2. ENZY Ma GLUCOSIDASE
2.4.3. Carbasugar và pseudoaminosugar
Năm 1908, từ vỏ của quả nho Marsdenia condurango, Kuble đã cô lập được hợp chất conduritol A. Đây là một hợp chất có khả năng ức chế enzym α-
glucosidase. Hợp chất này cũng được tìm thấy trong cây Glymnena sylvestre, một
loài cây bụi được dùng làm thuốc trị bệnh đái tháo đường ở một số nước châu Á và Ấn Độ. OH OH OH OH Conduritol A 2.4.4. Thiosugar
Yoshikawa và các cộng sự đã cô lập được từ dịch chiết nước của rễ và thân cây Salacia reticulata Wight một hợp chất có khả năng ức chế a-glucosidase mạnh. Hoạt tính của nó cao hơn hợp chất acarbose, hợp chất thường được sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường.
Salacinol
Katalanol, một dẫn xuất của 1,2,3-trihydroxypropylsalacinol được cô lập từ cây Salacia reticulate có hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase mạnh hơn salacinol.
Kotalanol
2.4.5. Hợp chất không có liên kết glycosidic
Từ cây Streptomyces melanosporofaciens, người ta đã cô lập được hợp chất
dibutyl phtalat. Hợp chất này có khả năng ức chế enzym a-glucosidase theo kiểu ức chế không cạnh tranh.
Dibutyl phtalat
Trong quá trình chế biến tinh bột ngô, N-p-coumaroyl-N’-feruloylputrescin
đã được cô lập và nó có khả năng ức chế enzym a-glucosidase. Các nghiên cứu về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính cho thấy rằng các nhóm hydroxyl phenyl là cơ sở cho hoạt tính của chất.
N-p-coumaroyl-N’-feruloylputrescin
Baicalein được cô lập từ lá kinh giới Origanum majorana cũng là một chất ức chế enzym a-glucosidase mạnh.
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -16- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
Năm 2006, Nilubon Jong-Anurakkun và cộng sự đã cô lập được 2 hợp chất (-)-lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranosid và quercetin 3-O-β-D- xylopyranosyl(1’’®2’’)-β-D-galactopyranosid có hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase từ lá cây Alstonia scholaris.
(-)-Lyoniresinol 3a-O-β-D-glucopyranosid
O O OH HO O O OH O HO OH OH O OH HO HO HO
Quercetin 3-O-β-D-xylopyranosyl(1ʹʹʹ→ 2ʹʹ)-β-D-galactopyranosid
2.4.6. Một số chất ức chế tổng hợp
Iminosugar
NH NH HO HO OH Carbasugar và pseudoaminosugar O OH OH OH OH (1R,6S)-cyclophellitol Voglibose Valienamin Thiosugar X = NH, S X = O, S, Se, N R = H, CH2OH
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -18- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
2.5. Nguyên tắc thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase [6]
2.5.1. Nguyên tắc
Hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các mẫu nghiên cứu được xác định dựa vào phương pháp phân tích trắc quang.
Để khảo sát hoạt tính ức chế α-glucosidase, chúng tôi sử dụng p-nitrophenyl
α-D-glucopyranoside (pNPG) làm chất nền. pNPG sẽ bị α-glucosidase chuyển hóa sinh ra α-D-glucose và p-nitrophenol (PNP).
HO HO O OH OH OH O H N O2 HO HO O OH OH O O2N
p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid α-D-Glucose p-Nitrophenol
(pNPG)
Theo phản ứng, lượng glucose sinh ra tỉ lệ với PNP. Do đó, dựa vào lượng PNP sinh ra, có thể xác định được lượng glucose sinh ra. Lượng PNP sinh ra được xác định bằng cách đo độ hấp thu quang tại bước sóng 401nm. Khi mẫu có sự ức chế α-glucosidase thì hàm lượng PNP tạo thành, cũng như lượng glucose sinh ra sẽ giảm. Vì vậy, dựa trên độ hấp thu của PNP sinh ra ở 401 nm khi có và không có mẫu thử, sẽ tính được khả năng ức chế enzym α-glucosidase của mẫu khảo sát.
