Nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym α glucosidase của một số cây thuốc ở an giang và thành phần các hoạt chất của thân cây núc nác oroxylum indicum (l ) kurz

Ketnooi.com vì sự nghiệp giáo dục

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

HUỲNH NGỌC NGHIÊM THỤY

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC Ở

α-AN GIα-ANG VÀ THÀNH PHẦN CÁC HOẠT

CHẤT CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC

Oroxylum indicum (L.) Kurz

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 62 44 29 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.Nguyễn Thị Thanh Mai

Thành phố Hồ Chí Minh-2011

Lời cảm ơn

Xin chân thành tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

Tiến sĩ Nguyễn Thị Thanh Mai, người cô đã

định hướng, truyền thụ những kinh nghiệm quý báocho tôi, người đã tạo những điều kiện thuận lợi nhấtgiúp tôi hoàn thành luận văn này.

Cán bộ Nguyễn Xuân Hải, người luôn nhiệt

tình giúp đỡ tôi trong lúc thực nghiệm, giải đoán cấutrúc cũng như trình bày khóa luận.

Cán bộ Đặng Hoàng Phú, người đã hỗ trợ tôi

rất nhiều khi thực nghiệm.Cảm ơn gia đình đã luôn ở bên cạnh, động viên,chia sẻ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho con thựchiện đề tài.

Thành phố Hồ Chí Minh 9-2011.

Ketnooi.com vì sự nghiệp giáo dục

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ MỞ ĐẦU

TỔNG QUAN

1.BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 1

1.1 Khái niệm 1

1.2 Phân loại 1

1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 1 1

1.2.2 Bệnh đái tháo đường loại 2 1

-

6-2.3.3.4 Uc chS h6n tp 18

2.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 20

2.3.5 Ảnh hưởng của pH 20

2.4 Giới thiệu về enzym α-glucosidase 21

2.5.Tác nhân ức chế enzym α-glucosidase 22

2.5.1 Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase từ tổng hợp

222.5.2 Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên

253.1 Tên gọi 30

2.1 Điều chế cao thô 44

2.1.1 Nguyên liệu 44

2.1.2.Ly trích 49

2.2 Thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 49

2.2.1 Nguyên tắc 49

2.2.2.Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 51

2.2.3.Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym α-glucosidase 53

3.2.1.Cô lập chất từ phân đoạn A 60

3.2.2.Cô lập chất từ phân đoạn B 61

3.2.3.Cô lập chất từ phân đoạn C và D 61

KẾT QUẢ1 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA 40CÂY THUỐC AN GIANG 65

1.1 Kết quả điều chế cao thô 65

1.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 40 mẫu cây 662 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN CÁC HOẠT CHẤT ỨC CHẾ ENZYM α-GLUCOSIDASE CỦA THÂN CÂY NÚC NÁC 69

2.1 Cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất 69

2.2 Biện luận cấu trúc các hợp chất 72

2.2.1 Hợp chất (1) 72

2.2.2 Hợp chất (2) 74

2.3 Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất cô lập được 98

2.4 Nghiên cứu động học ức chế enzym α-glucosidase của oroxylosid 99

2.4.1 Khảo sát thời gian phản ứng 99

2.4.2 Khảo sát nồng độ chất nền 100

2.4.3 Xác định kiểu ức chế 101

2.4.4 Xác định Ki 103

KẾT LUẬNTÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tóm tắt ảnh hưởng của kiểu ức chế lên Vmax và Km 20

Bảng 1.2: Sự phân loại khoa học của cây núc nác 30

Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài 45

Bảng 2.2: Thể tích các hóa chất trong quy trình thử hoạt tính 52

Bảng 2.3: Thể tích các dung dịch khảo sát nồng độ chất nền 55

Bảng 2.4: Tóm tắt dạng đồ thị các kiểu ức chế 55

Bảng 2.5: Thể tích các dung dịch nghiên cứu động học 57

Bảng 2.6: Tóm tắt cách xác định Ki các kiểu ức chế 57

Bảng 3.1: Bảng hiệu suất cao trích được của các mẫu cây thuốc nghiên cứu 65

Bảng 3.2: Kết quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương 66

Bảng 3.3: Kết quả thử hoạt tính của 40 mẫu cây thuốc An Giang 66

Bảng 3.4: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn thô 69

Bảng 3.5: Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các cao phân đoạn thu được từ cao EtOAc 70

Bảng 3.6: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tươngquan HMBC của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d1 73

Bảng 3.7: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (1) trong dung môi cloroform-d1 và hợp chất oroxylin A trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 74

Bảng 3.8: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tươngquan HMBC của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 76

Bảng 3.9: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (2) trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 và hợp chất oroxylosid trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 76

Bảng 3.10: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tươngquan HMBC của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d6 78

Bảng 3.11: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (3) trong dung môi aceton-d6 và hợp chất hispidulin trong dung môi metanol-d4 79

