3. KHÁI QUÁT VỀ CÂY NGŨ LINH CHỈ
3.5.8. Chống co giật
Nghiên cứu hoạt tính chống co giật của embelin được cô lập từ quả Ngũ Linh Chỉ cho kết quả là embelin có thể ức chế các cơn động kinh gây ra bởi sốc điện và pentylenetetrazol [22].
3.6. Các hợp chất đã được cô lập từ cây Ngũ Linh Chỉ
3.6.1. Các hợp chất được cô lập từ rễ[20]
Rễ cây Ngũ Linh Chỉ có chứa 1 số hợp chất như: N-(3-carboxypropyl)-5-
amino-2-hydroxy-3-tridecyl-1,4-benzoquinon, vilangin, sitosterol, daucosterol…
N-(3-carboxypropyl)-5-amino-2-hydroxy-3-tridecyl-1,4-benzoquinon Vilangin 3,5-dimetoxy-4-hydroxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranosid R Tên gọi Tridecyl 2,5-dihydroxyl-3-tridecyl-1,4-benzoquinon Pentadecyl 2,5-dihydroxyl-3-pentadecyl-1,4-benzoquinon Undecyl 2,5-dihydroxyl-3-undecyl-1,4-benzoquinon (Embelin)
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -26- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai 5,6-dihydroxy-7-tridecyl-3-[4-tridecyl-3-hydroxy-5-oxo-2(5H)-furylidene]-2- oxo-3(2H)-benzofuran R Tên gọi 8-pentadecenyl 5-[(8Z)-pentadecenyl]-1,3-benzendiol 8-heptadecenyl 5-[(8Z)-heptadecenyl)]-1,3-benzendiol 8,11-heptadecadienyl 5-[(8Z,11Z)heptadecadienyl]-1,3-benzenediol Pentadecyl 5-pentadecyl-1,3-benzenediol Sitosterol Daucosterol 3-metoxy-5-pentylphenol (+)-catechin
Ngoài ra, người ta đã tìm thấy 1 số hợp chất khác như (+)-lyoniresinol- 3a-O-β-glucosid, 2,6-dimetoxy-4-hydroxyphenyl-1-O-β-D-glucopyranosid…
3.6.2. Các hợp chất được cô lập từ hạt[14]
Hạt cây Ngũ Linh Chỉ có chứa embeliaribyl ester, embelinol, embeliol, embelin (2,5-3,1 %), quercitol (1,0 %), chất béo (5,2 %)…
Embeliaribyl ester
Embelinol
Embeliol Embelin Quercitol
3.6.3. Các hợp chất được cô lập từ quả[15][18][19]
Quả chứa một dẫn xuất quinon là embelin, một alkaloid christembin, vilangin, tannin, tinh dầu.
Embelin
3.6.4. Các hợp chất được cô lập từ lá[19]
Thành phần quan trọng trong lá của Ngũ Linh Chỉ là embelin.
1. HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ 1.1. Hóa chất
- Nước cất 2 lần
- Dimetyl sulfoxid (DMSO) (Trung Quốc, 98 %)
- Natri carbonat Na2CO3 (Trung Quốc, 99,8 %)
- Natri đihidrophotphat NaH2PO4.2H2O (Trung Quốc, 99 %)
- Natri hidrophotphat Na2HPO4.12H2O (Trung Quốc, 99 %)
- Acid sunfuric đặc H2SO4 (Trung Quốc, 98,08 %)
- Acid tannic (Merck)
- Acarbose
- Enzym a-glucosidase từ Saccharomyces cerevisae (Sigma)
- p-Nitrophenyl-a-D-glucopyranosid (Sigma)
- Metanol (Chemsol, 99,5 %; công nghiệp sau chưng cất)
- Hexan (Chemsol)
- Aceton (Chemsol)
- Etyl acetat (Chemsol)
- Cloroform (Chemsol, 99,5 %; công nghiệp sau chưng cất)
- Silica gel pha thường (Ấn Độ; Merck; Prolabo)
- Silica gel pha đảo (Merck)
1.2. Dụng cụ
- Becher 1000 mL, 500 mL, 100 mL, 50 mL
- Bình cầu 2000 mL, 1000 mL, 500 mL, 250 mL, 100 mL
- Bình quả lê 1000 mL, 500 mL, 250 mL, 100 mL
- Phễu lọc thường, áp suất kém
- Bếp đun
- Ống nghiệm và ống nghiệm có nắp
- Đũa thủy tinh
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -29- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai - Fiol 100mL, 50 mL, 25 mL, 20 mL, 10 mL, 5mL
- Típ nhựa 2 mL, 1,5 mL
- Cuvet thủy tinh
- Bình hút ẩm
- Các dụng cụ thông thường khác như ống nhỏ giọt, hũ bi, …
1.3. Thiết bị
- Cân kỹ thuật, cân phân tích
- Hệ thống đun hoàn lưu
- Hệ thống cô quay chân không
- Hệ thống đông khô chân không
- Máy siêu âm
- Bồn điều nhiệt
- Máy quang phổ (SHIMADZU UV-1800)
- Tủ sấy
- Cột sắc ký
- Bình giải li
- Đèn UV – Vis (Spectroline MODEL ENF-240C/FE, USA)
- Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Bruker Ultrashield 500 Plus)
- Máy khối phổ MS (Bruker microTOF-QII)
2. QUY TRÌNH SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYM α- GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ CÂY THUỐC AN GIANG
2.1. Chuẩn bị mẫu nguyên liệu
Với mục đích sàng lọc, tìm ra những cây thuốc có hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase trên một số cây thuốc Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thu thập các mẫu cây thuốc theo ba tiêu chí: dân gian sử dụng điều trị bệnh đái tháo đường, ung thư, kháng viêm; hoặc tài liệu công bố về hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase; hoặc lựa chọn một cách ngẫu nhiên từ các vùng miền trong cả nước và khảo sát hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của chúng. Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi tập
trung nghiên cứu 30 cây thuốc ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang (Bảng 2.1).
Những cây thuốc này được thu hái vào tháng 08 năm 2009 và vào tháng 05 năm 2011 và được định danh bởi Thạc sĩ Hoàng Việt, khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
2.2. Quy trình điều chế cao thô (Sơ đồ 2.1)
Mỗi mẫu cây thuốc được lấy ra lượng nhỏ 50 – 100 g. Các mẫu cây này được xay nhuyễn và đun hoàn lưu bằng MeOH trong bình cổ nhám. Mỗi mẫu cây được trích 3 lần và mỗi lần trích trong 3 giờ. Sau khi trích, tiến hành lọc, cô quay chân không dịch trích để loại bỏ dung môi, chúng tôi thu được cao thô và tiến hành thử hoạt tính trên enzym α-glucosidase.
Thu suất cao ly trích được tính bởi công thức:
% 100 %= ´ mau cao m m H Trong đó:
· mcao: khối lượng cao sau khi loại bỏ dung môi.
· mmau: khối lượng mẫu ban đầu.
Thu suất cao ly trích của các mẫu cây thuốc nghiên cứu trong đề tài được trình bày trong bảng 3.1 (phần kết quả và thảo luận).
Sơ đồ 2.1: Quy trình ly trích cao thô
1. Xay nhỏ
2. Trích nóng với MeOH
3. Lọc
Mẫu cây thuốc khô
Dịch trích
Cao MeOH
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -31- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
Bảng 2.1: Danh mục các cây thuốc nghiên cứu trong đề tài [2][3][4]
STT Tên thường Tên khác Tên khoa học Họ Bộ phận
ly trích Công dụng
1 Bằng lăng nước Tử vi Tàu Lagerstroemia speciosa (L). Pers.
Tử vi
(Lythraceae) Lá Chữa ỉa chảy, lở miệng.