2.5.2. Phần trăm ức chế I%
Khả năng ức chế enzym α-glucosidase được tính dựa trên phần trăm ức chế (I%) theo công thức:
% 100 (%)= - ´ c s c A A A I Trong đó:
Ac: Giá trị mật độ quang của dung dịch không có hoạt chất (control). As: Giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu khảo sát (sample).
2.5.3. Cách xác định IC50
IC50 được định nghĩa là nồng độ của một mẫu khảo sát mà tại đó nó có thể ức chế 50 % enzym α-glucosidase. Giá trị IC50 là giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế (mạnh hay yếu) của mẫu cao hoặc hoạt chất. Như vậy, mẫu có hoạt tính ức chế càng cao thì giá trị IC50 càng thấp.
Từ giá trị I%, ta tính được giá trị IC50 theo các bước sau:
- Bước 1: Tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của mẫu ở nhiều nồng độ khác nhau. Ứng với mỗi nồng độ, ta tính được giá trị I% tương ứng với giá trị mật độ quang đo được, từ đó ta xác định được giá trị phần trăm ức chế trung bình của từng nồng độ khảo sát.
- Bước 2: Dựng đồ thị
· Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, chúng ta vẽ một đường thẳng y = ax + b qua tất cả các điểm (với y là I% và x là nồng độ).
· Với những mẫu có hoạt tính không biến thiên tuyến tính với nồng độ, một cách gần đúng, chúng ta chọn 2 nồng độ ức chế trên và dưới 50 % và cũng tiến hành vẽ đường thẳng y = ax + b. Ta sẽ thu được phương trình y = ax + b với 2 hệ số a, b đã biết.
- Bước 3: Thay y = 50 % vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x. Đó chính là nồng độ ức chế được 50 % enzym α-glucosidase (IC50).
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -20- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
3. KHÁI QUÁT VỀ CÂY NGŨ LINH CHỈ
Hình 1.2: Cây Ngũ Linh Chỉ, hoa và quả Ngũ Linh Chỉ 3.1. Danh pháp [2][3][4][16]
Cây Ngũ Linh Chỉ có tên khoa học là Embelia ribes Burm f., thuộc họ Ðơn nem (Myrsinaceae).
Ngoài ra, cây Ngũ Linh Chỉ còn có một số tên gọi khác như: cây thùn mũn (tên ở Phú Thọ), cây chua meo (tên ở Lạng Giang, Bắc Giang), cây phi tử, cây chua ngút – vốn vén, tấm cùi (Thổ), xốm mun (Thái), dây ngút,...
Tuy nhiên, cần lưu ý tên gọi chua ngút, phi tử còn dùng chỉ hạt và quả của cây
Cordia Bantamensis Blume thuộc họ Vòi voi Borraginaceae và cây Leea rubra
Blume (cây gối hạc hay còn gọi là cây kim lê, bí đại) thuộc họ Gối hạc Leeaceae,
Ở một số nước khác, Ngũ Linh Chỉ có tên là False Pepper hay False Black Pepper (tiếng Anh); Baberang, Vayvidang (tiếng Hindi);… Ở Ấn Độ, tên gọi phổ biến của Ngũ Linh Chỉ là Vidanga.
Sự phân loại khoa học
Giới Plantae Ngành Magnoliophyta Lớp Magnoliopsida Bộ Primulales Họ Myrsinaceae Chi Embelia Loài ribes 3.2. Mô tả thực vật [2][3][4][16]
Ngũ Linh Chỉ là dạng cây bụi leo cao 1 – 2 m, có thể đến 7 m hoặc hơn. Trục cụm hoa, cuống hoa, lá bắc và lá đều có lông, có khi hơi trắng. Thân màu nâu đỏ hay nâu sẫm, hơi có khía dọc. Lá mọc so le, thuôn, dài 3 – 8 cm, rộng 1,5 – 3,5 cm, hình bầu dục, có khi hơi hình trái xoan ngược, gốc tròn hoặc có góc, có mũi nhọn ngắn hay tù ở đầu, nguyên, nhẵn, cuống lá dài 5 – 10 mm, lõm ở mặt trên. Hoa nhiều, nhỏ, màu vàng lục, xếp thành chùm ở ngọn. Quả hạch hình cầu, màu đỏ sẫm, lẫn những điểm màu lơ. Vỏ quả thường nhăn nheo. Hạt đơn độc, có nội nhũ sừng, màu đỏ, để ngoài không khí lại hóa màu đen. Cây thường ra hoa vào tháng 2 – 4, có quả vào tháng 3 – 10.