Bảng 3.12: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (4) trong dung môi

aceton-d6 và hợp chất apigenin trong dung môi aceton-d6 81Bảng 3.13: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương

quan HMBC của hợp chất (5) trong dung môi aceton-d6 83Bảng 3.14: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (5) trong dung môi

aceton-d6 và hợp chất ficusal trong dung môi aceton-d6 84Bảng 3.15: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương

quan HMBC của hợp chất (6) trong dung môi aceton-d6 86Bảng 3.16: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (6) trong dung môi

aceton-d6 và hợp chất balanophonin trong dung môi cloroform-d1 86Bảng 3.17: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương

quan HMBC của hợp chất (7) trong dung môi aceton-d6 89Bảng 3.18: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (7) trong dung môi

aceton-d6 và hợp chất 2-(1-hydroxymetyletyl)-4H,9H-naphto[2,3-b]furan-4,9-dion trong dung môi cloroform-d1 89Bảng 3.19: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (8) trong dung môi

dimetyl sulfoxid-d6 và hợp chất acid salicylic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 91Bảng 3.20: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (9) trong dung môi

aceton-d6 và hợp chất acid p-hydroxybenzoic trong dung môi aceton-d6 92Bảng 3.21: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (10) trong dung môi

metanol-d4 và hợp chất acid protocatechuic trong dung môi dimetyl sulfoxid-d6 93Bảng 3.22: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (11) trong dung môi

cloroform-d1 và hợp chất isovanillin trong dung môi cloroform-d1 95Bảng 3.23: Bảng số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz) và tương

quan HMBC của hợp chất (12) trong dung môi aceton-d6 97Bảng 3.24: Bảng so sánh phổ 1H-NMR, 13C-NMR của hợp chất (12) trong dung môi

aceton-d6 và hợp chất β-hydroxypropiovanillon trong dung môi cloroform-d1 98

Bảng 3.25: Bảng kết quả hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của 10 hợp chất cô

lập từ ruột thân cây núc nác 98

Bảng 3.26: Kết quả đo mật độ quang theo thời gian khảo sát 99Bảng 3.27: Thể tích các dung dịch nền và giá trị mật độ quang đo được tương ứng

100

Bảng 3.28: Kết quả mật độ quang theo sự thay đổi nồng độ chất nền và chất ức chế 101Bảng 3.39: Bảng xử lý số liệu mẫu control và mẫu ức chế 102Bảng 3.30: Giá trị Kht/Vht ứng với các nồng độ ức chế khác nhau 103

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Phân loại bệnh tiếu đường 2Hình 1.2: Sự phụ thuộc của vận tốc phản ứng vào [E] 9Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất nền 11Hình 1.4: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk 11Hình 1.5: Kiểu ức chế cạnh tranh 12Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế cạnh tranh 13Hình 1.7: Đồ thị biểu diễn Kct theo [I] khi có chất ức chế cạnh tranh để xác định Ki

14Hình 1.8: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh 14Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver- Burk khi có ức chế kháng cạnh tranh 15Hình 1.10: Đồ thị biểu diễn 1/Vkct và 1/Kkct theo [I] khi có chất ức chế kháng cạnh tranh để xác định Ki 16Hình 1.11: Kiểu ức chế không cạnh tranh 16Hình 1.12: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo

Lineweaver-Burk khi có ức chế không cạnh tranh 17Hình 1.13: Đồ thị biểu diễn 1/Vkoct theo [I] khi có chất ức chế không cạnh tranh để xác định Ki 18Hình 1.14: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo

Lineweaver-Burk khi có ức chế hỗn tạp 19Hình 1.15: Đồ thị biểu diễn Kht/Vht theo [I] khi có chất ức chế hỗn tạp để xác địnhKi 19

Hình 1.16: Hợp chất disaccarit ức chế enzym α-glucosidase 22Hình 1.17: Các hợp chất iminosugar ức chế enzym α-glucosidase 23

Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym α-

glucosidase 24

Hình 1.19: Các hợp chất thiosugar ức chế enzym α-glucosidase 24

Hình 1.20: Các hợp chất không có liên kết glycosidic ức chế enzym α-glucosidase 25

Hình 2.1: Cấu trúc của acarbose 52

Hình 2.2: Cấu trúc của acid tannic 52

Hình 2.3: Đường biểu diễn phương trình Lineweaver-Burk 54

Hình 3.1: Cấu trúc các hợp chất cô lập được từ thân cây núc nác 71

Hình 3.2: Cấu trúc của hợp chất (1) 72

Hình 3.3: Tương quan HMBC và COSY của hợp chất (1) 73

Hình 3.4: Cấu trúc của hợp chất (2) 74

Hình 3.5: Nhóm đường glucuronid của hợp chất (2) 75

Hình 3.6: Tương quan HMBC của hợp chất (2) 75

Hình 3.21: Một số tương quan HMBC của hợp chất (12) 97

Hình 3.22: Đồ thị biểu diễn mật độ quang theo thời gian 100

Hình 3.23: Đồ thị biểu diễn mật độ quang theo nồng độ chất nền .101

Hình 3.24: Đồ thị biểu diễn 1/V0 theo 1/[S] với các nồng độ ức chế khác nhau 102

Hình 3.25: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của Kht/Vht vào nồng độ chất ức chế 103

