Nghiên cứu khả năng ức chế alpha glucosidase của 4 loài thuộc chi gymenma r BP ở việt nam

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HƯƠNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ALPHA GLUCOSIDASE CỦA 4 LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R.BR... DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thuốc điều trị đái

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG

ỨC CHẾ ALPHA GLUCOSIDASE CỦA

4 LOÀI THUỘC CHI GYMENMA R.BR Ở

VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ HƯƠNG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ALPHA GLUCOSIDASE CỦA 4 LOÀI THUỘC CHI GYMNEMA R.BR Ở

Trường đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng thành kính, trước tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới toàn thể thầy cô giáo và các anh chị trong bộ môn Hóa Sinh đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin cảm ơn người thầy trực tiếp dìu dắt em trong những bước đầu làm

khoa học, TS Đào Thị Mai Anh Cô không những là người cô đáng kính giúp

chúng em có những định hướng và quyết định đúng đắn trong quá trình nghiên cứu

mà cô luôn ở bên chúng em trong những lúc khó khăn nhất, động viên và đưa ra những lời khuyên bổ ích cho chúng em Đó chính là những nền tảng vững chắc để

từ đó em có thể tự bước đi trong sự nghiệp của em sau này

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo TS Phùng Thanh Hương đã

luôn hết mình hỗ trợ chúng em trong quá trình học tập và nghiên cứu

Đồng thời em cũng xin cảm ơn tới những người thân trong gia đình và bạn

bè đã luôn động viên và tiếp thêm sức mạnh cho em trong những lúc khó khăn nhất

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh Viên

Nguyễn Thị Hương

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ… 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Đái tháo đường ( Diabetes Melitus) 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Dịch tễ 4

1.1.4 Các thuốc điều trị đái tháo đường 6

1.2 Enzym alpha-glucosidase 8

1.2.1 Sơ lược về enzym alpha-glucosidase 8

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động của enzym alpha glucosidase 10

1.2.3 Các chất ức chế enzym alpha-glucosidase 11

1.3 Chi Gymnema R.Br 13

1.3.1 Vị trí, phân loại 13

1.3.2 Đặc điểm thực vật và phân bố 14

1.3.3 Thành phần hóa học 15

1.3.4 Tác dụng dược lí 17

1.3.5 Các nghiên cứu đã được tiến hành ở Việt Nam về chi Gymnema 19

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Thiết bị 23

2.1.4 Dụng cụ 23

2.2 Nội dung nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Xây dựng phương pháp đánh giá tác dụng ức chế alpha glucosidase của dược liệu 24

2.3.2 Áp dụng phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym alpha glucosidase của dược liệu 28

2.3.3 Xác định IC50 của các dược liệu tiềm năng 29

2.3.4 Phương pháp xử lí số liệu 29

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 30

3.1 Kết quả 30

3.1.1 Kết quả xây dựng phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế alpha glucosidase của dược liệu 30

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế alpha glucosidase của dược liệu 32

3.1.3 Kết quả xác định IC50 của các mẫu dược liệu tiềm năng 38

3.2 Bàn luận 40

3.2.1 Về phương pháp nghiên cứu 40

3.2.2 Về khả năng ức chế enzym alpha glucosidase của các mẫu dược liệu 42

3.2.3 Về sự đa dạng trong khả năng ức chế alpha glucosidase của các mẫu dược liệu 43

KẾT LUẬN 45

KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADA American Diabetes Association - Hiệp hội đái tháo đường Hoa Kỳ

BCRP Breast Cancer Resistance Protein–Protein kháng thuốc điều trị ung

thư vú

CVD Cardivascular Disease – Bệnh tim mạch

CKD Chronic Kidney Disease – Bệnh thận mạn

ĐTĐ Đái tháo đường

GDM Gestational Diabetes Mellitus – Đái tháo đường thai kì

GLP-1 Glucagon like peptid 1

HbA1C Hemoglobin A1C

HDL High Density Lipoprotein – Lipoprotein tỉ trọng cao

IDF International Diabetes Federation – Liên đoàn đái tháo đường thế giới

INSR Insulin Receptor

LDL Low Density Lipoprotein – Lipoprotein tỉ trọng thấp

SGLT2 Sodium glucose cotransporter 2

WHO World Health Organization – Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các thuốc điều trị đái tháo đường………6

Bảng 1.2 Một số hợp chất có hoạt tính ức chế alpha glucosidase được cô lập từ

thiên nhiên……….12

Bảng 1.3 Đặc điểm thực vật và phân bố của 4 loài thuộc chi Gymenma ở Việt

Nam………14

Bảng 2.1 Kí hiệu các mẫu dịch chiết dược liệu trong nghiên cứu……….21

Bảng 2.2 Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính………28

Bảng 3.1 Hoạt tính ức chế alpha glucosidase của acarbose ở các nồng độ khác

Bảng 3.5 Hoạt tính ức chế alpha glucosidase của các mẫu Gymnema inodorum

(Lour.) Decne Wight……… 37

Bảng 3.6 IC50 của các dược liệu và Acarbose………39

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Số lượng bệnh nhân đái tháo đường (20 – 79 tuổi) năm 2013………5