Thu hái quả vào mùa thu khi chín, hái về xát vỏ, phơi khô lấy hạt, khi dùng tán nhỏ. Rễ lấy về rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô. Lá dùng tươi làm rau ăn.
Bộ phận dùng: Quả, rễ, lá, hạt.
3.3. Phân bố[3][4]
Trên thế giới: cây phân bố từ Xri Lanca, Ấn Độ, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia cho đến Indonesia. Ở Ấn Độ, cây Ngũ Linh Chỉ được tìm thấy ở
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -22- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
độ cao khoảng 1600m, từ đỉnh dãy Himalaya tới các vùng như Konkan, Deccan, Western Ghats và miền Nam Ấn Độ.
Ở nước ta, cây mọc phổ biến từ Bắc vào Nam. Thường gặp ở những nơi có nhiều ánh sáng, ven rừng hoặc trên đồi ở khắp các cao độ khác nhau.
3.4. Công dụng trong dân gian[2][3][4]
Trong dân gian, cây Ngũ Linh Chỉ là cây thuốc được sử dụng để điều trị một số căn bệnh khác nhau.
Thân cây có vị ngọt, tính mát có tác dụng bổ huyết, dùng trị ban trái, bạch đới. Ở Ấn Độ người ta dùng làm thuốc trị giun dưới dạng bột uống với sữa, sau đó uống thuốc sổ.
Lá non của cây Ngũ Linh Chỉ thường được dùng nấu canh chua và trị rắn cắn (nhai lá tươi nuốt nước rồi lấy bã đắp lên vết thương). Ngoài ra, lá của chúng có tác dụng làm dịu, làm sạch và rất hữu ích trong việc trị ghẻ ngứa, đau họng, lở miệng, các căn bệnh về da và bệnh phong cùi.
Quả có vị chua, có thể ăn được, có tác dụng giải khát, cũng thường được dùng trị giun, nhất là giun đũa, giun kim, chữa ung nhọt, viêm cuống phổi, vàng da, kích thích vị giác, trị béo phì và các chứng rối loạn về tâm thần. Nước sắc của quả khô làm thuốc hạ sốt, trị bệnh về ngực và da. Quả khô Ngũ Linh Chỉ cũng là thành phần của những chế phẩm chữa bệnh nấm da loang vòng và các bệnh ngoài da khác. Ngoài ra, quả khô cũng được dùng trị vết đốt của bò cạp và rắn cắn.
Hạt được sử dụng trong các loại thuốc kháng sinh, trị giun sán, bồi bổ, tăng chuyển hóa, kích thích tiêu hóa, chữa viêm dạ dày và có ảnh hưởng tới khả năng sinh sản. Nước hãm rễ cây dùng để trị ho và tiêu chảy.
Rễ cây có khả năng trị táo bón, chống lại sự sinh sản quá nhanh của động vật, giúp dễ tiêu hóa, nhuận tràng… Nó có khả năng chống lại các loại ký sinh trùng và vi khuẩn trong đường ruột. Nó cũng được sử dụng trong trường hợp bị rối loạn tiêu hóa, các căn bệnh ngoài da, đau đầu, bệnh trĩ, viêm phổi, béo phì, lở miệng, đau răng và đau họng.
3.5. Tính chất dược lý
3.5.1. Kháng khuẩn
Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết nước và etanol của quả Ngũ Linh Chỉ cho thấy quả Ngũ Linh Chỉ có khả năng chống lại các chủng vi khuẩn Gram dương (Bacilus subtilis, Staphylococcus aureus) và các chủng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa)với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) trong khoảng từ 1,5 đến 100 mg mL-1[15]
.
Hoạt chất embelin được cô lập từ quả Ngũ Linh Chỉ cho thấy có khả năng kháng lại các vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Ở nồng độ cao (100 µg/đĩa), embelin ức chế mạnh các vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Shigella
flexneri, S. sonnei và Pseudomonas aeruginosa [11][28].