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền 9

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể 21

Sơ đồ 2.1: Sơ đồ điều chế cao thô 49

Sơ đồ 2.2: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase 51

Sơ đồ 2.3: Quy trình khảo sát thời gian phản ứng 54

Sơ đồ 2.4: Quy trình ly trích cao từ thân cây núc nác 59

Sơ đồ 2.5: Quy trình cô lập chất từ phân đoạn A 62

Sơ đồ 2.6: Quy trình cô lập chất từ phân đoạn B 63

Sơ đồ 3.1: Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase các cây thuốc có IC50 50-100 μMmL-1 68

MỞ ĐẦU

Bệnh đái tháo đường với các biến chứng nguy hiểm như bệnh tim mạch, taibiến mạch máu não, mù lòa, suy thận, đoạn chi đã trở thành nguyên nhân gây tửvong thứ tư ở các nước đang phát triển Trên thế giới cứ mỗi 10 giây đồng hồ lại cómột người chết vì những biến chứng của bệnh đái tháo đường cũng như có haitrường hợp mới được chẩn đoán Vì vậy, việc nghiên cứu các phương pháp điều trịbệnh đái tháo đường đang được các nhà khoa học quan tâm

Trong các hướng điều trị bệnh đái tháo đường loại 2, hướng điều trị bằng

cách ức chế hoạt động của enzym α-glucosidase hiện đang được các nhà nghiên cứu

quan tâm vì có cơ chế đơn giản, an toàn Tuy nhiên, những loại thuốc ức chế enzym

α-glucosidase đang sử dụng vẫn có nhiều tác dụng phụ, nên nhằm hạn chế những

tác dụng phụ và đưa thêm nhiều lựa chọn cho việc điều trị bệnh đái tháo đường, cần

phải nghiên cứu thêm các chất ức chế enzym α-glucosidase mới từ nhiều nguồn

khác nhau

Các nhà khoa học trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt

tính ức chế enzym α-glucosidase, cũng như cô lập được nhiều hợp chất thiên nhiên

có hoạt tính ức chế mạnh Trong khi đó, Việt Nam có nguồn cây thuốc dồi dào, phong phú, và trong dân gian ta từ lâu đã lưu truyền nhiều bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường bằng cây cỏ, thế nhưng chỉ có một vài nghiên cứu về vấn đề này Tại sao ta không tìm hiểu xem trong nguồn cây thuốc ấy, liệu có cây thuốc nào có hoạt

tính ức chế enzym α-glucosidase? Từ đó có thể cô lập được những hợp chất mới có

khả năng điều trị bệnh đái tháo đường từ thiên nhiên, đóng góp cho sự phát triển của ngành hóa dược nước ta

TỔNG QUAN

Những người mắc bệnh không những có lượng đường trong máu cao, mà cảtrong nước tiểu nữa Chính vì thế mà bệnh đái tháo đường có tên gọi chuyên môn làDiabetes mellitus, theo tiếng Hy Lạp có nghĩa là mật ong.

1.2 Phân loại [5]

Một cách tổng quát, bệnh đái tháo đường được chia làm 2 loại chính: loại 1và loại 2

1.2.1 Bệnh đái tháo đường loại 1

Bệnh đái tháo đường loại 1 thường xảy ra ở trẻ em từ 10 tuổi trở lên vàchiếm 10% trong số các trường hợp bị bệnh Nguyên nhân là do cơ thể không sảnxuất được insulin vì hệ thống miễn dịch của cơ thể nhầm lẫn đã tấn công vào các tếbào của tuyến tụy làm cho tuyến tụy không sản xuất ra insulin Khi không cóinsulin, tế bào sẽ không chuyển hóa được glucose làm cho lượng glucose trong máutăng cao

1.2.2 Bệnh đái tháo đường loại 2

Bệnh thường xảy ra ở người trên 50 tuổi, chiếm khoảng gần 90 % trong tổngsố trường hợp bị đái tháo đường Đối với những người bị đái tháo đường loại 2, mặcdù cơ thể vẫn sản xuất được insulin nhưng các tế bào không hoặc kém nhạy cảm vớisự có mặt của insulin Lượng đường trong máu do không được chuyển hóa thànhnăng lượng nên giữ ở mức cao Khi đó, cơ thể phản ứng bằng cách tăng sản xuất

2

-insulin lên và gây quá tải cho tuyến tụy Theo thời gian, lượng -insulin được tiết ra dần dần giảm

Hình 1.1: Phân loại bệnh tiểu đường

Bệnh đái tháo đường loại 2 còn có nguyên nhân tiềm ẩn trong cấu tạo gen,điều này làm cho bệnh phát triển nhanh hơn Nếu những người mang gen tiềm ẩnđược phát hiện sớm và có biện pháp phòng ngừa bằng cách ăn uống hợp lí thì bệnhcó thể không xuất hiện hoặc phát triển chậm, nhưng bệnh vẫn giữ ở dạng tiềm ẩn.Trong trường hợp ngược lại, bệnh sẽ phát triển rất nhanh

Ngoài ra, còn một vài trường hợp bệnh đái tháo đường khác như đái tháođường đôi và đái tháo đường thai kì