2 Bìm bịp Cây xương khỉ, mảnh cộng Clinacanthus nutans (Burm.f.) Lindau Ô rô (Acanthaceae) Lá
Chữa đau sưng mắt, phong thấp,
thiếu máu, sưng khớp.
3 Cà dăm Chò nhai, râm,
ram
Anogeissus acuminata
(Roxb. ex DC.) Guill. et Perr.
Bàng
(Combretaceae) Thân Chữa bán thân bất toại.
4 Cát căng nam Sắn dây, sắn cơm Pueraria thomsoni
Benth.
Đậu
(Fabaceae) Toàn cây Chữa cảm mạo, giải nhiệt.
5 Cát lồi Mía dò, đọt đắng Costus speciosus
(Koenig) Smith.
Mía dò
(Costaceae) Củ Chữa viêm thận, lợi tiểu, cảm sốt,
ho gà. 6 Chân chim
Ngũ gia bì chân chim, nam sâm, cây lằng
Schefflera octophylla
(Lour.) Harms
Nhân sâm
(Araliaceae) Toàn cây
Làm thuốc bổ, chữa cảm sốt, đau
họng, phong thấp, viêm nhiễm,
phù thũng, hạ đường huyết.
7 Chòi mòi
Chu mòi, chua mòi, chóp mòi, chùm mòi.
Antidesma ghaesembilla
Gaertn.
Thầu dầu
(Euphorbiaceae) Rễ Chữa ho, sưng phổi, tê thấp, ỉa
chảy, đau đầu, điều kinh.
8 Chùm ruột Tầm duột, Tầm ruột, Chùm duột, chùm giuột, tầm ruộc Phyllanthus acidus (L.) Skeels. Thầu dầu (Euphorbiaceae) Thân
Giải nhiệt, chữa mày đay, đau
thấp khớp, xuất tiết ở phế quản, ho, đau đầu, suyễn.
9 Cỏ cú Chương phụỏ gấu, củ gấu, Cyperus rotundus L. Cói
(Cyperaceae) Củ Điều hòa kinh nguyệt, giảm đau,
chữa đau dạ dày, ỉa chảy.
10 Dần xây Cây cối xay,
Giằng xay
Abutilon indicum (L.) Sweet.
Bông
(Malvaceae) Toàn cây
Chữa đau đầu, đau tai, lao phổi,
giảm niệu, giải nhiệt, tiêu viêm. 11 Dây chọi Dây chạy, dây
chại
Stenochlaena palustris (Burm. f.) Bedd.
Dương xỉ lá dừa
12 Dây cổ rùa Me núi Dalbergia cadenatensis (Denst.) Prain
Đậu
(Fabaceae) Thân
Tiêu thấp, chữa ung nhọt, ho
suyễn, băng huyết.
13 Dây dát Dây quai bị Tetrastigma strumarium
(Planch) Gagnep.
Nho
(Vitaceae) Thân
Trị quai bị, tràng nhạc, gãy
xương. 14 Dứa thơm Cây cơm nếp, cây
lá dứa
Pandanus amaryllifolius
Roxb.
Dứa gai
(Pandanaceae) Lá Làm hương liệu trong thực phẩm.
15 Hà thủ ô trắng Dây sữa bò Streptocaulon juventas (Lour.) Merr.
Thiên lý
(Asclepiadaceae) Thân
Giải nhiệt, chữa ho, đau dạ dày, cầm máu, tiêu viêm.
16 Khóm Dứa, Thơm Ananas sativa Liun. Dứa
(Bromeliaceae) Lá
Chữa rối loạn tiêu hóa, tiêu viêm, lợi tiểu, nhuận tràng, giải nhiệt.
17 Kim tiền thảo Vẩy rồng, cây
mắt trâu
Desmodium styracifolium
(Osb.) Merr.
