Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym α glucosidade của một số cây thuốc an giang và thành phần các hoạt chất của thân cây ngũ linh chỉ embelia ribes burm f

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ NGỌC HẠNH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY NGŨ LINH CHỈ Embelia ribes Burm.f LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH TP HỒ CHÍ MINH – 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ NGỌC HẠNH NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT CỦA THÂN CÂY NGŨ LINH CHỈ Embelia ribes Burm.f Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH Mã số: 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA PHÂN TÍCH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS NGUYỄN THỊ THANH MAI TP HỒ CHÍ MINH – 2011 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận văn này, nhận nhiều góp ý, bảo giúp đỡ tận tình nhiều thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Mai, cô hết lòng dạy bảo, động viên, truyền thụ kinh nghiệm quý báu dẫn suốt trình học tập thực đề tài luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn đến GS.TSKH Nguyễn Công Hào, PGS.TS Nguyễn Ngọc Hạnh, PGS TS Trần Lê Quan, TS Tôn Thất Quang, TS Nguyễn Trung Nhân có góp ý quí báu để hoàn thành luận văn Xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô anh chị, bạn học viên cao học khóa 17, 18, 19, 20, em sinh viên trường Đại học Khoa học tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh động viên, giúp đỡ có góp ý quý báu cho suốt trình học tập, thực nghiệm hoàn chỉnh đề tài tốt nghiệp Xin bày tỏ lòng biết ơn đến thầy cô, đồng nghiệp trường Đại học An Giang tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành trình học tập hoàn thành đề tài luận văn Và tất cả, xin cám ơn cha mẹ gia đình bên cạnh động viên hỗ trợ suốt trình học thực đề tài luận văn Tôi xin cám ơn tất thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp gia đình tôi! Xin cám ơn người! Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011 Lê Thị Ngọc Hạnh MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ TỔNG QUAN KHÁI QUÁT VỀ BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 1.1 Định nghĩa bệnh đái tháo đường 1.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 1.2.1 Đái tháo đường loại 1.2.2 Đái tháo đường loại 1.3 Tác hại bệnh đái tháo đường 1.3.1 Các biến chứng cấp tính 1.3.2 Các biến chứng mãn tính 1.4 Phương pháp chữa trị bệnh đái tháo đường 1.4.1 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường loại 1.4.2 Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường loại ENZYM a-GLUCOSIDASE 2.1 Sơ lược enzym 2.2 Chất ức chế enzym 2.3 Sơ lược enzym α-glucosidase 2.4 Tác nhân ức chế enzym α-glucosidase 10 2.4.1 Disaccharid 11 2.4.2 Iminosugar 12 2.4.3 Carbasugar pseudoaminosugar 14 2.4.4 Thiosugar 14 2.4.5 Hợp chất liên kết glycosidic 15 2.4.6 Một số chất ức chế tổng hợp 16 2.5 Nguyên tắc thử hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase 18 2.5.1 Nguyên tắc 18 2.5.2 Phần trăm ức chế I% 18 2.5.3 Cách xác định IC50 19 KHÁI QUÁT VỀ CÂY NGŨ LINH CHỈ 20 3.1 Danh pháp 20 3.2 Mô tả thực vật 21 3.3 Phân bố 21 3.4 Công dụng dân gian 22 3.5 Tính chất dược lý 23 3.5.1 Kháng khuẩn 23 3.5.2 Kháng viêm, làm lành vết thương 23 3.5.3 Ngừa thai 23 3.5.4 Trừ giun, sán 24 3.5.5 Ức chế enzym acetyl cholinesterase 24 3.5.6 Ức chế enzym α-amylase 24 3.5.7 Chữa bệnh đái tháo đường 24 3.5.8 Chống co giật 25 3.6 Các hợp chất cô lập từ Ngũ Linh Chỉ 25 3.6.1 Các hợp chất cô lập từ rễ 25 3.6.2 Các