Đái tháo đường đôi: Bệnh nhân có cả đặc điểm của đái tháo đường loại 1 và

loại 2 Phần lớn bệnh nhân khi mới được chẩn đoán có những biểu hiện giống nhưđái tháo đường loại 2 nhưng trong vòng vài năm sau bệnh nhân cần insulin để kiểmsoát đường huyết Các chuyên gia cho rằng đái tháo đường đôi là dạng diễn tiếnchậm của đái tháo đường loại 1

3

-Đái tháo đường thai kì: Đây là dạng đái tháo đường xảy ra ở một số phụ nữ

mang thai và sẽ biến mất sau khi sinh Phụ nữ mắc bệnh đái tháo đường thai kì cónhiều khả năng phát triển thành đái tháo đường loại 2

1.3 Tác hại [5]

1.3.1 Các biến chứng cấp tính

Một số biến chứng cấp tính có thể xảy ra khi đường huyết quá cao hay quáthấp, nếu không được điều trị sớm sẽ đe dọa đến tính mạng của nạn nhân Các biếnchứng này bao gồm các loại sau:

Hạ đường huyết (hypoglycemia): bệnh nhân tiêm insulin sẽ gặp hiện

tượng đường huyết hạ thấp quá mức do lượng insulin cần thiết cho cơ thể quá cao.Hạ đường huyết có thể được điều trị nhanh chóng bằng cách nạp đường vào cơ thể,ngược lại có thể dẫn tới ngất xỉu

Tăng lượng ceton trong máu: trong quá trình thủy phân chất béo sẽ tạo

ra sản phẩm phụ là ceton Cơ thể không thể tích trữ lượng ceton quá lớn nên sẽ tìmcách thải chúng ra ngoài qua nước tiểu Khi quá nhiều ceton được tạo ra thì cơ thểkhông thể thải hết tất cả qua nước tiểu mà tích tụ trong máu gây tăng lượng cetontrong máu Đây là biến chứng rất nghiêm trọng do thiếu hormon insulin và chủ yếuxuất hiện ở bệnh nhân bị tiểu đường loại 1

Tăng áp lực thẩm thấu: bệnh nhân đái tháo đường không được điều trị

sẽ mất rất nhiều dịch do đi tiểu nhiều, gây ra tình trạng cô đặc máu làm áp lực thẩmthấu trong máu tăng cao Biến chứng này thường gặp ở bệnh nhân đái tháo đườngloại 2 và có thể gây tử vong nếu không được điều trị

Tăng acid lactic trong máu: là do sự tích tụ acid lactic trong cơ thể,nếu

có quá nhiều acid lactic trong cơ thể thì độ cân bằng sẽ bị phá vỡ Biến chứng nàyrất hiếm gặp và chủ yếu xuất hiện ở bệnh nhân bị tiểu đường loại 2

4

-1.3.2 Các biến chứng mãn tính

Tăng đường huyết lâu dài sẽ đưa đến những biến chứng sau:

Bệnh võng mạc (retinopathy): biến chứng quan trọng nhất về mắt

với bệnh nhân đái tháo đường là bệnh võng mạc, có thể dẫn đến mù lòa Đây lànguyên nhân chính của các bệnh mù không bẩm sinh Ngoài ra, điều này có thể dẫnđến một số bệnh về mắt khác như cườm, liệt cơ vận nhãn

Bệnh thận (nephropathy): biến chứng thận có thể dẫn đến khi mắc

bệnh tiểu đường là suy thận mãn tính Bệnh nhân phải thường xuyên chạy thận nhântạo Đây là nguyên nhân giải thích vì sao người mắc bệnh đái tháo đường thườngchiếm đa số trong những trường hợp lọc thận nhân tạo

Bệnh thần kinh (neuropathy): Biến chứng thần kinh ngoại biên có thể

gặp phải với bệnh nhân đái tháo đường là tê và đau bàn tay, bàn chân, đôi khi làmchân mất cảm giác Điều này có thể dẫn đến bệnh nhân không hề biết khi bị thươngtổn, từ đó gây nên nhiễm trùng nghiêm trọng và giảm sức đề kháng Đây là nguyênnhân mà những người mắc bệnh tháo đường thường bị nhiễm trùng và lâu lành Kếthợp với hai biến chứng trên là tắc nghẽn mạch máu ngoại biên ở tay chân dẫn đếntay chân bị hoại tử phải cắt bỏ chi

Bệnh tim mạch (cardiovascular diseases): nguy cơ mắc bệnh tim

của những người bị bệnh tiểu đường cao hơn gấp 2 đến 4 lần người thường Đây lànguyên nhân chủ yếu gây tàn tật và tử vong ở người bệnh đái tháo đường loại 2 ởcác nước công nghiệp hóa

