Nghiên cứu khả năng ức chế Staphylococcus aureus của Lactobacillus acidophilus trên hai môi trường sữa đậu nành và nước chiết thịt – peptone để bảo quản thực

Trong điều kiện trên, có thể thấy rằng, việc nghiên cứu khả năng ức chế Staphylococcus aureus của Lactobacillus acidophilus trên hai môi trường sữa đậu nành và nước chiết thịt – peptone

Trang 1

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thạc Sĩ Hoàng Mỹ Dung – Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh – đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết, cho tôi những lời khuyên quý báu trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Thúy Hương, Tiến Sĩ Lê Thị Thủy Tiên, Kỹ Sư Huỳnh Nguyễn Anh Khoa – Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh – đã tặng giống vi sinh vật và một số hóa chất cần thiết để tôi sử dụng trong đề tài

Xin chân thành cảm ơn các anh chị và các bạn ở phòng thí nghiệm 117 – Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh – đã tạo những điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể sử dụng trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm

Xin cảm ơn mẹ và em đã động viên tinh thần tôi trong suốt thời gian làm việc Trên con đường góp nhặt những kiến thức quí báu của ngày hôm nay, các thầy cô

Bộ môn Công nghệ sinh học, Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh, các bạn bè lớp HC06BSH là những người đã cùng tôi sát cánh và trải nghiệm Xin gửi đến mọi người những lời cảm ơn chân thành

Trang 2

TÓM TẮT

Staphylococcus aureus là một tác nhân gây bệnh, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe

con người Bằng phương pháp định lượng tế bào, luận văn khảo sát ảnh hưởng ức chế

của L acidophilus lên sự phát triển của S aureus bằng cách đồng nuôi cấy S aureus

và L acidophilus trên hai môi trường dịch thể: sữa đậu nành và nước chiết thịt Ở

300C, L acidophilus có khả năng ức chế S aureus với tỷ lệ ức chế tối ưu là S aureus/L acidophilus = 1/100 Ở 300C, mật độ S aureus ở các tỷ lệ 1/100, 1/50, 1/10

luôn dưới mức 8 107 tế bào/ml Lượng acid lactic sinh ra có khả năng ức chế S aureus ở giai đoạn đầu nhưng khả năng ức chế này mất đi ở giai đoạn sau của quá

trình ủ

ABSTRACT

Staphylococcus aureus is a opportunistic pathogen and a major concern for

human health By determining the amount of staphylococci, the growth inhibitory

effect produced by the antimicrobial activity of the Lactobacillus acidophilus strain on the Staphylococcus aureus strain was tested on liquid media, soya milk and meat matrix, that contained a mixture of S aureus and L acidophilus The optimum ratio of

S aureus to effector was 1/100 at 300C The population of S aureus at ratios of 1/100,

1/50, 1/10 never attain 8 107 cell per milliliter at 300C Production of acid lactic

appears to inhibit growth of S aureus in the early but not the late stages of incubation

Trang 3

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Giới thiệu chung về L acidophilus và S aureus 2