Hình 1.2 Cấu trúc tiểu phần N tận và tiểu phần C tận của phân tử alpha

glucosidase………9

Hình 1.3 Cấu trúc của các acid gymnemic và gymnemagenin phân lập được từ

Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult………16

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của lượng p-nitrophenol tạo ra (thông

qua A) theo thời gian với các hoạt độ enzym khác nhau 30

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn % ức chế alpha glucosidase của acarbose ở các nồng

Hình 3.6 Hoạt tính ức chế alpha glucosidase của các mẫu Gymnema inodorum

(Lour.) Decne Wight……… 38

Hình 3.7 IC50 của các dược liệu và Acarbose………39

Hình P.1 Đặc điểm hình thái loài Gymnema Sylvestre (Retz.) R Br Ex Schult

Hình P.2 Đặc điểm hình thái loài Gymnema inodorum (Lour.) Dence Wight

Hình P.3 Đặc điểm hình thái loài Gymnema Latifolium Wall ex Wight

Hình P.4 Đặc điểm hình thái loài Gymnema yunnanense Tsiang

Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cứu 23

Sơ đồ 2.2 Quy trình thí nghiệm khảo sát động học enzyme……….26

Sơ đồ 2.3 Quy trình đánh giá tác dụng ức chế alpha glucosidase của

Acarbose………27

ĐẶT VẤN ĐỀ

“Thế kỉ 21 là thế kỉ của các bệnh nội tiết và rối loạn chuyển hóa” – đó là những dự báo của các chuyên gia y tế từ những thập niên 90 của thế kỷ XX Dự báo này đã và đang trở thành hiện thực Theo ước tính của liên đoàn đái tháo đường quốc tế (IDF), năm 2013 số bệnh nhân mắc bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) là 382 triệu người và gây ra tổng thiệt hại lên đến 548 tỉ USD [36] Đáng chú ý là có tới 80% bệnh nhân ĐTĐ đang sống ở các quốc gia có thu nhập bình quân trung bình hoặc

thấp Bệnh nhân đái tháo đường cần được điều trị suốt đời, trong khi đó các thuốc

điều trị ĐTĐ hiện nay đều có giá thành cao và nhiều tác dụng phụ gây ra nhiều khó khăn trong quá trình điều trị và chăm sóc bệnh nhân Do đó, việc tìm ra các thuốc mới có hiệu quả cao, ít tác dụng phụ và giá thành hợp lí đang là vấn đề cấp thiết, thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Có nhiều hướng nghiên cứu khác nhau nhưng việc xuất phát từ thảo dược là xu hướng phát triển thuốc phổ biến hiện nay ở các nước trong đó có Việt Nam

Thực tế, từ lâu thảo dược và các chế phẩm có nguồn gốc từ thảo dược đã đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong điều trị ĐTĐ không chỉ bởi ưu thế cạnh tranh

về chi phí mà còn bởi tính hiệu quả và an toàn của nó Đã có nhiều loài thảo dược được sử dụng để điều trị căn bệnh này, trong đó, tác dụng hỗ trợ điều trị ĐTĐ của

dây thìa canh (Gymnema sylvestre) đã được biết đến và nghiên cứu từ lâu trên thế

giới Ở một số nước dây thìa canh đã được sử dụng rộng rãi với nhiều biệt dược khác nhau như Diabeticin (Ấn Độ), Sugarest (Mỹ), Gymnema (Nhật Bản), Glucos

care (Sigapore) Tại Việt Nam các nhà khoa học cũng đã phát hiện sự có mặt của

các loài thuộc chi này [5],[9] Kết quả nghiên cứu gần đây nhất của TS Phùng Thanh Hương và ThS Phạm Hà Thanh Tùng về tác dụng hạ glucose máu của 4 loài

thuộc chi Gymnema R.Br thu hái ở các địa phương khác nhau ở Việt Nam:

Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schul, Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema inodorum (Lour.) Decne cho thấy các

dược liệu này có khả năng hạ đường huyết đáng kể và đây có thể được coi là những

dược liệu tiềm năng trong điều trị đái đường [11] Mặc dù đã có nhiều công trình trong nước được triển khai nhằm nghiên cứu tác dụng, thành phần hóa học, đặc điểm thực vật và phân bố của dây thìa canh ở Việt Nam nhưng chưa có các nghiên cứu về cơ chế hạ đường huyết của các loài dây thìa canh ở Việt Nam là gì? Do đó,

để góp phần làm sáng tỏ cơ chế hạ glucose huyết của 4 loài thuộc chi Gymnema

R.Br ở Việt Nam chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu đánh giá khả năng ức

chế alpha glucosidase của 4 loài thuộc chi Gymnema R.Br ở Việt Nam” với 2

mục tiêu sau:

1 Khảo sát hoạt tính ức chế alpha glucosidase của dịch chiết toàn phần của 4

loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schul, Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema inodorum (Lour.) Decne thuộc chi Gymnema R.Br của Việt Nam đối với enzym alpha glucosidase trên mô hình in vitro

2 Xác định IC50 của các mẫu dược liệu tiềm năng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đái tháo đường ( Diabetes Melitus)

1.1.1 Định nghĩa

Theo hiệp hội đái tháo đường Mỹ (American Diabetes Association-ADA) [20]: “ĐTĐ là một nhóm bệnh chuyển hóa, có đặc điểm là tăng glucose máu, là hậu quả của sự thiếu hụt insulin hoặc khiếm khuyết trong các hoạt động của insulin hoặc

cả hai Tăng glucose máu mạn tính thường dẫn đến sự hủy hoại, rối loạn chức năng

và suy yếu chức năng của nhiều cơ quan đặc biệt là mắt, thận, tim và mạch máu”

 ĐTĐ týp 1 vô căn: Một số dạng ĐTĐ týp 1 không rõ nguyên nhân Bệnh nhân có insulin thấp trường diễn và có nguy cơ nhiễm toan ceton nhưng không có bằng chứng về sự tự miễn

 ĐTĐ týp 2: Trước đây còn được gọi là ĐTĐ không phụ thuộc insulin Chiếm khoảng 90-95% tổng số bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ Nguyên nhân là do thiếu hụt insulin tương đối trên nền kháng insulin

 ĐTĐ thai kì (GDM): ĐTĐ thai kì được định nghĩa là bất cứ rối loạn dung nạp glucose huyết nào khởi phát hoặc lần đầu tiên được chẩn đoán phát hiện trong thời kì mang thai Khoảng 7% phụ nữ có thai mắc phải ĐTĐ thai kì, chiếm khoảng 200 000 bệnh nhân mỗi năm

 ĐTĐ do nguyên nhân khác như:

 Giảm chức năng tế bào beta do khiếm khuyết gen MODY (maturity Onset Diabetes of the young - ĐTĐ khởi phát trên bệnh nhân trẻ tuổi, thường trước

25 tuổi)

 Giảm hoạt tính insulin do khiếm khuyết gen INSR

 Bệnh lí tụy ngoại tiết (viêm tụy, chấn thương, cắt bỏ tụy, ung thư tụy, sơ kén tụy, bệnh nhiễm sắc tố sắt, bệnh tụy sơ sỏi)

 Bệnh nội tiết (to đầu chi, hội chứng cushing, u tiết glucagon, u tủy thượng thận tăng tiết catecholamin, cường giáp, u tiết somatostatin, u tiết aldosteron)

 Tăng đường huyết do hóa chất hoặc thuốc (thường gặp ở đối tượng có đề kháng insulin, một số hoạt chất làm giảm sự tiết insulin bởi tế bào beta như corticoid, hormon tuyến giáp, diazocid, thuốc đồng vận giao cảm beta…) Ngoài tác dụng kiểm soát đường huyết của insulin, trên não, insulin còn có vai trò trong nhận thức bao gồm cả chức năng ghi nhớ [19] Vì vậy, thiếu insulin và glucose trong máu cao là những yếu tố chính ảnh hưởng xấu đến chức năng này của não, hậu quả là gia tăng nguy cơ bệnh Alzheimer và chứng mất trí Tính trạng này được đề cập như đái tháo đường týp 3 [40]

1.1.3 Dịch tễ

Hiện nay, ĐTĐ đã trở thành một vấn đề mang tính toàn cầu (hình 1.1):

Hình 1.1: Số lượng bệnh nhân đái tháo đường (20-79 tuổi) năm 2013 [36]

Theo ước tính của liên đoàn đái tháo đường quốc tế (IDF), năm 2013 có khoảng 382 triệu người lớn bị ĐTĐ và con số này sẽ tiếp tục tăng 55% và chạm mốc 592 triệu người trong vòng 25 năm tới [36] Tỉ lệ mắc ĐTĐ khác nhau ở các châu lục và các vùng lãnh thổ Bờ tây Thái Bình Dương là khu vực có nhiều bệnh nhân ĐTĐ hơn khu vực khác Châu Phi là khu vực có số lượng bệnh nhân ĐTĐ thấp nhất Trung Quốc đứng đầu về số bệnh nhân ĐTĐ (20-79 tuổi) với 98,4 triệu người, tiếp sau đó là Ấn Độ và Mỹ với 65,1 và 24,4 triệu người Năm 2013, ĐTĐ

đã cướp đi sinh mạng của 5,1 triệu người trên thế giới và theo ước tính cứ mỗi 6 giây có 1 người chết do ĐTĐ [36]

Đái tháo đường gây ra gánh nặng khổng lồ về chi phí điều trị cho người bệnh, tạo ra áp lực to lớn đối với nền y tế các nước Theo thống kê của IDF, ước tính tổng chi phí cho ĐTĐ trên toàn thế giới là 548 tỉ USD vào năm 2013 và dự

kiến tăng lên 627 tỉ vào năm 2035 [36]