1.4 Phương pháp điều trị [5] [36]Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 1: với những người mắc bệnhđái tháo đường loại 1, họ sẽ phải tiêm insulin thường xuyên trong cả cuộc đời vì cơ

thể họ không có khả năng tạo ra hormon này Insulin có nhiều loại nhưng nằm trong

5

-hai dạng chính tùy theo tác dụng nhanh hay chậm: dạng tác dụng nhanh dùng ngaytrước bữa ăn để tăng lượng insulin trong cơ thể phù hợp với lượng carbohydrat sắpnhập vào, dạng tác dụng chậm dùng vào buổi tối để giữ lượng đường trong máukhông tăng vọt trong nhiều giờ vào hôm sau

Hiện nay, việc uống insulin dạng viên là không thể vì insulin trong môitrường dạ dày sẽ bị phân hủy Do đó, các nhà khoa học đang nghiên cứu bọc insulintrong một vỏ nang thích hợp để thuốc có thể qua được dạ dày, giải phóng ra trongruột non và ngấm vào máu Thời gian gần đây, ta thấy xuất hiện insulin dưới dạngbột, nó được đưa vào máu bằng đường phổi Qua nhiều năm nghiên cứu, người taphát hiện được dạng thuốc bột này có hiệu quả rất cao

Phương pháp điều trị đái tháo đường loại 2: phụ thuộc vào tình trạng của

bệnh nhân, phương pháp chữa trị gắn liền với việc ăn uống thích hợp, tăng cườnghoạt động Chỉ bệnh nhân đái tháo đường loại 2 mới dùng thuốc uống kết hợp vớinhững chất đặc hiệu nhằm làm giảm lượng đường huyết Bệnh nhân có thể dùngriêng thuốc viên hoặc kết hợp với phương pháp tiêm insulin

Thuốc sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường loại 2 chủ yếu chia 3 nhóm: Nhóm thuốc thúc tụy tạng tiết thêm insulin như nhóm sulfonylurea:glyburide (Micronase, DiaBeta, Glynase), glipizide (Glucotrol, Glucotrol XL),glimepiride (Amaryl); và nhóm meglitinide: repaglinide (Pradin)

 Nhóm thuốc giúp insulin hoạt động hữu hiệu hơn như nhómbiguanide: metformin (Glucophage, Glucophage XR, Metformin XR); nhómthiazolidinedione: glitazone, rosiglitazone (Avandia), pioglitazone (Actos)

 Nhóm ngăn ruột bớt hấp thu chất đường khi ăn bằng chất ức chế

enzym α-glucosidase: acarbose (Precose, Glucobay), miglitol (Glyset).Phương pháp ức chế enzym α-glucosidase trong điều trị đái tháo đường loại

2 được ưu tiên sử dụng vì cơ chế đơn giản, an toàn, chỉ xảy ra trong bộ phận tiêu

6

-hóa chứ không tham gia vào quá trình chuyển -hóa đường hay cải thiện chức năng của insulin cũng như kích thích sự sản sinh insulin … như các phương pháp khác

2 ENZYM α-GLUCOSIDASE

2.1 Sơ lược về enzym [2]

Enzym là chất xúc tác sinh học có thành phần cơ bản là protein và có trongmọi tế bào sinh vật Trong cuộc sống, nhờ có enzym mà xảy ra rất nhiều phản ứnghóa học với một hiệu suất rất cao mặc dù ở điều kiện bình thường về nhiệt độ, ápsuất, pH

Như vậy, enzym là một loại protein xúc tác các phản ứng hóa học Trong cácphản ứng này, các phân tử lúc bắt đầu của quá trình được gọi là chất nền, enzym sẽbiến đổi chúng thành các phân tử khác nhau Tất cả các quá trình trong tế bào đềucần enzym Enzym có tính chọn lọc rất cao đối với chất nền của nó Hầu hết phảnứng được xúc tác bởi enzym đều có tốc độ cao hơn nhiều so với khi không đượcxúc tác Có trên 4000 phản ứng sinh hóa được xúc tác bởi enzym

Hoạt tính của enzym chịu tác động bởi nhiều yếu tố Tác nhân ức chế là cácphân tử làm giảm hoạt tính của enzym, trong khi yếu tố hoạt hóa là những phân tửlàm tăng hoạt tính của enzym

2.2 Chất ức chế enzym [2]

Chất ức chế enzym là những chất làm giảm tốc độ phản ứng do enzym xúctác Hoạt động của một enzym có thể giết chết một mầm bệnh hoặc điều chỉnh lạisự không cân bằng trong chuyển hóa Có nhiều loại thuốc ức chế enzym, chúngcũng được sử dụng như là chất diệt cỏ và thuốc trừ sâu Không phải tất cả các phântử liên kết với enzym đều là chất ức chế enzym, những chất hoạt hóa liên kết vớicác enzym và làm tăng hoạt tính enzym mà chúng liên kết

7

-Sự liên kết của một chất ức chế có thể ngăn chặn một chất nền đi vào tâmhoạt động của enzym và gây trở ngại cho các phản ứng xúc tác của enzym đó Chấtức chế có thể liên kết với enzym thuận nghịch hoặc không thuận nghịch Chất ứcchế không thuận nghịch thường phản ứng với enzym và thay đổi nó về mặt hóa học.Những chất ức chế đó làm thay đổi dư lượng các acid amin quan trọng cần thiết chohoạt động của enzym Ngược lại, chất ức chế thuận nghịch liên kết không đồng hóatrị và theo những kiểu khác nhau tùy thuộc vào liên kết chất ức chế-enzym, phứcenzym-chất nền, hoặc cả hai