Đậu
(Fabaceae) Toàn cây
Chữa sỏi thận, viêm gan, nhiễm trùng đường tiết niệu.
18 Mạnh trâu Thiên ngưu đằng, sung đầu t
ên
Ficus sagittata Vahl var. sagittata
Dâu tằm
(Moraceae) Thân Bổ gân cốt.
19 Muồng trâu Muồng lác Cassia alata L. Đậu
(Fabaceae) Thân
Chữa táo bón, phù thũng, bệnh
ngoài da. 20 Ngũ linh chỉ Dây ngút Embelia ribes Burm. f. Đơn nem
(Myrsinaceae) Thân
Kháng sinh, sát trùng, bổ huyết,
chữa ban trái, bạch đới, giun.
21 Ngũ trảo Hoàng kinh, chân
chim Vitex negundo L.
Cỏ roi ngựa
(Verbenaceae) Toàn cây
Chữa sốt rét, thấp khớp, đau đầu,
thuốc bổ, liệt nửa người, điều hòa kinh nguyệt.
22 Ổi Ủi, phan thạch
lựu Psidium guajava L.
Sim
(Myrtaceae) Lá
Chữa bệnh zona, ỉa chảy, nôn
mửa, trị vết thương và loét, nhuận
tràng. 23 Rau đắng biển Rau sam đắng,
Cây ruột gà
Bacopa monnieri (L.) Wettst
Hoa mõm sói
(Scrophulariaceae) Toàn cây
Chữa lỵ ra máu, mủ, mắt đỏ sưng đau, da sưng đỏ, nhức mỏi tê bại,
viêm gan vàng da, ho, … 24 Rau đắng đất Rau đắng lá vòng Glinus oppositifolius (L.)
DC.
Rau đắng đất
(Molluginaceae) Toàn cây
Chữa kinh phong, thông tiểu,
nhuận gan, giải nhiệt.
25 Sâm hồng Nho rừng, dây
dác, hổ nho
Ampelocissus martini
Planch.
Nho
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -33- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai Martin
26 Sen Liên, quỳ Nelumbo nucifera
Gaertn.
Sen
(Nelumbonaceae) Lá
Chữa say nóng, viêm ruột, béo
phì, bạch đới, ỉa chảy, di mộng tinh, tim đập nhanh, cơ thể suy nhược,…
27 Sữa đất Cỏ sữa lá nhỏ Euphorbia thymifoblia
Burm.
Thầu dầu
(Euphorbiaceae) Lá
Tiêu viêm, lợi tiểu, tiêu sưng,
bệnh đường ruột. 28 Thạch hộc Kim thạch hộc, tuyết mai Dendrobium crumenatum Sw. Lan
(Orchidaceae) Rễ Chữa ra mồ hôi trộm, đau nhức,
liệt dương.
29 Tô mộc Vang, Vang
nhuộm Caesalpinia sappan L.
Vang
(Caesalpiniaceae) Hạt Trị thấp khớp, viêm nhiễm, rối
loạn kinh nguyệt.
30 Xa kê Cây bánh mì Artocarpus altilis (Park.) Fosb.
Dâu tằm
2.3. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của một số cây thuốc An Giang
2.3.1. Chuẩn bị hóa chất
Đệm pH = 7,0 (0,01 M): hút 14 mL dung dịch Na2HPO4 0,2 M và 15 mL dung dịch NaH2PO4 0,5 M cho vào becher 1000 mL. Thêm nước cất 1 lần và chỉnh đệm đến pH = 7,0, sau đó định mức bằng fiol 1000 mL đến vạch định mức.
Dung dịch Na2CO3 0,1M: cân 10,62 gam muối Na2CO3 khan, hòa tan trong 1000 mL nước cất.
Enzym α-glucosidase 0,2 U mL-1: cân 0,09 mg enzym, hòa tan trong fiol 20 mL bằng đệm photphat pH = 7,0 và giữ mát để đảm bảo tính ổn định của kết quả.