1.1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 2

1.1.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 4

1.2 Ứng dụng acid lactic và bacteriocin của vi khuẩn lactic 8

1.2.1 Acid lactic của vi khuẩn lactic 8

1.2.2 Bacteriocin của vi khuẩn lactic 8

1.3 Sự đối kháng giữa LAB và S aureus trong thực phẩm 8

1.3.1 Sự acid hóa và tạo thành các acid hữu cơ 9

1.3.2 Sự tạo thành bacteriocin 11

1.3.3 Sự tạo thành hydrogen peroxide (H2O2) 13

1.3.4 Sự cạnh tranh dinh dưỡng 13

1.3.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ LAB/S aureus 14

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu 16

2.1.1 Các chủng giống 16

2.1.2 Nguồn nguyên liệu 16

2.2 Tiến trình thí nghiệm 16

2.2.1 Sơ đồ nội dung thí nghiệm 16

Trang 4

2.2.2 Nội dung bố trí thí nghiệm 18

2.3 Các phương pháp thí nghiệm sử dụng 19

2.3.1 Phương pháp quan sát đại thể 19

2.3.2 Phương pháp nhuộm Gram 19

2.3.3 Khảo sát khả năng tăng trưởng trong môi trường thạch sâu 19

2.3.4 Phương pháp thử catalase 19

2.3.5 Phương pháp dựng đường chuẩn 20

2.3.6 Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 21

2.3.7 Khảo sát khả năng sinh acid 22

2.3.8 Phương pháp định tính acid lactic 22

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 23

3.1 Sự thay đổi pH của môi trường sữa đậu nành theo thời gian 23

3.2 Kết quả khảo sát khả năng ức chế S aureus của L acidophilus 23

3.2.1 L acidophilus có khả năng ức chế S aureus 23

3.2.2 Sự ức chế trong môi trường nước thịt mạnh hơn trong môi trường sữa đậu nành 26

3.2.3 Tỷ lệ ức chế tối ưu là S aureus/L acidophilus = 1/100 27

3.2.4 Tỷ lệ nuôi cấy thích hợp ở những môi trường khác nhau có giá trị khác nhau 29

3.2.5 pH thấp là một trong những yếu tố ức chế khả năng phát triển của S aureus 32

3.2.6 Khả năng ức chế của L acidophilus chỉ có ý nghĩa khi pH đạt đến những giá trị nhất định 35

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC

Trang 5

CÁC TỪ VIẾT TẮT

LAB Lactic Acid Bacteria - vi khuẩn sinh acid lactic

CPS Coagulase Positive Staphylococci - staphylococci coagulase dương

Trang 6

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các bacteriocin của LAB và phổ hoạt động 12

Bảng 3.1 Log (tế bào S aureus/ml) theo thời gian ở môi trường sữa đậu nành và

nước chiết thịt với mật độ S aureus ban đầu 105

tế bào/ml 27

Bảng 3.2 Ảnh hưởng ức chế của L acidophilus trong 26 giờ (Môi trường sữa đậu

nành, mật độ S aureus ban đầu 105

tế bào/ml) 28

Bảng 3.3 Ảnh hưởng ức chế của L acidophilus trong 26 giờ (Môi trường nước

chiết thịt - peptone, Mật độ S aureus 105 tế bào/ml) 28

chiết thịt - peptone, Mật độ S aureus 2.5 106

tế bào/ml) 29

Bảng 4.1 Mật độ tế bào S aureus trong môi trường sữa đậu nành và nước chiết

thịt - peptone theo thời gian 39

Bảng 4.2 Liên hệ giữa mật độ S aureus và lượng enterotoxin tạo thành ở 300C

40

Bảng 4.3 Tỷ lệ vi khuẩn lactic cần thiết để S aureus không đạt đến 8 107

tế bào/ml 41

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của sự bổ sung acid lactic lên tốc độ phát triển của S

aureus (Môi trường APT, 300C) 42

Trang 7

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Lactobacillus acidophilus 4

Hình 1.2 Staphylococcus aureus 5

Hình 1.3 S aureus trên môi trường thạch máu 7

Hình 2.1 Qui trình thí nghiệm 17

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH sữa đậu nành theo thời gian khi mật độ L acidophilus ban đầu là 107 tế bào/ml 23

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật độ tế bào S aureus theo thời gian ở những tỷ lệ S aureus/L acidophilus khác nhau 24

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH của môi trường theo thời gian ở những tỷ lệ S aureus/L acidophilus khác nhau 30

Hình 3.4 Đồ thị thể hiện mối liên hệ giữa pH và mật độ tế bào trong môi trường sữa đậu nành có mật độ S aureus ban đầu là 105 tế bào/ml 32

Hình 3.5 Đồ thị thể hiện mối liên hệ giữa pH và mật độ tế bào trong môi trường nước chiết thịt có mật độ S aureus ban đầu là 105 tế bào/ml 33

Hình 3.6 Đồ thị thể hiện mối liên hệ giữa pH và mật độ tế bào trong môi trường nước chiết thịt có mật độ S aureus ban đầu là 2.5 105 tế bào/ml 34

Trang 8

MỞ ĐẦU

S aureus có thể phát triển trên nhiều điều kiện môi trường khác nhau và là

vi sinh vật gây ngộ độc chính trong thực phẩm Thực phẩm chế biến sẵn hoặc các

sản phẩm sữa lên men là những loại thường xuyên bị nhiễm độc do S aureus

nhất

Tại Việt Nam, tình trạng nhiễm độc S aureus đang ở mức cao Một khảo

sát gần đây đã cho thấy 25% mẫu thịt và 6,1% mẫu cháo dinh dưỡng ở Thành

phố Hồ Chí Minh có mức ô nhiễm S aureus cao hơn qui định của Bộ Y tế [5,

57] Trong khi đó, phương pháp bảo quản chủ yếu hiện nay là sử dụng các hóa chất phụ gia Để diệt khuẩn, một số nơi sản xuất đã cho natri benzoate - một hóa chất có khả năng gây ung thư - vào thực phẩm [57]