Chất ức chế thuận nghịch liên kết với enzym bằng các tương tác không đồnghóa trị chẳng hạn như liên kết hydrogen, tương tác kị nước và liên kết ion Nhiềuliên kết yếu giữa các chất ức chế và tâm hoạt tính mạnh mẽ và đặc biệt Ngược lại,đối với các chất nền và chất ức chế không thuận nghịch, các chất ức chế thuậnnghịch thường không trải qua phản ứng hóa học khi liên kết với enzym và có thể dễdàng loại bỏ bằng cách pha loãng hoặc thẩm tách

Có 4 kiểu của ức chế enzym thuận nghịch, chúng được phân chia dựa theotác động của sự thay đổi nồng độ chất nền của enzym trên chất ức chế:

 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition): chất nền và chất ức chếkhông liên kết với enzym cùng một lúc Điều này có thể là do chất ức chế cóái lực với tâm hoạt động của một loại enzym nên xảy ra sự cạnh tranh giữachất nền và chất ức chế cạnh tranh vào tâm hoạt động của enzym Đây là loạiức chế có thể được khắc phục bằng nồng độ đủ cao của chất nền bởi vì nhữngchất ức chế cạnh tranh thường có cấu trúc tương tự như cấu trúc của chất nềnthật

 Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition): chất ức chế chỉchỉ kết hợp với phức enzym-chất nền mà không kết hợp với enzym tự do.Đây là một dạng ức chế mà các liên kết của chất ức chế với enzym làm giảm

 Ức chế hỗn tạp (mixed inhibition): là chất ức chế không những liênkết với enzym tự do mà còn liên kết với cả phức hợp enzym-chất nền tạothành phức hợp enzym-chất ức chế-chất nền nên không tạo được sản phẩm.Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế Tốc độ ức chế cựcđại đo được khi không có chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế.

2.3 Động học phản ứng xúc tác của enzym [2]

Phản ứng do enzym xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzym, bản chất và nồng độ các chất phản ứng (chất nền), nhiệt độ, pH của môi trường, các ion kim loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác, Điều đáng lưu ý là các yếu tố hóa lý không chỉ ảnh hưởng đến phản ứng enzym theo kiểu giống như các phản ứng hóa học thông thường mà còn ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng thông qua tác dụng của chúng đối với cấu trúc phân tử enzym

2.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzym

Trong điều kiện dư thừa chất nền, nghĩa là [S] >> [E] thì tốc độ phản ứng phụ thuộc vào [E], v = K[E] có dạng y = ax Nhờ đó người ta đã đo [E] bằng cách đo vận tốc phản ứng do enzym đó xúc tác

Có nhiều trường hợp trong môi trường có chứa chất ức chế hay hoạt hóa thì vận tốc phản ứng do enzym xúc tác không phụ thuộc tuyến tính với [E] đó

Sơ đồ 1.1: Sơ đồ phản ứng xúc tác enzym trường hợp có 1 chất nền

Phức ES gọi là phức Michaelis- Menten.Gọi v1 là vận tốc của phản ứng tạo thành phức chất ES.Gọi v-1 là vận tốc của phản ứng phân ly phức chất ES tạo thành E và S Gọi v2 là vận tốc của phản ứng tạo thành E và P (sản phẩm)

v1 = k1[E][S]v-1 = k-1[ES]v2 = k2[ES]Khi hệ thống đạt trạng thái cân bằng ta có:

k-1[ES] + k2[ES] = k1[E][S] (1)(k-1+k2)[ES] = k1[E][S] (2)

o

10

-Gọi Eo là nồng độ enzym ban đầu, [E] là nồng độ enzym tự do:

[Eo] = [E] + [ES] => [E] = [Eo] - [ES] (3)Thay trị số [E] từ (3) vào (2) ta có:

(k-1 + k2)[ES] = k1([Eo] - [ES])[S]Nếu đặt Km= k 1Ệ k 2

(K : gọi là hằng số Michalis Menten) thì:

Thay [ES] bằng giá trị ở trên ta thu được:

V  k 2 [ Eo ][ S ]

K m  [S ] (4)Qua đây ta thấy nồng độ enzym càng cao thì vận tốc phản ứng enzym càng lớn Vận tốc đạt cực đại khi toàn bộ enzym liên kết với chất nền, nghĩa là:

Vmax= k2[Eo] (5)(với Vmax là vận tốc phản ứng cực đại khi toàn bộ khi toàn bộ E kết hợp vớiS tạo thành phức ES)

Thay (5) vào phương trình (4) ta được:

Vo  Vmax

K[S ]

m  [S ] (*)Phương trình (*) gọi là phương trình Michaelis Menten.Km là hằng số Michaelis đặc trưng cho mỗi enzym, đặc trưng cho cho ái lực của enzym với chất nền, Km càng nhỏ thì ái lực của chất nền với enzym càng lớn, tốc độ phản ứng càng cao vì vận tốc cực đại Vmax đạt ở giá trị nồng độ chất nền càng thấp

Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis là ở chỗ nó chính là giá trị của nồng độ chất nền khi tốc độ phản ứng bằng ½ tốc độ tối đa Thay Vmax và Vo bằng các

con số tương ứng 1 và 0,5 vào phương trình trên, ta sẽ thấy rõ điều đó Như vậy, Km được đo bằng đơn vị nồng độ, tức mol/l.