Dung dịch nền pNPG 3 mM: cân và hòa tan 22,82 mg pNPG bằng đệm phosphat pH = 7,0 trong fiol 25 mL, nền được giữ trong tối để tránh bị phân hủy dưới ánh sáng mặt trời.
Mẫu khảo sát được chuẩn bị ở nồng độ 1000 mg mL-1 (đối với mẫu cao) và 1000 mM (đối với mẫu là hợp chất tinh khiết).
Với những mẫu có hoạt tính mạnh, ức chế trên 50 % ở nồng độ 10 µg mL-1
, cần hạ khoảng nồng độ xuống 10 lần để xác định giá trị IC50 thì nồng độ mẫu làm việc cần pha là 100 mg mL-1 (đối với mẫu cao) và 100 mM (đối với mẫu là những hợp chất tinh khiết).
2.3.2. Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
Mẫu được hòa tan trong dung dịch đệm phosphat pH = 7,0. Thêm 100 mL enzym 0,2 U mL-1, lắc đều, ủ 5 phút trong bồn điều nhiệt. Cho tiếp 100 mL dung dịch nền 3 mM và ủ trong bồn điều nhiệt 30 phút để phản ứng diễn ra. Sau khi ủ, thêm 1500 mL Na2CO3 0,1M để dừng phản ứng. Dung dịch được đem đo quang tại bước sóng l= 401 nm (xem sơ đồ 2.2).
Mỗi mẫu được thử ở 4 nồng độ khác nhau. Mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần. Tương ứng với mỗi nồng độ mẫu thử, ta chuẩn bị một mẫu trắng (blank). Mẫu trắng tương tự như mẫu thử nhưng thể tích enzym được thay bằng thể tích đệm.
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -35- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
Thể tích các dung dịch đệm, enzym, chất nền, Na2CO3 và mẫu sử dụng trong quy trình thử hoạt tính được trình bày cụ thể ở bảng 2.2.
Bảng 2.2: Thể tích các dung dịch được sử dụng trong quy trình thử hoạt tính ức chế enzym
α-glucosidase Nồng độ (µg mL-1) Control 100 50 25 10 Thể tích (µL) Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu thử Mẫu trắng Mẫu thử Đệm 4800 2300 4000 1900 4400 2100 4600 2200 4720 2260 Mẫu - - 800 400 400 200 200 100 80 40 Enzym - 100 - 100 - 100 - 100 - 100 Nền 200 100 200 100 200 100 200 100 200 100 Na2CO3 3000 1500 3000 1500 3000 1500 3000 1500 3000 1500
Sơ đồ 2.2: Quy trình thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase
Để có cơ sở đánh giá hoạt tính của những mẫu khảo sát, acarbose (Hình 2.1) và acid tannic (Hình 2.2) được sử dụng làm chất đối chứng dương.
Kết quả thử hoạt tính của chất đối chứng dương và 30 cây thuốc An Giang được trình bày ở bảng 3.2 và 3.3 (phần kết quả và thảo luận).