Vi khuẩn lactic là một thay thế tiềm năng cho loại hóa chất bảo quản trên Chúng sinh ra acid lactic và các bacteriocin có khả năng ức chế sự phát triển của

S aureus mà không gây hại đến sức khỏe con người Một trong số đó là L acidophilus, vi khuẩn đã được biết đến rộng rãi với vai trò chính trong sản xuất các sản phẩm sữa lên men Đặc tính kháng khuẩn của L acidophilus cũng đã

được nghiên cứu và nhiều công trình đã được ứng dụng vào sản xuất bacteriocin [45]

Trong điều kiện trên, có thể thấy rằng, việc nghiên cứu khả năng ức chế

Staphylococcus aureus của Lactobacillus acidophilus trên hai môi trường sữa

đậu nành và nước chiết thịt – peptone để bảo quản thực phẩm là vấn đề hết sức cần thiết

Luận văn này được thực hiện với mục đích tìm ra điều kiện tối ưu cho việc

ức chế Staphylococcus aureus bằng Lactobacillus acidophilus, tạo tiền đề cho

việc ứng dụng bảo quản thực phẩm sau này Do đó, nghiên cứu tập trung vào xác định:

1 Tỷ lệ tối ưu mà L acidophilus ức chế S aureus mạnh nhất

2 Tỷ lệ L acidophilus ức chế S aureus ở mức có thể chấp nhận được trong

Trang 9

Chương 1: Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về Lactobacillus acidophilus và Staphylococcus aureus

1.1.1 Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus

1.1.1.1 Lị h h hiện Lactobacillus acidophilus

Vào những năm đầu thế kỷ 20 (1900), Moro đã lần đầu tiên phân lập được

vi khuẩn L acidophilus t phân của tr sơ sinh qua phẫu thuật ng đã mô tả

được các đặc điểm của quá trình trao đổi chất cũng như chức năng của vi khuẩn này [27, 33]

Đến năm 1906, Metchnikoff cho xuất bản quyển sách Prolongation of life

optimistic studies Trong sách này ông đã chứng tỏ được rằng L acidophilus có

khả năng lên men đồng hình và có thể sống trong đường ruột, miệng và âm đạo Vào năm 1995, Hammes và Vogel đã phân nhóm Lactobacillus các nhóm

có liên quan dựa trên kiểu lên men và cách phát sinh chủng loài T đó giúp con

người hiểu rõ hơn về hình thức phân loại của L acidophilus

L acidophilus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, dài, mảnh có

kích thước t 0.5 - 1 2 m, thường xếp theo cặp hoặc tạo thành chu i ngắn Khuẩn lạc trên môi trường thạch có kích thước 2-5 mm, lồi, đục, đều và không sinh chất tạo màu Đặc điểm chung của họ vi khuẩn lactic là không sinh bào tử Đây là vi khuẩn ưa nhiệt, có thể phát triển ở 450C [28]

1.1.1.4 Đ i inh h

Trang 10

L acidophilus là loài ít có khả năng di động, không phân giải protein, phản ứng catalase và chuyển hoá nitrat thành nitrit âm tính L acidophilus lên men

đường lactose nhưng chậm, có khả năng lên men các loại đường glucose, saccharose, maltose, mannose, salicin, không lên men mannitol, arabinose, xylose, rhamnose, sorbitol, glycerin Đây là vi khuẩn lên men đồng hình, sản phẩm chính của quá trình lên men là acid lactic

L acidophilus có khả năng tạo bacteriocin gồm lactacin F, lactacin B,

acidocin A có khả năng ức chế các loài Lactobacillus khác Enterococcus [2, 28]