hợp chất cô lập từ hạt 27 3.6.3 Các hợp chất cô lập từ 27 3.6.4 Các hợp chất cô lập từ 27 THỰC NGHIỆM HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 28 1.1 Hóa chất 28 1.2 Dụng cụ 28 1.3 Thiết bị 29 QUY TRÌNH SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG 29 2.1 Chuẩn bị mẫu nguyên liệu 29 2.2 Quy trình điều chế cao thô 30 2.3 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase số thuốc An Giang 34 2.3.1 Chuẩn bị hóa chất 34 2.3.2 Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 34 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NGŨ LINH CHỈ 36 3.1 Quá trình ly trích mẫu thân Ngũ Linh Chỉ 36 3.2 Quá trình cô lập hợp chất từ cao etyl acetat thân Ngũ Linh Chỉ 38 3.2.1 Cô lập hợp chất từ phân đoạn A 38 3.2.2 Cô lập hợp chất từ phân đoạn C 40 3.3 Xác định cấu trúc hợp chất cô lập từ thân Ngũ Linh Chỉ 43 3.4 Khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase hợp chất cô lập từ thân Ngũ Linh Chỉ 43 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT QUẢ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM a-GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG 44 1.1 Kết điều chế cao thô số thuốc An Giang 44 1.2 Kết thử hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase số thuốc An Giang 45 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NGŨ LINH CHỈ 49 2.1 Kết thử hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase mẫu cao thân Ngũ Linh Chỉ 49 2.2 Kết thử hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase mẫu cao phân đoạn từ cao etyl acetat thân Ngũ Linh Chỉ 50 2.3 Biện luận cấu trúc hợp chất cô lập từ thân Ngũ Linh Chỉ 52 2.3.1 Hợp chất 53 2.3.2 Hợp chất 56 2.3.3 Hợp chất 58 2.3.4 Hợp chất 63 2.3.5 Hợp chất 65 2.3.6 Hợp chất 70 2.3.7 Hợp chất 72 2.4 Kết thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase chất cô lập từ thân Ngũ Linh Chỉ 73 KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, giới, bệnh đái tháo đường (hay gọi bệnh tiểu đường) bệnh không lây phổ biến nhất, gây nhiều biến chứng trầm trọng, ảnh hưởng đến sống bệnh nhân xã hội Tại Việt Nam, tình hình mắc bệnh đái tháo đường có chiều hướng gia tăng, đặc biệt thành phố lớn Đái tháo đường gánh nặng cho kinh tế xã hội toàn giới kỉ 21 Chính vậy, việc nghiên cứu tìm phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học giới Trong phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường loại phương pháp ức chế enzym α-glucosidase phương pháp quan tâm có chế đơn giản an toàn Tuy nhiên, thuốc ức chế enzym αglucosidase sử dụng tác dụng phụ, chủ yếu xảy hệ tiêu hóa Do đó, để hạn chế tối đa tác dụng phụ này, nhà khoa học mong muốn tìm hợp chất có khả ức chế enzym α-glucosidase có nguồn gốc từ tự nhiên Và nhiều nhà khoa học giới công bố nhiều công trình nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase, cô lập nhiều hợp chất thiên nhiên có hoạt tính ức chế mạnh Việt Nam nước nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật phong phú Từ xưa, dân gian lưu truyền nhiều thuốc dùng để chữa bệnh đái tháo đường loại dược thảo Song, thật loại dược thảo có khả ức chế enzym α-glucosidase hay không? Và có, thành phần hóa học định khả này? Để trả lời cho câu hỏi này, tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase số thuốc An Giang chọn mẫu có hoạt tính mạnh để tiếp tục khảo sát thành phần hoạt chất nhằm tìm chất có hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase, góp phần làm cho ngành hóa dược nước ta ngày phát triển Đây mục tiêu nghiên cứu đề tài DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C