Ở Việt Nam, các nghiên cứu có quy mô lớn về dịch tễ ĐTĐ đã được tiến hành, cung cấp một cái nhìn cụ thể hơn về tình hình ĐTĐ ở nước ta Năm 2001, điều tra dịch tễ học bệnh ĐTĐ theo tiêu chuẩn quốc tế mới với sự giúp đỡ của các chuyên gia hàng đầu của WHO, được tiến hành ở 4 thành phố lớn: Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ tại 4 thành phố này ở

đối tượng lứa tuổi 30-64 tuổi là 4,9%, tỉ lệ rối loạn dung nạp glucose máu là 5,9% [3] Năm 2013, trong kết quả công bố của “Dự án phòng chống Đái tháo đường Quốc gia” do Bệnh viện Nội tiết Trung ương thực hiện trên 11.000 người tuổi 30-69 tại 6 vùng gồm: Miền núi phía Bắc, Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ và Tây Nam Bộ đã cho thấy tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ cao nhất ở Tây Nam Bộ là 7,2%, thấp nhất ở khu vực Tây Nguyên 3,8% [1]

Cho đến năm 2013, theo thống kê của liên đoàn đái tháo đường quốc tế, Việt Nam có khoảng 3,3 triệu người lớn (30-79 tuổi) mắc bệnh ĐTĐ, chiếm khoảng

5,37% tổng dân số, và có khoảng 54.953 người chết liên quan đến ĐTĐ [36]

1.1.4 Các thuốc điều trị đái tháo đường

1.1.4.1 Các thuốc tân dược

 Các thuốc điều trị ĐTĐ týp 1: Insulin là chỉ định bắt buộc đối với bệnh nhân ĐTĐ týp 1 do sự thiếu hụt insulin tuyệt đối Insulin có nhiều loại nhưng nhìn chung có 2 dạng chính là insulin tác dụng nhanh và insulin tác dụng chậm Hiện nay, insulin có dạng bào chế mới dạng inhaler, đưa thuốc vào máu bằng đường phổi với nhiều ưu điểm vượt trội, giảm số lần tiêm insulin hàng ngày cho bệnh nhân ĐTĐ và tăng chất lượng cuộc sống [22]

 Các thuốc điều trị ĐTĐ týp 2: Bên cạnh việc phối hợp với các biện pháp khác như kiểm soát chặt chẽ ăn uống, vận động thể lực hợp lí, tùy thuộc vào tình trạng của bệnh nhân có thể sử dụng thêm một hoặc một số loại thuốc điều trị ĐTĐ đặc hiệu khác Các thuốc điều trị ĐTĐ đường uống được trình bày trong bảng 1.1 [27]:

Bảng 1.1: Các thuốc điều trị đái tháo đường đường uống

Sulfonylure -Glibenclamid

-Glipizid -Gliclazid

Tăng tiết insulin -Hạ đường huyết

-Tăng cân -Thiếu máu cơ tim cục bộ Meglitinid -Repaglinid

-Nateglinid

Tăng tiết insulin -Hạ đường huyết

-Tăng cân -Thiếu máu cơ tim cục bộ Thiazolidind

ion

-Pioglitazone -Rosiglitazon

Tăng độ nhạy cảm của insulin

-Tăng cân -Suy tim -Loãng xương -Tăng LDL -Tăng nguy cơ nhồi máu

Làm chậm quá trình tiêu hoá và hấp thu carbonhydrat

-Tiêu chảy, đầy hơi

Chất ức chế

DPP-4

-Sitagliptin -Alogliptin

-Tăng tiết insulin (phụ thuộc glucose)

-Giảm tiết glucose (phụ thuộc glucose)

-Phù mạch/mề đay và các phản ứng dị ứng khác qua trung gian miễn dịch -Viêm tụy cấp

Chủ vận

dopamin 2

Bromocriptin -Điều biến cơ chế

vùng dưới đồi của chuyển hóa

-Tăng nhạy cảm của insulin

-Hoa mắt/ngất xỉu -Buồn nôn

-Mệt mỏi -Viêm mũi

Chất ức chế

SGLT2

-Canagliflozin -Dapagliflozin -Empagliflozin

-Ngăn cản tái hấp thu glucose ở thận

-Tăng thải glucose qua nước tiểu

-Nhiễm khuẩn đường tiết niệu

-Đi tiểu nhiều -Hạ huyết áp -Mệt mỏi -Tăng LDL -Tăng creatinin Chủ vận

receptor

GLP-1

-Exenatid -Liraglutid -Albiglutid -Dulaglutid

-Tăng tiết insulin (phụ thuộc glucose)

-Giảm tiết glucagon (phụ thuộc glucose) -Chậm làm rỗng dạ dày

-Tạo cảm giác no

-Buồn nôn,nôn, tiêu chảy -Tăng nhịp tim

-Viêm tụy cấp -Tăng sinh tế bào C trong tuyến giáp/ U giáp

Chất tương

tự Amylin

Pramilintid -Giảm tiết glucagon

-Chậm làm rỗng dạ dày

-Tạo cảm giác no

-Tác dụng phụ trên tiêu hóa (Buồn nôn/nôn) -Hạ đường huyết trừ khi dùng cùng insulin