1.1.1.5 Điề iện n i

L acidophilus là loài vi khuẩn k khí tuỳ nghi nhưng chúng phát triển mạnh

trong môi trường lỏng và agar ở điều kiện k khí chuẩn (5% CO2, 10% H2, và 85% N2) Nhiệt độ tối ưu là 370C pH tối ưu cho sự tăng trưởng dao động trong

khoảng 3.8 - 6.5 Nhu cầu dinh dưỡng của L acidophilus phản ánh bản chất rất

khó nuôi cấy của vi khuẩn này Môi trường nuôi cấy chuẩn thường phải rất giàu acid amin và vitamin như peptone, tryptone, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt

bò, ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleate (Tween-80), sodium acetate và muối magnesium kích thích sự tăng trưởng Môi trường nuôi cấy hay được sử dụng là MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) lỏng hay agar

Ngoài ra hiện nay người ta còn sử dụng một số loại môi trường để chọn lọc

L acidophilus t mẫu thực phẩm và sinh thiết với ba tác nhân chính là: Sodium

acetate (15-25 g/l), dịch cà chua và mật (dao động t 0.15-1% oxgall) [4]

1.1.1.6 V i L acidophilus

Như chúng ta biết, trong đường ruột thường có sự cân bằng giữa hệ vi sinh vật phân giải đường và hệ sinh vật phân giải protein Điều này tạo nên trạng thái cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột Khi có yếu tố tấn công vào hệ vi sinh vật phân giải đường như cồn, chất kháng sinh, hoá trị liệu, nhiễm trùng, stress thì sự cân bằng này s bị phá vỡ Khi đó có sự tăng sinh của hệ vi sinh vật phân giải protein và s gây ra một số bệnh như tiêu chảy cấp tính hoặc mãn tính, rối loạn

tiêu hoá, táo bón, trướng bụng,… L acidophilus sống là một phần của hệ sinh vật

phân giải đường s giúp phòng ng a hay điều trị các bệnh này khi đưa trực tiếp một lượng lớn vào ruột, tái lập lại sự cân bằng của hệ vi sinh đường ruột

Trang 11

Trong ruột, L acidophilus giúp tăng cường khả năng hấp thụ vitamin, đặc biệt là

các vitamin nhóm B và vitamin K, các acid béo, lactase và calcium Ngoài ra,

Lactobacillus acidophilus sản xuất acid lactic và các bacteriocin như lactocidin

và acidophilin, ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự tăng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, giúp cho cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột, tăng cường hệ thống miễn dịch, trung hòa các độc tố, kiểm soát cholesterol, chống dị ứng và các vấn đề về da [45]

Các thử nghiệm đã cho thấy L acidophilus có thể ức chế sự sinh trưởng của Candida albicans trong thực quản hoặc âm đạo Các nhà nghiên cứu cũng quan tâm đến khả năng L acidophilus có thể giảm các triệu chứng viêm khớp và

giảm các tác dụng phụ của hóa trị và xạ trị

Đối với gà, người ta thấy rằng L acidophilus có thể ức chế vi khuẩn gây bệnh như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium cũng như E coli

Hình 1.1 Lactobacillus acidophilus [59]

1.1.2 Vi khuẩn Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus do R Koch phát hiện năm 1878 phân lập t mủ ung

nhọt, L Pastuer, năm 1880 và F Rosenbach nghiên cứu tỉ mỉ, năm 1884

Staphylococcus thuộc họ Micrococcaceae [1]

1.1.2.1 Ph n i

Giống Staphylococcus có ít nhất 40 loài, trong đó có 9 loài có 2 loài phụ và

1 loài có 3 loài phụ [1]

Trang 12

Staphylococcus có hình cầu, đường kính (0.8-1) x (0.5-1.5) μm, sắp xếp

không có thứ tự nhất định, thường tụ lại thành chùm Ở các tiêu bản làm t canh trùng nuôi cấy hoặc t mủ thường thấy chu i ngắn, đôi khi chúng đứng t ng đôi hay t ng con một Dưới ảnh hưởng của yếu tố hóa lý, hóa và sinh học (kháng sinh), trong các canh trùng của tụ cầu khuẩn có thể xuất hiện thể hình cầu hoặc hình rất bé Tụ cầu khuẩn là vi khuẩn Gram dương, không có lông, không sinh nha bào, một số chủng có vỏ (capsule) Ở những canh trùng già, có những tế bào riêng l bắt màu Gram âm [1]

Hình 1.2 Staphylococcus aureus [58]