3.5.2. Kháng viêm, làm lành vết thương
Nghiên cứu của Kumar và cộng sự cho thấy embelin được cô lập từ quả khô của Ngũ Linh Chỉ có tác dụng kháng viêm ở đại tràng. Thí nghiệm được tiến hành ở chuột bạch [17]
.
Một nghiên cứu khác của Kumar và cộng sự cũng cho thấy embelin có khả năng chống viêm trong viêm da tiếp xúc cấp tính và mãn tính [18].
Embelin được cô lập từ dịch trích etanol của lá Ngũ Linh Chỉ có khả năng làm lành các vết thương. Đây là kết quả nghiên cứu của Kumara S.H.M. và cộng sự. Việc điều trị bằng embelin trong nghiên cứu đã cho thấy có sự gia tăng liên kết ngang của các sợi collagen. Các tác dụng chữa lành vết thương đã được so sánh với thuốc mỡ da Framycetin tiêu chuẩn [19].
3.5.3. Ngừa thai
Theo một số nghiên cứu của Das (1966), Kholkute (1978), Purandare (1979), Krishnaswamy và Purushottaman (1980) thì hạt và quả Ngũ Linh Chỉ có khả năng ngừa thai khá tốt, ngăn ngừa mang thai từ 37 – 75 % [30]
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -24- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
3.5.4. Trừ giun, sán
Khảo sát hoạt tính trừ giun sán của dịch chiết etanol từ quả Ngũ Linh Chỉ cho thấy khả năng trừ giun lên đến 93 % khi so sánh với chất đối chứng là pyrantel tartrat. Thí nghiệm được thực hiện đối với ấu trùng Haemonchus contortus [13].
3.5.5. Ức chế enzym acetyl cholinesterase
Ức chế enzym acetyl cholinesterase là một cách để chữa bệnh Alzheimer. Vinutha và cộng sự đã tiến hành khảo sát hoạt tính ức chế enzym acetyl cholinesterase trên 37 cây thuốc của Ấn Độ. Kết quả cho thấy rễ và quả của Ngũ Linh Chỉ đều có hoạt tính ức chế enzym này, trong đó rễ của Ngũ Linh Chỉ có IC50 = 23,04 µg mL-1[31].
3.5.6. Ức chế enzym α-amylase
Sáu cây thuốc Ấn Độ được lựa chọn ngẫu nhiên để nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym α-amylase nhằm góp phần kiểm soát bệnh béo phì và đái tháo đường. Kết quả cho thấy hạt Ngũ Linh Chỉ cho hoạt tính ức chế tương đương với chất đối chứng dương (phần trăm ức chế của hạt Ngũ Linh Chỉ là 59,3 %; của chất đối chứng dương Phaseolus vulgaris là 59,4 %) [27]
.
3.5.7. Chữa bệnh đái tháo đường
Theo nghiên cứu của Bhandari và cộng sự, dịch chiết 90 % etanol của quả Ngũ Linh Chỉ có khả năng bảo vệ tế bào b của tuyến tụy khỏi các chất oxi hóa, từ đó có thể làm giảm bệnh đái tháo đường loại 1. Kết quả thí nghiệm được so sánh với chất chuẩn gliclazid, một loại thuốc chống lại sự tăng đường huyết [9].
Ngoài ra, khi nghiên cứu khả năng chống lại bệnh tiểu đường loại 1 ở chuột được gây ra bởi alloxan (một chất oxi hóa có khả năng phá hủy tế bào b của tuyến tụy) cũng cho thấy embelin được cô lập từ dịch chiết n–hexan của quả Ngũ Linh Chỉ có thể hạ đường huyết một cách một cách đáng kể, cải thiện chức năng thận, ức chế tổn thương gan [21]
3.5.8. Chống co giật
Nghiên cứu hoạt tính chống co giật của embelin được cô lập từ quả Ngũ Linh Chỉ cho kết quả là embelin có thể ức chế các cơn động kinh gây ra bởi sốc điện và pentylenetetrazol [22].
