18 con chuột được chia thành 3 nhóm

- Lô 1 (Chứng thường): uống nước (0,2 ml/con)

- Lô 2 (Chứng dương): uống Acarbose liều 5 mg/kg thể trọng

- Lô 3 (thử mẫu): uống PFW1 liều 200 mg/kg thể trọng

Chuột cho nhịn đói 12 giờ trước khi thí nghiệm rồi được uống mẫu thử hoặc nước Sau 30 phút cho uống mẫu thử, chuột được cho uống sucarose liều 4g/kg thể trọng Máu được thu thập ở các thời điểm 0; 0,5; 1 và 2 giờ sau uống sucarose

™ Phương pháp xử lí số liệu

- Số liệu được xử lí trên Excel

- Kết quả được biểu diễn dưới dạng: giá trị trung bình ± SD

2.3.3.2 Mô hình chuột gây tiểu đường bằng Streptozocin

™ Gây tiểu đường cho chuột nhắt

Gây tăng đường huyết cho 27 con chuột bằng cách tiêm dung dịch Streptozocin liều 200 mg/kg thể trọng/01 lần duy nhất (pha trong đệm vô trùng Natri citrate) Lấy máu định lượng glucose trong huyết thanh sau 96 giờ (4 ngày) tiêm Streptozocin Chọn những con chuột có nồng độ glucose huyết lớn hơn hoặc bằng 150 mmol/dL thì được coi là mắc bệnh tiểu đường [30]

™ Tiến hành thử nghiệm

18 con chuột bị mắc tiểu đường (lựa chọn trong 27 con) được chia thành 3 lô thí nghiệm (6 con/lô) sao cho các lô có trị số glucose huyết trung bình ban đầu tư-ơng đương nhau và bắt đầu cho uống hoạt chất nghiên cứu:

- Lô 1 (Chứng thường): uống nước hòa tan mẫu (0,3 ml/con/ngày)

- Lô 2 (Chứng dương): uống Acarbose liều 5 mg/kg thể trọng/ngày

- Lô 3 (Thử mẫu): uống PFW1 liều 100 mg/kg thể trọng/ngày

Cho chuột uống mẫu thử hoặc nước trong 4 tuần, mỗi ngày cho chuột uống 1 lần vào buổi sáng Sau 2 và 4 tuần lấy máu chuột để định lượng glucose huyết (chuột đã được nhịn đói 12 giờ trước)

™ Phương pháp xử lí số liệu

- Các số liệu được sử lí trên Excel, thuật toán thống kê student t’ test, F’test

và phương pháp phân tích phương sai một nhân tố ngẫu nhiên (one way ANOVA)

- Kết quả được biểu diễn dưới dạng: giá trị trung bình ± SD

- p<0,05 được coi là sai khác có ý nghĩa so với lô chứng

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Xác định tên khoa học của cây Đinh lăng nghiên cứu

Mẫu Đinh lăng được thu hái tại Đại Từ - TP Thái Nguyên vào tháng 08/2014,

có kết quả giám định như sau:

Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Harm

Họ: Araliaceae

Tên thường gọi: Đinh lăng, Đinh lăng lá xẻ, Đinh lăng lá nhỏ

3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong lá Đinh lăng

Kết quả định tính các nhóm chất có trong lá Đinh lăng (Polyscias fruticosa

(L.) Harms) được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong lá Đinh lăng

STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Sơ bộ kết luận

Phản ứng với TT Mayer + Phản ứng với TT Bouchardat +

Phản ứng với TT.diazo - Không

5 Anthranoid Phản ứng Borntrager - Không

STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Sơ bộ kết luận

8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 + Có

9 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% + + Có

10 Đường khử Phản ứng với TT Felling + Có

11 Polysaccharid Phản ứng với dd Lugol + Có

Nhận xét: Trong lá Đinh lăng có các nhóm chất chính sau: alcaloid, glycosid tim,

saponin, flavonoid, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử, polysaccharid, chất

béo, sterol

3.2.2 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn chiết lá Đinh lăng

* Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong phân đoạn F2

Tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất chính sau: Alcaloid, Glycosid tim,

flavonoid, saponin, tanin, acid hữu cơ, acid amin, đường khử, polysaccarid, sterol,

chất béo

Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong phân đoạn F2

STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả kết luậnSơ bộ

Phản ứng với TT Mayer - Phản ứng với TT Bouchardat -

Phản ứng với dd chì acetat 10% -

5 Tanin

Phản ứng với dd gelatin 1% -

Không

6 Acid hữu cơ Phản ứng với Na2CO3 - Không

7 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin 3% - Không

8 Đường khử Phản ứng với TT Felling - Không

9 Polysaccarid Phản ứng với dd Lugol - Không

11 Sterol Phản ứng Liebermann-Bouchardt - Không

Ghi chú: (-): Phản ứng âm tính

(+): Phản ứng dương tính

(++): Phản ứng dương tính rõ

Nhận xét: Trong phân đoạn F2 dịch chiết lá Đinh lăng có các nhóm chất sau:

flavonoid, saponin, glycosid tim