1.1.2.3 Đ i inh ý inh hó

Tụ cầu khuẩn là loại hiếu, yếm khí tùy nghi Chúng phát triển tốt trong các môi trường dinh dưỡng thông thường ở nhiệt độ 370C và pH 7.2 - 7.4 (giới hạn nhiệt độ t 10 - 450C) Ở nhiệt độ phòng, có ánh sáng, tụ cầu khuẩn sinh ra sắc tố (pigment) như: sắc tố vàng, sắc tố trắng, sắc tố vàng chanh Trên thạch thường, tụ cầu mọc với khuẩn lạc trơn lồi, đường kính 1 - 4 mm Dùng kính hiển vi soi khuẩn lạc thấy những hạt thô, chắc ở trung tâm và đục Màu khuẩn lạc tùy thuộc vào sự tạo sắc tố Ngoài thể điển hình là thể S, tụ cầu khuẩn còn có thể tạo ra khuẩn lạc thể R, G và L Ở canh thang, cầu khuẩn mọc làm đục đều và có cặn ở đáy Trong trường hợp đầy đủ dưỡng khí, cầu khuẩn mọc và tạo thành váng ở trên bề mặt Cầu khuẩn phát triển tốt trên môi trường có khoai tây và huyết thanh đông Ở thạch máu, các tụ cầu gây bệnh gây tan máu (hồng cầu thỏ, c u) [1]

Tụ cầu khuẩn có sức chịu đựng cao với điều kiện khô hanh, lạnh, đối với ánh sáng mặt trời và các thuốc hóa học Ở điều kiện khô, tụ cầu sống hơn 6 tháng, ở bụi 50 - 100 ngày, sự đông băng – tan lặp đi lặp lại không làm chết tụ

Trang 13

trong chốc lát Dung dịch phenol 5% diệt tụ cầu sau 15 - 30 phút Tụ cầu khuẩn rất nhạy cảm với một số thuốc nhuộm anilin, chủ yếu vert brilliant, nên thường dùng để điều trị các bệnh viêm mủ ngoài da Tụ cầu khuẩn có sức đề kháng cao với các thuốc kháng sinh, trong đó có 70 - 80 % cùng một lúc kháng lại 4 - 5 loại thuốc kháng sinh, đặc biệt được quan tâm là tụ cầu kháng lại methicillin

Tụ cầu tạo ra các enzyme tiêu hủy protein và đường ở các canh trùng non không sinh Indol Phân hủy gelatin, đông sữa, khử nitrat thành nitrit, sinh urease, catalase, phosphatase, sinh ammoniac, H2S Lên men đường glucose, levulose, maltose, lactose, saccharose, manitol, glycerin Các tụ cầu gây bệnh có enzyme phân hủy arginin Người ta đã phát hiện mối quan hệ giữa hoạt tính enzyme arginase mà mức độ sinh alpha-toxin [1]

1.1.2.4 Khả năng inh ộc tố

Các tụ cầu tổng hợp hơn 25 loại protein, độc tố và enzyme có tính chất gây bệnh: alpha, beta, delta, gamma hemolysin gây tan máu, gây chết và tác động hoại tử da; fibrolysin gây tan máu; enzyme coagulase gây đông huyết tương; enzyme hyaluronidase phá hủy hyaluronic acid có trong thành phần của tổ chức liên kết

Ngoài ra, các tụ cầu còn sinh ra lecithinase Enzyme này phá hủy lecithin là chất có trong hồng cầu Ở các canh trùng tụ cầu cũng phát hiện được chất chống đông máu (anticoagulantum), kìm hãm quá trình đông máu

Các tụ cầu sinh anticoagulantum kìm hãm hoạt tính thực bào của bạch cầu, sinh độc tố ruột (enterotoxin) là nguyên nhân quan trọng gây nhiễm độc ăn uống Độc tốc ruột có ít nhất 6 loại (A→F), là những độc tố hòa tan Các độc tố ruột thuộc loại chịu nhiệt (tồn tại trong nước đun sôi 30 phút), bền vững với tác động của các enzyme ở ruột Khi ăn thực phẩm có 25 μg độc tố ruột, người bị nôn và tiêu chảy [1]

Trang 14

Hình 1.3 S aureus trên môi trường thạch máu [58]

1.1.2.5 Khả năng g bệnh

Gây bệnh cho động vật

Người, các động vật có s ng và lợn nhạy cảm với tụ cầu khuẩn Nếu đưa vào tĩnh mạch thỏ chất lọc canh trùng tụ cầu thì thấy xuất hiện hiện tượng nhiễm độc cấp và động vật s chết sau vài phút Khi đưa vào đường miệng hoặc vào ổ bụng chó, mèo con độc tố ruột tụ cầu thì con vật bắt đầu nôn, tiêu chảy, do tác động của độc tố đã phá hủy chức năng của đường tiêu hóa [1]