Lắc đều, ủ ở 370 C trong 30 phút 1500 µL dung dịch Na2CO3 0,1M Đo quang ở 401nm Lắc đều, ủ ở 370 C trong 5 phút V1 µL đệm pH = 7,0 V2 µL dung dịch mẫu 100 µL enzym 0,2 U mL-1 100 µL dung dịch nền 3mM
Hình 2.1: Cấu trúc của acarbose (C25H43NO18)
Hình 2.2: Cấu trúc của acid tannic (C76H52O46)
3. KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY NGŨ LINH CHỈ
3.1. Quá trình ly trích mẫu thân cây Ngũ Linh Chỉ
Mẫu thân cây Ngũ Linh Chỉ (5,3 kg) được xay nhỏ và cho vào bình cầu cổ nhám với khối lượng mẫu mỗi lần trích khoảng 200 – 300 g. Tiến hành đun hoàn lưu với MeOH trong bình cầu cổ nhám (sử dụng khoảng 1 lít MeOH cho mỗi lần trích). Thời gian đun mẫu là 3 giờ. Mỗi mẫu cho vào bình cầu được trích 5 lần. Sau khi trích nóng thì để nguội, lọc và tiến hành cô quay chân không để thu hồi dung môi. Cuối cùng, chúng tôi thu được cao MeOH thô. Từ cao MeOH thô này, chúng tôi tiếp tục hòa tan trong nước cất và tiến hành chiết lỏng – lỏng lần lượt với các
HVCH: Lê Thị Ngọc Hạnh -37- HDKH: TS. Nguyễn Thị Thanh Mai
dung môi hexan, etyl acetat. Sau cùng, chúng tôi thu được các cao phân đoạn, gồm có: cao hexan, cao etyl acetat và cao nước (Sơ đồ 2.3).
Tiến hành thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các mẫu cao của thân cây Ngũ Linh Chỉ nhằm tìm ra mẫu cao có hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase mạnh nhất để tiến hành cô lập các hoạt chất. Kết quả thử hoạt tính được trình bày trong bảng 3.4 (phần kết quả và thảo luận).
Sơ đồ 2.3: Quy trình ly trích bột thân cây Ngũ Linh Chỉ Bột thân Ngũ Linh Chỉ khô
(5,3 kg)
Cao MeOH
(1,0 kg)
1. Trích nóng với MeOH
2. Lọc và thu hồi dung môi
1. Hòa tan với nước cất
2. Chiết lỏng – lỏng với hexan
Cao hexan
(4,7 gam)
Cao etyl acetat
(204,6 gam) Cao nước (750 gam) Dịch hexan Dịch etyl acetat Dịch nước Dịch nước
Thu hồi dung môi
Thu hồi dung môi
3.2. Quá trình cô lập hợp chất từ cao etyl acetat của thân cây Ngũ Linh Chỉ
Cao etyl acetat được tiến hành sắc kí cột hấp phụ trên silica gel pha thường với độ phân cực tăng dần của hệ dung môi MeOH : CHCl3. Dung dịch giải ly sau khi qua cột, được cô quay chân không để thu hồi dung môi và thực hiện sắc kí bản mỏng. Dựa trên kết quả hiện màu của sắc kí bản mỏng, chúng tôi thu được 5 phân đoạn A, B, C, D, E ( Sơ đồ 2.4).
Tiến hành thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các phân đoạn thu được nhằm chọn ra phân đoạn có hoạt tính mạnh để cô lập các hoạt chất. Kết quả thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase của các phân đoạn được trình bày trong bảng 3.5 (phần kết quả và thảo luận).
Sơ đồ 2.4: Quá trình sắc kí cột hấp phụ cao etyl acetat của thân cây Ngũ Linh Chỉ
3.2.1. Cô lập các hợp chất từ phân đoạn A (Sơ đồ 2.5)
Phân đoạn A được tiến hành sắc kí hấp phụ trên silica gel pha thường với độ phân cực tăng dần của hệ dung môi aceton : hexan, sau đó chuyển sang hệ dung môi MeOH : CHCl3 với độ phân cực tăng dần. Thực hiện sắc kí bản mỏng với thuốc thử hiện màu là H2SO4, chúng tôi thu được 3 phân đoạn nhỏ, ký hiệu là A1 (3,8 gam), A2 (32,3 gam) và A3 (46,9 mg) (Sơ đồ 2.5).
Đối với phân đoạn A3, chúng tôi thực hiện sắc kí bản mỏng điều chế với hệ dung ly MeOH : CHCl3 = 3 : 97 và thu được hợp chất 1 (3,4 mg) (Sơ đồ 2.5).
SKC pha thường, hệ dung môi MeOH :