H-NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H brs : mũi đơn bành rộng (broad singlet) CD3OD : metanol deuteri hóa CDCl3 : cloroform deuteri hóa CHCl3 : cloroform COSY : phổ tương quan (COrrelation SpectroscopY) 1H-1H d : mũi đôi (doublet) dd : mũi đôi- đôi (doublet of doublets) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer dq : mũi đôi-bốn (doublet of quartets) dt : mũi đôi-ba (doublet of triplet) HMBC : phổ tương quan 1H-13C qua 2, nối (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation spectroscopy) HSQC : phổ tương quan 1H-13C qua nối (Heteronuclear Single-Quantum Correlation spectroscopy) Hz : hertz IC50 : nồng độ ức chế 50 % enzym (Inhibitory Concentration 50 %) J : số ghép m : mũi đa (multiplet) MeOH : metanol MHz : megahertz MS : khối phổ (Mass Spectrometry) NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) NXB : nhà xuất pp : trang (paper) ppm : part per million quin : mũi năm (quintet) s : mũi đơn (singlet) SKBM : sắc kí mỏng SKC : sắc kí cột t : mũi ba (triplet) δH, δC : độ dịch chuyển hóa học 1H, 13C HỢP CHẤT - CDCl3 - HMBC Phụ lục 5.13: Phổ HMBC mở rộng hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - HMBC Phụ lục 5.14: Phổ HMBC mở rộng hợp chất HỢP CHẤT - MS Phụ lục 5.15: Phổ MS hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - 1H 1-OCH3 4-OCH3 Phụ lục 6.1: Phổ 1H-NMR hợp chất 3a 3b HỢP CHẤT - CDCl3 - 13C Phụ lục 6.2: Phổ 13C-NMR hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - 13C & DEPT Phụ lục 6.3: Phổ 13C-NMR DEPT hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - COSY Phụ lục 6.4: Phổ COSY hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - HSQC Phụ lục 6.5: Phổ HSQC hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - HSQC Phụ lục 6.6: Phổ HSQC mở rộng hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - HMBC Phụ lục 6.7: Phổ HMBC hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - HMBC Phụ lục 6.8: Phổ HMBC hợp chất HỢP CHẤT - MS Phụ lục 6.9: Phổ MS hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - 1H -OCH3 Phụ lục 7.1: Phổ 1H-NMR hợp chất HỢP CHẤT - CDCl3 - 13C Phụ lục 7.2: Phổ 13C-NMR hợp chất HỢP CHẤT - MS Phụ lục 7.3: Phổ MS hợp chất [...]... hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của 30 mẫu cây thuốc An Giang 46 Bảng 3.4 : Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase các mẫu cao của thân cây Ngũ Linh Chỉ 50 Bảng 3.5 : Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase các mẫu cao phân đoạn từ cao etyl acetat của thân cây Ngũ Linh Chỉ 51 Bảng 3.6 : Dữ liệu phổ 1H-NMR (500MHz), 13 C-NMR (125MHz) và tương quan... -20- HDKH: TS Nguyễn Thị Thanh Mai 3 KHÁI QUÁT VỀ CÂY NGŨ LINH CHỈ Hình 1.2: Cây Ngũ Linh Chỉ, hoa và quả Ngũ Linh Chỉ 3.1 Danh pháp [2][3][4][16] Cây Ngũ Linh Chỉ có tên khoa học là Embelia ribes Burm f. , thuộc họ Ðơn nem (Myrsinaceae) Ngoài ra, cây Ngũ Linh Chỉ còn có một số tên gọi khác như: cây thùn mũn (tên ở Phú Thọ), cây chua meo (tên ở Lạng Giang, Bắc Giang) , cây phi tử, cây chua ngút – vốn vén,... chất ức chế và chất nền đều tác động lên trung tâm hoạt động của enzym, chất ức chế sẽ choán chỗ của chất nền Khi chất nền có nồng độ cao hơn chất ức chế thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế; ngược lại thì ức chế hoàn toàn enzym · Ức chế không cạnh tranh (non-competitive inhibition): enzym có thể đồng thời kết hợp với cả chất nền và chất ức chế, trong đó chất ức chế kết hợp với enzym ở vị trí...DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 : Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài 31 Bảng 2.2 : Thể tích các dung dịch được sử dụng trong quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase 35 Bảng 3.1 : Thu suất cao ly trích của các mẫu cây thuốc nghiên cứu 44 Bảng 3.2 : Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của chất đối chứng dương 45 Bảng 3.3 : Kết quả thử hoạt. .. TS Nguyễn Thị Thanh Mai 2.5 Nguyên tắc thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase [6] 2.5.1 Nguyên tắc Hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase của các mẫu nghiên cứu được xác định dựa vào phương pháp phân tích trắc quang Để khảo sát hoạt tính ức chế α- glucosidase, chúng tôi sử dụng p-nitrophenyl α- D-glucopyranoside (pNPG) làm chất nền pNPG sẽ bị α- glucosidase chuyển hóa sinh ra α- D-glucose và p-nitrophenol... kết hợp của chất nền với enzym tạo thành phức enzym chất nền chất ức chế không bị chuyển hóa tiếp Sự kết hợp này sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian theo hướng không thuận lợi cho hoạt động xúc tác của enzym Đối với kiểu ức chế này, tác dụng ức chế không thể bị loại trừ bằng cách tăng nồng độ chất nền · Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition): chất ức chế chỉ kết hợp với phức enzym chất nền... tranh–không cạnh tranh, không cạnh tranh–kháng cạnh tranh Trong kiểu ức chế này, chất ức chế không chỉ liên kết với enzym tự do mà còn liên kết với cả phức enzym chất nền tạo thành phức enzym chất nền chất ức chế không tạo được sản phẩm Hiện tượng ức chế này chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -9- HDKH: TS Nguyễn Thị Thanh Mai 2.3 Sơ lược về enzym α- glucosidase [5][6] Trong thực... đường loại 2 và hiện đang thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế hoạt động của enzym α- glucosidase mà ít hoặc không gây ra các phản ứng phụ như các chất ức chế trước đây HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -11- HDKH: TS Nguyễn Thị Thanh Mai Thông thường, việc nghiên cứu các hoạt chất ức chế enzym α- glucosidase luôn bắt đầu từ các hợp chất có trong... trong việc tạo thành, hoặc cắt đứt các liên kết của phân tử chất nền tạo thành sản phẩm phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzym 2.2 Chất ức chế enzym [1] Chất ức chế (hay còn gọi là chất kìm hãm, inhibitor) enzym là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzym không còn khả năng xúc tác biến chất nền thành sản phẩm Chất ức chế enzym có bản chất hóa học rất khác nhau, nó có thể là chất hữu cơ... có hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase với IC50 ≤ 1 mg mL-1 48 Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn 12 mẫu thử có hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase với 1 mg mL-1 < IC50 < 100 mg mL-1 48 Hình 3.3 : Cấu trúc các chất cô lập được từ thân cây Ngũ Linh Chỉ 52 Hình 3.4 : Cấu trúc của hợp chất 1 53 Hình 3.5 : Tương quan HMBC ( ) và COSY ( ) của hợp chất 1 54 Hình 3.6 : Cấu trúc của hợp chất ... NHIấN Lấ TH NGC HNH NGHIấN CU HOT TNH C CH ENZYM -GLUCOSIDASE CA MT S CY THUC AN GIANG V THNH PHN CC HOT CHT CA THN CY NG LINH CH Embelia ribes Burm. f Chuyờn ngnh: HểA PHN TCH Mó s: 60 44 29 LUN... a-GLUCOSIDASE CA MT S CY THUC AN GIANG 44 1.1 Kt qu iu ch cao thụ ca mt s cõy thuc An Giang 44 1.2 Kt qu th hot tớnh c ch enzym a-glucosidase ca mt s cõy thuc An Giang 45 KHO ST THNH... tờn khoa hc l Embelia ribes Burm f. , thuc h én nem (Myrsinaceae) Ngoi ra, cõy Ng Linh Ch cũn cú mt s tờn gi khỏc nh: cõy thựn mn (tờn Phỳ Th), cõy chua meo (tờn Lng Giang, Bc Giang) , cõy phi