1.1.4.2 Các dược liệu điều trị đái tháo đường

Các thuốc có nguồn gốc hóa dược ngoài những tác dụng phụ kể trên còn có

một số hạn chế khác như: giá thành cao, người bệnh có xu hướng dung nạp thuốc

sau một thời gian dùng thuốc Vì vậy, hiện nay, việc sử dụng thảo dược và các chế

phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên là một xu hướng có nhiều triển vọng Trên thực

tế, có nhiều loại dược liệu được biết đến với tác dụng điều trị ĐTĐ tốt và đang được

sử dụng rộng rãi trên thị trường dưới dạng chế phẩm như: Epinsulin (Pterocarpus

marsupium), Bonidabet (Gymnema Sylvestre, Momordica charantia, Trigonella

foenum-graecum L.), Diabecon (Gymnema sylvestre, Pterocarpus marsupium),

Pancreatic Tonic 180 (Pterocarpus marsupium, Gymnema sylvestre ) Ở Việt Nam,

một số cây đã và đang được nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết điển hình như:

dây thìa canh (Gymnema R.Br.) [16], cỏ ngọt (Stevia rebaudiana), sinh địa

(Rehmania glutinosa), bông ổi (Lantana camara) [12], mướp đắng (Momordica

charantia) [15], ý dĩ (Coix lachryma jobi) [6], bằng lăng nước (Lagerstroemia

nitrophenyl–α–D-glucosidase, transglucosidase, glucosidoinvertase,

α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-α-D-glucosidase, maltase

1.2.1.2 Phân bố

Alpha-glucosidase (EC.3.2.1.20) có trên màng bản chải ruột non và chiếm

khoảng 2% tổng số protein [68] Enzym này phân bố trên toàn bộ chiều dài ruột

non, với hoạt tính tăng chậm dần và đạt đỉnh ở hồi tràng [26] Ngoài ra, alpha

glucosidase còn được tìm thấy ở biểu mô thận [68]

1.2.1.3 Cấu trúc

Enzym alpha glucosidase có 2 tiểu phần: tiểu phần N tận và tiểu phần C tận (hình 1.2) [50] Cả 2 tiểu đơn vị này đều có trọng lượng phân tử ~100 kDa và thuộc gia đình GH31 phân nhóm 1 do có chuỗi WiDMNE trong trung tâm xúc tác [44], [56]

Hình 1.2: Cấu trúc tiểu phần N tận (A) và C tận (B) của phân tử alpha

glucosidase [44], [56]

1.2.1.4 Vai trò

Alpha glucosidase (EC.3.2.1.20) có vai trò xúc tác cho phản ứng chuyển oligosacarid thành các phân tử đường nhỏ hơn để được hấp thu vào máu Cơ chế của nó là cắt đứt liên kết α-D-1,4 glucose đầu không khử

Cụ thể, khi thức ăn là các carbohydrat được đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của các enzym trong hệ tiêu hóa là α-amylase tuyến nước bọt và tuyến tụy, carbohydrat được thủy phân thành các phân tử đường nhỏ hơn như dextrin, maltotriose, maltose [30] Hỗn hợp này sau đó được thủy phân bởi các enzym alpha-glucosidase ở màng ruột non (EC.3.2.1.20), enzym alpha glucosidase trong lysosym (EC.3.2.1.3) và sucrase-isomaltase (EC.3.2.148, EC.3.2.10) thành glucose và được hấp thu vào máu [44], [56] Như vậy, bằng cách ức chế hoạt động của enzym alpha glucosidase có thể làm giảm sự thủy phân carbohydrat và làm chậm quá trình hấp thu glucose vào máu do đó giúp kiểm soát lượng glucose máu sau ăn

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt động của enzym alpha glucosidase

1.2.2.1 Nồng độ cơ chất

Cũng như các enzym khác, khi nồng độ của cơ chất tăng thì tốc độ của phản ứng chuyển hóa sẽ tăng, sản phẩm được tạo ra sẽ càng nhiều Tuy nhiên, đến một mức nào đó, enzym sẽ bão hòa cơ chất và tốc độ phản ứng không tăng lên nữa Vì vậy, cần lựa chọn nồng độ thích hợp trong phản ứng để tốc độ phản ứng tối đa nhưng không lãng phí cơ chất [4]

1.2.2.2 Nồng độ enzym

Khi nồng độ enzym tăng lên, tốc độ phản ứng cũng tăng Tuy nhiên, khi nồng độ enzym tăng đến một mức nhất định, sản phẩm tạo ra quá nhiều sẽ tác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, phản ứng đạt trạng thái bão hòa và tốc độ phản ứng sẽ không tăng lên nữa [4]