Gây bệnh cho người

Tụ cầu khuẩn đột nhập vào cơ thể người qua da và niêm mạc bằng giọt nước bọt và bụi trong không khí Tụ cầu gây bệnh có thể gây viêm tuyến nước bọt, hạch bạch huyết, abcès, viêm màng xương (periostitis), viêm tủy xương (osteomyelititis), viêm nang lông, viêm da, viêm ruột th a, viêm kết mạc, viêm túi mật, viêm phổi, viêm ruột, viêm cơ sinh mủ và viêm da ở tr sơ sinh…

Hàng loạt trường hợp bệnh tụ cầu khuẩn do thứ phát khi bị bệnh cúm, đậu mùa, nhiễm khuẩn vết thương cũng như sau phẫu thuật, nghiêm trọng nhất là nhiễm khuẩn huyết và viêm phổi thứ phát do tụ cầu khuẩn ở tr nhỏ Khi dùng các thực phẩm như phô mai (phô mai tươi), sữa, bánh ngọt, bánh kem, kem bị nhiễm tụ cầu gây bệnh s xuất hiện nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn, hay gặp nhất

là sữa và các sản phẩm của sữa, thịt xay, cá hộp…

Trang 15

Streptococcus, C.diphteriae, M tuberculosis, Actinomycosis, virus cúm và các

bệnh cấp tính đường hô hấp

Việc nhanh chóng tạo sức kháng lại các hóa chất trị liệu cũng như kháng sinh là do sự chuyển nạp yếu tố R-plasmide giữa các tụ cầu Nồng độ thuốc tập trung cao ở trong cơ thể người dẫn đến sự phá hủy quần thể vi khuẩn hoại sinh, đồng thời tạo ra những chủng kháng thuốc và tăng độc tính [1]

1.2 Ứng dụng id i và b e i in a vi khuẩn lactic

1.2.1 Acid lactic c a vi khuẩn lactic

Acid lactic do vi khuẩn lactic tạo ra được sử dụng rộng rãi trong bảo quản và muối chua rau quả, trong công nghiệp bánh kẹo, nước giải khát, ủ chua thức ăn gia súc,…

Vi khuẩn lactic còn được dùng để h trợ con người trong việc hấp thu đường lactose thông qua các sản phẩm t sữa như yaourt, kefir, phô mai,…

1.2.2 Bacteriocin c a vi khuẩn lactic

Các bacteriocin có khả năng kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh

hay gây hư hỏng thực phẩm như Listeria, Clostridium, Staphylococcus, Bacillus sp., Enterococcus sp [45]

Về mặt cấu tạo, bacteriocin có bản chất là protein do vi khuẩn sinh tổng hợp

và có khả năng ức chế sự phát triển của các giống vi khuẩn khác có liên hệ gần với giống sản xuất Bacteriocin có khả năng tiêu diệt những chủng vi khuẩn có liên hệ gần với chủng sản xuất Có rất nhiều giống vi khuẩn sinh tổng hợp bacteriocin, trong đó LAB (lactic acid bacteria) được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm

Hiện nay trên thị trường có hai sản phẩm bacteriocin được thương mại hóa là Nisaplin (sản phẩm t nisin) và ALTA 2431 (sản phẩm t pediocin PA-1) [22]

1.3 Sự ối h ng giữ LAB và S aureus trong thực phẩm

S aureus có thể phát triển trên nhiều điều kiện môi trường khác nhau và là vi sinh vật gây nhiễm độc thường xuyên trong thực phẩm Nhiễm độc do S aureus có thể

t thực phẩm chưa chế biến, do môi trường sản xuất hoặc do hoạt động của con người Thực phẩm chế biến sẵn hoặc các sản phẩm sữa lên men là những loại thường xuyên

Trang 16

Các nhà khoa học đã quan tâm đến khả năng ức chế của LAB lên S aureus t rất sớm Những điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển của S aureus bắt đầu được nghiên

cứu t những năm 1960 [12] Vì các thực phẩm lên men có thể được mô phỏng và kiểm soát trong điều kiện thí nghiệm, nên nhiều giả thuyết liên quan đến điều kiện ức chế (sự acid hóa, sự tạo thành bacteriocin, sự tạo thành H2O2) đã được kiểm tra và trình bày trong các tài liệu khoa học