Trên cơ sở phương trình Michaelis-Menten, bằng cách xây dựng đường biểudiễn sự phụ thuộc của vo vào [S] và bằng đồ thị đó xác định tốc độ tối đa Vmax ta có thể tìm thấy giá trị của [S], ở đó Vo = Vmax/2, tức giá trị của Km (Hình 1.3)

Hình 1.3: Biến thiên vận tốc phản ứng theo nồng độ chất nền

Khi tăng [S] thì vận tốc phản ứng v tăng, tăng [S] đến một giá trị nào đó thì vđạt đến giá trị Vmax và sẽ không tăng nữa nếu ta vẫn tiếp tục tăng [S] Khi Km = [S] thì Vo = 1/2 Vmax

Năm 1934, Lineweaver và Burk, trên cơ sở của phương trình (5) đã nghịchđảo để biến thành dạng đường thẳng y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việcnghiên cứu ức hãm enzym Phương trình (*) sẽ trở thành:

1  K m

Hình 1.4: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaver-Burk

2.3.3 Ảnh hưởng của chất ức chế

Chất ức chế là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzym không cònkhả năng xúc tác biến chất nền thành sản phẩm

2.3.3.1 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition)

Trong trường hợp ức chế cạnh tranh, chất nền và chất ức chế cạnh tranh nhau để tác dụng lên trung tâm hoạt động của enzym

VoVmax [S ]1  V1max (7)Với Kct là hằng số cân bằng của kiểu ức chế cạnh tranh.Dựa vào phương trình (7) ta thấy: nếu nồng độ chất nền dư thừa, nồng độ chất ức chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế, còn nồng độ chất nền thấp và nồng độ chất ức chế cao thì lại có tác dụng ức chế hoàn toàn

Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo Lineweaverr- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh

Hình 1.6: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo

Lineweaver-Burk khi có ức chế cạnh tranh

Kiểu ức chế này cho thấy đường thẳng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax

Người ta thấy ức chế như vậy phần lớn giữa chất ức chế và chất nền có sựtương đồng về mặt hóa học Ví dụ: acid malic có cấu trúc gần giống với acid succinic nên ức chế cạnh tranh enzym succinatdehydrogenase, là enzym xúc tác cho sự biến đổi acid succinic thành acid fumaric

Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm Trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzym và choán vị trí hoạt động ở phân tử enzym

Xác định Ki của kiểu ức chế cạnh tranh

Đối với kiểu ức chế cạnh tranh, ta có: K ct K

m

[1  [I ]] hay:

KK ct  K m

Hình 1.7: Đồ thị biểu diễn Kct theo [I] khi có chất ức chế cạnh tranh để xác định Ki.

2.3.3.2 Ức chế kháng cạnh tranh (uncompetitive inhibition)

Đặc trưng của kiểu ức chế này là chất ức chế chỉ liên kết với phức hợp ES, mà không liên kết với enzym tự do

Vkct là vận tốc phản ứng khảo sát của phương trình

Trong trường hợp này ta thấy khi E kết hợp với S làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzym và tạo trung tâm kết hợp với I, do đó không thể loạibỏ tác dụng ức chế bằng cách tăng nồng độ chất nền.

Hình 1.9: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo

Lineweaver-Burk khi có ức chế kháng cạnh tranh

Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng có độ nghiêng bằng nhau, songsong với nhau không hội tụ tại một điểm

Xác định Ki kiểu ức chế kháng cạnh tranh

Ta có Vkct  V ;

1  [I ]

K iK kct

a) b)

Hình 1.10: Đồ thị biểu diễn 1/Vkct (a) và 1/Kkct (b) theo [I] khi có chất ức chế kháng

cạnh tranh để xác định Ki

2.3.3.3 Ức chế không cạnh tranh (noncompetitive inhibitor)

Ức chế không cạnh tranh là kiểu ức chế mà enzym có thể kết hợp với hoặcchất ức chế, hoặc chất nền, hoặc cả hai

Hình 1.11: Kiểu ức chế không cạnh tranhPhương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế không cạnh tranh:

Vo  Vkoct [ S ]

(10)

K m  [ S ]

Phương trình Lineweaver-Burk khi có chất ức chế không cạnh tranh:

1  K m

VoVkoct  [S ]1  V1

koct

(11)Với Kkoct là hằng số ức chế của kiểu ức chế không cạnh tranh

Hình 1.12: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo

Lineweaver-Burk khi có ức chế không cạnh tranh

Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng càng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng hội tụ tại một điểm 1/Km nằm trên trục hoành

Xác định Ki kiểu ức chế không cạnh tranh

Phương trình Michealis-Menton cho kiểu ức chế hỗn tạp:

V o  V ht [ S ]

(12)

1  [ I ]

V

si

[I ]



si 

1 

[I ]



si 

Phương trình Lineweaver-Burk cho kiểu ức chế hỗn tạp:

1  K ht 

Lập đồ thị 1/V0 theo 1/[S] của phương trình (13), đường biểu diễn khi có chấtức chế sẽ cắt đường biểu diễn khi không có I không nằm trên trục tung cũng không nằm trên trục hoành (Hình 1.14)

Hình 1.14: Sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ chất nền theo

Lineweaver-Burk khi có ức chế hỗn tạp

Kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng càng có nồng độ chất ức chế càngcao thì có độ xiên lớn hơn và các đường thẳng cùng hội tụ tại một điểm không nằm trên trục tung

Xác định Ki của kiểu ức chế hỗn tạp

Ta có: K ht K m

1  [I ]

hay K ht



K m[ I ]  K m

Vht Vmax 

Bảng 1.1: Tóm tắt ảnh hưởng của kiểu ức chế lên Vmax và Km.

Kiểu ức chếCạnh tranhKháng cạnh tranh Hỗn tạp Không cạnh tranh

Ta có thể tăng vận tốc của một phản ứng hóa học bằng cách tăng nhiệt độcủa môi trường, hiện tượng này tuân theo định luật Vant-Hoff Điều này có nghĩa là khi tăng nhiệt độ lên 10 lần thì tốc độ phản ứng tăng lên khoảng 1,5 đến 2 lần Đối với phản ứng do enzym xúc tác cũng có thể áp dụng được quy luật này nhưng chỉ trong một phạm vi nhất định, vì bản chất enzym là protein Khi ta tăng nhiệt độ lên trên 40-50oC xảy ra quá trình phá hủy chất xúc tác Mỗi enzym có một nhiệt độ tối ưu khác nhau Sau nhiệt độ tối ưu thì tốc độ phản ứng enzym xúc tác sẽ giảm

Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm thay đổi tính chất của trung tâm liên kết chất nền và hoạt động của phân tử enzym, dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH

Đa phần các enzym bền trong khoảng 5 < pH < 9, nhiều enzym hoạt động rất mạnh ở môi trường pH trung tính và cũng có rất nhiều enzym hoạt động mạnh ở cả pH kiềm và trung tính

Bản chất hóa học của thành phần dung dịch đệm cũng ảnh hưởng đến độ bền, hoạt động xúc tác của enzym

Tóm lại, ngoài các yếu tố đã nói ở trên, còn có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng lên hoạt động xúc tác của enzym như: ánh sáng, chất hoạt hóa, sóng siêu âm, sự chiếu điện…

2.4 Giới thiệu về enzym α-glucosidase

Enzym α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase, glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D-

glucosidase, transglucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D-

glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase

(nhóm enzym xúc tác các phản ứng thủy phân)

Khi thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrat trong thức ăn được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzym trong ruột non

Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzym α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrat lớn thành oligosaccharid Enzym α-glucosidase ở màng

ruột non lại tiếp tục phân hoá các oligosaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn

nữa rồi mới thẩm thấu vào máu Bằng cách kiềm chế hoạt động của enzym α-

glucosidase có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrat và làm chậm sự thẩm thấuglucose vào mạch máu [29]

α-amylase

(Glucose + Fructose)Maltose

(Glucose + Glucose)

Glucose huyết tăng

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể

2.5 Tác nhân ức chế enzym -glucosidase

Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzym -glucosidase có ý nghĩa rất lớntrong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm… Đã có rất nhiều hợp chất được tìm

thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng ức chế enzym α-glucosidase Tuy

nhiên, những tác nhân ức chế enzym -glucosidase hiện nay thường gây nhiều phảnứng phụ Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất có khả năng ức chế enzym

-glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới.Thông thường, việc nghiên cứu các hoạt chất ức chế -glucosidase luôn bắt đầu từcác hợp chất có trong tự nhiên vì nguồn dược thảo rất phong phú, đa dạng và ít phảnứng phụ Do đó, các nhà khoa học trên thế giới thường sử dụng những phương phápsàng lọc hoạt tính ức chế enzym này để định hướng trong nghiên cứu Nhiều nướcđã công bố trên các tạp chí quốc tế về các cây thuốc có khả năng ức chế enzym -glucosidase với mục đích sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm, cũng như đã cô lậpđược nhiều hợp chất có hoạt tính ức chế enzym -glucosidase từ nguồn dược thảo

Hiện nay, các hợp chất ức chế enzym -glucosidase được chia thành cácnhóm chính sau: disacccarit, iminosugar, thiosugar, pseudoaminosugar, carbasugarvà các hợp chất không có liên kết glucosidic Dưới đây liệt kê một số hợp chất có

hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase.

Hình 1.18: Các hợp chất carbasugar và pseudoaminosugar ức chế enzym α-glucosidase

Thiosugar

Hình 1.19: Các hợp chất thiosugar ức chế enzym α-glucosidase

Hợp chất không có liên kết glycosidic