3.6. Các hợp chất đã được cô lập từ cây Ngũ Linh Chỉ
3.6.1. Các hợp chất được cô lập từ rễ[20]
Rễ cây Ngũ Linh Chỉ có chứa 1 số hợp chất như: N-(3-carboxypropyl)-5-
amino-2-hydroxy-3-tridecyl-1,4-benzoquinon, vilangin, sitosterol, daucosterol…
N-(3-carboxypropyl)-5-amino-2-hydroxy-3-tridecyl-1,4-benzoquinon Vilangin 3,5-dimetoxy-4-hydroxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranosid R Tên gọi Tridecyl 2,5-dihydroxyl-3-tridecyl-1,4-benzoquinon Pentadecyl 2,5-dihydroxyl-3-pentadecyl-1,4-benzoquinon Undecyl 2,5-dihydroxyl-3-undecyl-1,4-benzoquinon (Embelin)
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -26- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai 5,6-dihydroxy-7-tridecyl-3-[4-tridecyl-3-hydroxy-5-oxo-2(5H)-furylidene]-2- oxo-3(2H)-benzofuran R Tên gọi 8-pentadecenyl 5-[(8Z)-pentadecenyl]-1,3-benzendiol 8-heptadecenyl 5-[(8Z)-heptadecenyl)]-1,3-benzendiol 8,11-heptadecadienyl 5-[(8Z,11Z)heptadecadienyl]-1,3-benzenediol Pentadecyl 5-pentadecyl-1,3-benzenediol Sitosterol Daucosterol 3-metoxy-5-pentylphenol (+)-catechin
Ngoài ra, người ta đã tìm thấy 1 số hợp chất khác như (+)-lyoniresinol- 3a-O-β-glucosid, 2,6-dimetoxy-4-hydroxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranosid…
3.6.2. Các hợp chất được cô lập từ hạt[14]
Hạt cây Ngũ Linh Chỉ có chứa embeliaribyl ester, embelinol, embeliol, embelin (2,5-3,1 %), quercitol (1,0 %), chất béo (5,2 %)…
Embeliaribyl ester
Embelinol
Embeliol Embelin Quercitol
3.6.3. Các hợp chất được cô lập từ quả[15][18][19]
Quả chứa một dẫn xuất quinon là embelin, một alkaloid christembin, vilangin, tannin, tinh dầu.
Embelin
3.6.4. Các hợp chất được cô lập từ lá[19]
Thành phần quan trọng trong lá của Ngũ Linh Chỉ là embelin.
1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 1.1. Hóa chất
- Nước cất 2 lần
- Dimetyl sulfoxid (DMSO) (Trung Quốc, 98 %)
- Natri carbonat Na2CO3 (Trung Quốc, 99,8 %)
- Natri đihidrophotphat NaH2PO4.2H2O (Trung Quốc, 99 %)
- Natri hidrophotphat Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc, 99 %)
- Acid sunfuric đặc H2SO4 (Trung Quốc, 98,08 %)
- Acid tannic (Merck)
- Acarbose
- Enzym a-glucosidase từ Saccharomyces cerevisae (Sigma)
- p-Nitrophenyl-a-D-glucopyranosid (Sigma)
- Metanol (Chemsol, 99,5 %; công nghiệp sau chưng cất)
- Hexan (Chemsol)
- Aceton (Chemsol)
- Etyl acetat (Chemsol)
- Cloroform (Chemsol, 99,5 %; công nghiệp sau chưng cất)
- Silica gel pha thường (Ấn Độ; Merck; Prolabo)
- Silica gel pha đảo (Merck)
1.2. Dụng cụ
- Becher 1000 mL, 500 mL, 100 mL, 50 mL
- Bình cầu 2000 mL, 1000 mL, 500 mL, 250 mL, 100 mL
- Bình quả lê 1000 mL, 500 mL, 250 mL, 100 mL
- Phễu lọc thường, áp suất kém
- Bếp đun
- Ống nghiệm và ống nghiệm có nắp
- Đũa thủy tinh
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -29- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai - Fiol 100mL, 50 mL, 25 mL, 20 mL, 10 mL, 5mL
- Típ nhựa 2 mL, 1,5 mL
- Cuvet thủy tinh
- Bình hút ẩm
- Các dụng cụ thông thường khác như ống nhỏ giọt, hũ bi, …
1.3. Thiết bị
- Cân kỹ thuật, cân phân tích