Các nghiên cứu tập trung vào các thực phẩm lên men (đặc biệt là các sản phẩm t sữa và thịt)

1.3.1 Sự id hó và hành id hữ ơ

S aureus có thể phát triển trên môi trường có pH t 4.6 đến 10 với giá trị pH

tối ưu gần trung tính Ảnh hưởng tiêu cực của pH có thể tăng lên khi kết hợp với

những yếu tố khác Ví dụ như, S aureus có thể nhạy cảm hơn với acid khi nồng độ

muối cao [30] Tương tự, Barber và Deibel cũng đã chứng minh rằng áp lực của oxy

ảnh hưởng đến khả năng chống chịu của S aureus với acid trong xúc xích lên men

[11]

Các loại acid không có khả năng ức chế giống nhau, và ứng với m i giá trị pH

khác nhau, ảnh hưởng lên sinh lý của S aureus s khác nhau Các acid có trong

thực phẩm lên men phần lớn là acid lactic và acid acetic Khi thêm acid lactic vào các môi trường pha sẵn hoặc môi trường sữa, làm giảm pH xuống khoảng 4.4 – 4.5,

sự phát triển của S aureus s bị ức chế hoàn toàn [13, 26, 52] Tương tự, bằng cách

dùng acid lactic giảm pH sữa xuống còn 4, Minor và Marth đã chứng minh rằng

sinh khối S aureus giảm 99% so với môi trường đối chứng không có acid [42] Sự

ức chế tương tự cũng xảy ra với môi trường có pH 5 sử dụng acid acetic, pH 4.5 với acid citric, pH 4.1 với acid phosphoric và pH 4 với acid hydrochloric Sự ức chế do các acid hữu cơ thường xảy ra với acid không phân ly [42], chỉ những loại acid này mới có khả năng khuếch tán xuyên qua màng tế bào chất Khi pH trong tế bào chất cao hơn, acid s phân cắt và phóng thích các proton Do đó, acid acetic và acid propionic, với giá trị pKa lần lượt là 4.8 và 4.9, có khả năng ức chế nhiều hơn so với acid lactic có pKa là 3.9

Stress acid cũng đã được nghiên cứu trên nhiều loài vi khuẩn, đặc biệt là LAB Nhìn chung, sự giảm pH nội bào s làm thay đổi cấu trúc màng và dẫn đến sự suy

Trang 17

dụng để khử acid tế bào chất bằng cách tạo ra một gradient proton xuyên qua màng

tế bào chất [15]

Gần đây, sự biểu hiện gen của S aureus đã được kiểm tra trong điều kiện acid

yếu [55] Kết quả cho thấy sự biểu hiện của nhiều gen chịu ảnh hưởng bởi các giá trị pH khác nhau t 7.5 đến 5.5 Loại gen này được gọi là MAS (Mild Acidification

Stimulon) Bản sao của 400 gen MAS đại diện cho sự thích nghi của S aureus với

acid yếu Trong các gen MAS này, có thể tìm thấy gen liên quan đến việc duy trì pH

nội bào, ví dụ như urease operon (ure), gen mã hóa claperon nội bào (clpB) và

nhiều gen liên quan đến sự trao đổi chất và vận chuyển amino acid và carbohydrate Stress acid yếu này cũng ảnh hưởng đến biểu hiện của các yếu tố gây độc (các

protein bề mặt) Các gen MAS cũng liên quan đến phản ứng của S aureus với các

stress do môi trường khác [55]

Môi trường acid là kết quả của lên men lactic t LAB được xem là yếu tố

chính liên quan đến sự ức chế S aureus Ảnh hưởng của acid lên sự phát triển của

S aureus là một thông số lý hóa trong nhiều nghiên cứu Vài nghiên cứu cho thấy

rằng có một mối liên quan trực tiếp giữa acid trong môi trường và khả năng ức chế

S aureus (tác động lên tốc độ phát triển hoặc khả năng sống sót) trong môi trường

nuôi cấy h n hợp với LAB [11, 31, 39] Những nghiên cứu này dẫn đến một kết luận chung là nếu môi trường có tính acid càng nhiều, thì khả năng ức chế càng cao