1.2.2.3 Nhiệt độ

Khoảng nhiệt độ tối thích cho phản ứng của enzym alpha glucosidase từ nấm

men Saccharomyces cerevisiae là 30 - 40ᵒ C [38] Khi tăng nhiệt độ lên quá cao,

enzym sẽ bị biến tính do bị phá vỡ các liên kết trong cấu trúc

1.2.2.4 pH

Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trường, vì vậy pH có tác động rất lớn tới tốc độ phản ứng enzym Một sự thay đổi nhỏ so với pH tối ưu cũng dẫn đến sự giảm hoạt độ enzym do nó làm thay đổi sự ion hóa của nhóm chức trong trung tâm hoạt động enzym Vì vậy việc lựa chọn pH tối ưu để thực hiện thực nghiệm rất quan trọng Với alpha glucosidase, khoảng pH tối ưu là 6–7 [31], [34],[38],[47],[48],[55]

1.2.2.5 Ion kim loại

Các ion kim loại nặng có thể ức chế enzym alpha glucosidase (Ví dụ:

Hg2+,Ag+,Zn2+,…) Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hưởng tới

cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [4]

1.2.2.6 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất ức chế

Chất hoạt hóa là những chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm Thông thường là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ như các vitamin tan trong nước

Chất ức chế là những chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hoặc làm enzym không còn có khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm Các cơ chế ức chế enzym bao gồm ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh Chất ức chế cạnh tranh

là những chất có cấu trúc tương tự cơ chất, kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động, ngăn chặn enzym kết hợp với cơ chất Trong cơ chế ức chế không cạnh tranh, chất ức chế gắn với trung tâm điều hòa của enzym làm giảm hoặc mất khả năng

hoạt động của enzym [4]

nó như ít tác dụng phụ, giảm giá thành

Cho đến nay, các hợp chất ức chế enzym alpha-glucosidase được chia thành các nhóm chính sau: disaccarid, iminosugar, thiosugar, pseudominosugar, carbasugar, và các hợp chất không có liên kết glucosid (bảng 1.2) [46]

Bảng 1.2: Một số hợp chất có hoạt tính ức chế alpha-glucosidase đƣợc cô lập từ

thiên nhiên Nhóm Nguồn gốc Tên hoạt chất Công thức của hoạt

Hạt

Mormodica charantia và

từ trái

Grifola frondosa

5-Angylocalyx pynaertii

1,4-dideoxy-1,4- imino-D-

arabinitol (DAB-1)

Marsdenia condurango

Lá cây

Alstonia scholaris

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009) Vị trí phân loại của chi

Gymnema R.Br như sau: ngành ngọc lan (magnoliophyta), lớp ngọc lan

(magnoliopsida), phân lớp hoa môi (lamiidae), bộ long đởm (gentianales), họ trúc

đào (apocynaceae), phân họ thiên lý (asclepiadoideae), chi: Gymnema R.Br

Gymnema inodorum (Lour.) Decne

[2], [9]

Gymnema yunnanense Tsiang [2], [18]

Thân Cao 6-10m,

Thân có lông

Cao đến 10m Thân nhẵn

Cao 10 m Thân nhẵn

Cao 8m Thân có nhựa mủ vàng

Lá Phiến bầu dục

xoan ngược

Phiến rộng hình trứng thuôn đến hình trứng Nhẵn hay có lông mảnh dọc theo gân

Hình trứng thuôn hoặc hình trứng rộng

Phiến hình trứng, bầu dục hoặc trứng ngược Bề mặt và gân lá có phủ lông sét nâu Hoa -Cụm hoa xim,

mm, mặt ngoài có lông

-Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ dính

ở tràng, có hàng lông xếp dọc theo tràng phụ

-Khối phấn thuôn

-Đầu nhụy dạng vòm, vượt cao hơn ống tràng

-Cụm hoa xim, xếp xoắn ốc tới

4 cm

-Tràng hoa màu vàng, 6 - 7 mm,

có lông mịn dày đặc phía ngoài ống tràng dạng hình trụ

-Khối phấn hình chữ nhật

-Đầu núm nhụy

có hình mái vòm, thò lên trên

-Cụm hoa xim -Tràng hàn liền, màu vàng Ống thùy hình trứng,

có phần phụ ở họng, tràng mang lông dày màu vàng nâu

-Khối phấn hình chữ nhật

-Bộ nhụy gồm 2

lá noãn rời nhau

Quả Quả đại dài 5,5

cm, rộng ở nửa

dưới

Quả đại, hình mác, vách dày và hơi có sợi

Quả 2 đại, hình mác, Vỏ quả nhẵn

Quả đại

Hạt Hạt dẹp, mào

lông dài 3 cm

Hạt cỡ khoảng 1,5×1 cm, mào lông dài 4 cm

Hạt khoảng 1,5×1cm, mào lông khoảng 4

cm

Hạt hình trứng thuôn dài, mào lông 2,5 cm

-Ở Việt Nam: Thái

Nguyên, Hòa Bình, Tuyên Quang, Nam

Bộ

-Trên thế giới:

Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam, Ấn Độ

-Ở Việt Nam:

Nam Bộ, Nha Trang, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Hòa Bình

1.3.3 Thành phần hóa học

Cho đến nay, các nghiên cứu sâu về thành phần hóa học được tập trung vào

loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Schult với các nhóm chất triterpen saponin

thuộc 2 nhóm olean và dammaran Saponin khung Olean có các acid gymnemic và gymnemasaponin Trong khi đó saponin khung dammaran là các gymnemasid [67] Trong lá còn xác định có resin, albumin, chlorophyl, carbohydrat, acid tartaric, acid formic, acid butyric, anthraquinon, alkaloid inositol, acid hữu cơ, parabin, calci oxalat, lignin, cellulose [62]

Thành phần tác dụng chính được xác định là acid gymnemic [49], [62] Các acid gymnemic là các dẫn chất thế acyl (Tiglolyl, Methyltutylroyl,…) của acid deacylgymnemic (DAGA) DAGA tương ứng là dẫn xuất thế 3-O-beta-glucoronide của gymemagenin [23] Cấu trúc của Gymnemagenin và 17 loại acid gymnemic được minh họa trong hình 1.3:

Acid Gymnemic XVI

Hình 1.3: Cấu trúc của các acid gymnemic và gymnemagenin phân lập đƣợc

từ Gymnema sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [64]

Thành phần thứ hai được quan tâm nghiên cứu liên quan đến cơ chế hạ

12 Acid gymnemic XII β- gla3

β-Glucopyranosyl (β-glc ) β-gla β-arabino-2 –Hexulopyranosyl (β-OG)

Tga = Tigloyl Mba = 2-methylbutyroyl

đường huyết là Gurmarin (Hình 1.4), một polypeptid có khả năng làm mất cảm

giác ngọt mà không ảnh hưởng tới các vị giác khác, được phân lập từ lá Gymnema

sylvestre (Retz.) R Br ex Schult [61]

Hình 1.4: Cấu trúc của Gurmarin [18]

đường huyết Trên người, 22 bệnh nhân ĐTĐ týp II đã uống cao Gymnema sylvestre

với liều 400 mg/ngày, trong 18 - 20 tháng kết hợp thuốc điều trị tiểu đường cho thấy nhóm điều trị có sự giảm glucose máu đáng kể và đồng thời lượng insulin tiết ra từ tụy tăng lên [28]

Nếu như loài Gymnema sylvestre được nghiên cứu nhiều thì ở các loài còn lại kết quả nghiên cứu còn hạn chế, đặc biệt loài Gymnema lactifolium chỉ mới được

nghiên cứu ở Việt Nam

- Với loài Gymnema inodorum: Kết quả một nghiên cứu trên 20 người khỏe

mạnh sau 15 phút uống glucose, nồng độ glucose giảm rõ rệt ở nhóm sử dụng dược liệu (p < 0,05; N = 73) Khi cho bệnh nhân ăn uống bình thường

thay vì sử dụng glucose đường uống, các tác giả cũng thu được kết quả tương

tự [21]

- Với loài Gymnema yunnanense: Nghiên cứu được tiến hành trên chuột sử

dụng liều 100mg/kg tiêm màng bụng Kết quả cho thấy ở ngày thứ 5, glucose máu lúc đói giảm rõ rệt và đến ngày thứ 12 thông số này trở về bình thường [69]

1.3.4.2 Một số tác dụng dược lí khác

Các nghiên cứu về tác dụng dược lí khác chủ yếu được tiến hành trên loài Gymnema

sylvestre

a Tác dụng làm mất cảm giác ngọt

Dịch chiết lá và rễ Gymnema sylvestre đã được chứng minh có khả năng ức

chế các nút trên lưỡi có vai trò cảm nhận vị ngọt và vị đắng, do đó làm giảm tiêu thụ các thức ăn ngọt ở người bị ĐTĐ và hỗ trợ điều trị ĐTĐ [66]

b Tác dụng hạ lipid

Nghiên cứu in vivo tiến hành trên chuột cho thấy có sự giảm hấp thu các chất béo khi cho chuột (được ăn chế độ ăn giàu chất béo) uống dịch chiết Gymnema

sylvestre Sau 2 tuần, các chỉ số như: triglycerid huyết tương, cholesterol toàn phần,

mật độ lipoprotein đều giảm, mức độ giảm tuân theo sự phụ thuộc nồng độ - đáp

ứng [29] Dịch chiết nước của Gymnema sylvestre còn có tác dụng ức chế tích lũy

lipid ở gan chuột ăn chế độ ăn giàu chất béo tương tự như chitosan [60]

d Tác dụng chống béo phì

Gymnema Sylvestre giúp giảm cân qua việc làm giảm cảm giác ngọt Preuss

trong các nghiên cứu của mình đã chứng minh rằng dịch chiết chuẩn hóa Gymnema

sylvestre kết hợp với acid hydrocitric và niacin gắn chromium có tác dụng giảm cân

kết hợp với việc duy trì mức lipid an toàn cho cơ thể [54], [53]

1.3.5 Các nghiên cứu đã đƣợc tiến hành ở Việt Nam về chi Gymnema R.Br

Ở Việt Nam, các nhà khoa học đã phát hiện ra sự có mặt của các loài thuộc

chi Gymnema R.Br và gần đây đã có nhiều nghiên cứu được triển khai [5], [9] Các

nghiên cứu chủ yếu tập trung vào hoạt tính hạ đường huyết, thành phần hóa học, đặc điểm hình thái, tính đa dạng thực vật phục vụ cho công tác bảo tồn, nhân giống, khai thác sử dụng hiệu quả nguồn dây thìa canh ở Việt Nam

 Nghiên cứu về hoạt tính hạ đường huyết

o Với loài Gymnema Sylvestre (Retz) R.Br ex Schult : năm 2008, Trương

Thị Tâm đã bước đầu đánh giá hoạt tính các phân đoạn dịch chiết loài này sau 5 ngày trên mô hình chuột bị gây đái tháo đường bằng STZ cho kết quả 2 phân đoạn có tác dụng hạ đường huyết là ethyl acetat và nước [14]

o Với loài Gymnema latifolium Wall ex Wight: Năm 2011, nghiên cứu của

Trần Văn Ơn và cộng sự cho thấy dịch chiết lá loài Dây thìa canh lá to

(Gymnema latifolium Wall ex Wight) với liều 10g lá khô/kg thể trọng có

tác dụng hạ đường huyết trên cả chuột bình thường (24,07 %) và trên chuột gây tăng đường huyết bởi STZ (36,31%) [13]

o Bên cạnh 2 loài kể trên, nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Thủy cũng đã phát hiện thêm 2 loài nữa cũng có khả năng hạ glucose ở Việt Nam:

Gymnema yunnanense Tsiang, Gymnema inodorum (Lour.) [16]

 Nghiên cứu khác về thành phần hóa học

Những nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa học lá của 4 loài thuộc

chi Gymnema: Gymnema inodorum (Lour.) Decne, Gymnema latifolium Wall ex Wight, Gymnemaư yunnanense Tsiang đều có chứa các thành phần

tương tự nhau là saponin, flavonoid, coumarin, đường khử, sterol, chất béo

và acid amin [7],[14],[17] Trong đó, theo kết quả nghiên cứu của Lương Thúy An đã cho thấy: flavonoid tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat và n-buthanol Saponin triterpenoid có trong 3 phân đoạn: chloroform, ethylacetat và n-buthanol, trong đó tập trung chủ yếu trong phân đoạn ethylacetat và n-buthanol [1] Các nghiên cứu khác về thành phần hóa

học của 4 loài Gymnema R.Br cho thấy sự không tương đồng về số lượng

cũng như hàm lượng của các hoạt chất giữa các loài khác nhau hay giữa các mẫu thu hái tại những địa phương khác nhau của cùng một loài [8],[17]

 Nghiên cứu về đa dạng sinh học

Sử dụng chỉ thị RADP để đánh giá đa dạng di truyền, nghiên cứu bước đầu của Ths Phạm Hà Thanh Tùng đã xác định được hệ số số tương đồng của 27 mẫu nghiên cứu là 0,44 – 0,88 Kết quả này chỉ ra sự khác biệt về mặt di truyền giữa các mẫu trong cùng một loài thu hái ở các địa phương khác nhau [18]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu là dịch chiết lá của các mẫu thuộc 4 loài trong chi Gymnema

R.Br được thu hái ở các địa phương khác nhau và được định danh bởi PGS.TS.Trần

Văn Ơn, trường đại học Dược Hà Nội Để thử tác dụng sinh học, các mẫu thu về

đều được phơi se trong bóng râm, sấy khô ở 45 – 50oC, xay nhỏ thành bột, hàm ẩm không quá 5% Bột dược liệu được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol 80o Dịch chiết thu được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm cho tới cắn [16] Cắn sau đó được pha thành mẫu thử trong DMSO với các nồng độ 5000

µg/mL, 1000 µg/mL, 500 µg/mL để thử hoạt tính

Dịch chiết của các mẫu dược liệu được mã hóa và trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Kí hiệu các mẫu dịch chiết dược liệu trong nghiên cứu

Stt Loài Mã mẫu Nơi thu mẫu-Đặc điểm

8 GY2 Gia Lai 1

- Đĩa 96 giếng đáy bằng CP4096 (Supplex Inc,Mỹ)

- Các micropiet và đầu côn phù hợp với các thể tích 10-100 µL, 100-1000 µL

- Các dụng cụ thụy tinh: bình cầu, pipet, cốc có mỏ,

Các dụng cụ đều đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để thực hiện được các mục tiêu của đề tài, quá trình nghiên cứu bao gồm những nội dung chính sau (sơ đồ 2.1):

Sơ đồ 2.1: Nội dung nghiên cứu