Trong một môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng (TSB), vài chủng LAB (E faecium và L mesenteroides) có thể tiêu diệt S aureus Khi pH của môi trường là

6.3, khả năng tiêu diệt không còn nữa, tuy nhiên, khả năng ức chế đáng kể vẫn tiếp

diễn [31] Tương tự, khi nuôi cấy h n hợp của S aureus và Streptococci trong sản

phẩm phô mai Cheddar (đã được giả lập trên sữa) duy trì pH 6.6 Kết quả cho thấy

rằng trong những điều kiện này (pH không thay đổi), S aureus vẫn mẫn cảm với

hoạt động của Streptococci và mật độ của nó chỉ đạt đến 2 104 cfu/ml sau khi ủ 6 giờ ở 320C [23] Do vậy, có thể kết luận rằng pH ảnh hưởng đến khả năng sống sót

của S aureus Tuy nhiên, sự ức chế này có thể bị mất một phần hoặc hoàn toàn nếu

điều kiện môi trường thay đổi Daly và cộng sự đã chứng minh khả năng ức chế của

L lactis ssp diacetylactis lên sự phát triển của S aureus trong khi nuôi cấy h n hợp

trong môi trường nước thịt Tuy nhiên, sự ức chế biến mất trong khi nuôi cấy trong môi trường pha sẵn ở pH không đổi (pH 6.8) [18]

Độ acid là một thông số quan trọng Nhiều nghiên cứu trên phô mai đã cho

Trang 18

quá trình sản xuất Tuy nhiên, độ pH đạt đến sau vài giờ đầu tiên của quá trình sản

xuất mới thật sự quyết định sự phát triển của S aureus Một nghiên cứu thực hiện trên phô mai bán cứng đã cho thấy mật độ của S aureus tăng lên trong 6 giờ đầu

tiên của quá trình sản xuất không phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn ban đầu Trong công nghệ sản xuất phô mai này, độ acid thấp đạt được trong vài giờ đầu có

thể cho phép S aureus phát triển Mật độ S aureus sau 6 giờ sản xuất s thay đổi phụ thuộc vào pH t ng thời điểm sau đó, độ pH càng cao thì mức giảm mật độ S aureus càng thấp [19] Các nghiên cứu trên phô mai mềm (như Camembert) cho thấy có sự phát triển của S aureus trong suốt giai đoạn đầu tiên của quá trình sản

xuất t khi ủ đến khi ướp muối [40] Trong nghiên cứu này, các số liệu không đề

cập đến ảnh hưởng của pH đến mật độ S aureus sau giai đoạn phát triển đầu tiên

Trong các sản phẩm thịt lên men, các loài LAB chiếm ưu thế là lactobacilli

gồm Lactobacillus sakei và Lactobacillus curvatus Ngoài ra người ta còn phân lập được Lb plantarum, Lb casei, Lb brevis và Lb alimentarius [46] Mặc dù các chủng staphylococci coagulase âm tính như S xylosus hoặc S carnosus cũng được

tìm thấy trong các sản phẩm thịt lên men, nhưng lactobacilli mới là nhóm vi khuẩn

có liên quan đến việc sinh ra acid Sự bổ sung lactobacilli vào trong xúc xích khô ở

giai đoạn đầu làm tăng độ acid dẫn đến giảm nhiễm khuẩn do S aureus [11, 32, 39,

Sự kháng khuẩn của LAB, chủ yếu liên quan đến sự tạo thành bacteriocin, đã

được xác định là có hiệu lực với S aureus [15] Nhiều LAB tạo thành bacteriocin

với phổ kháng khuẩn rộng và nhiều bacteriocin của LAB đã được ứng dụng vào thực phẩm [22] Chúng có thể ức chế hoặc thậm chí tiêu diệt một chủng đích nào

đó Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào vấn đề này, sự nhận biết và đặc tính của bacteriocin tạo thành bởi LAB, đặc biệt là LAB phân lập t thực phẩm (như sữa hoặc thịt lên men) để có thể kết hợp công nghệ và bảo quản [38, 50, 51, 54] Với

hoạt tính kháng khuẩn mạnh, lactacin của L acidophilus cũng đã được chứng minh

Trang 19

Bảng 1.1 Các bacteriocin của LAB và phổ hoạt động [12]

Bacteriocin Phổ/ ho ộng h ng h ẩn ên S aureus

Trang 20

Những giống có vai trò quan trọng trong việc bảo quản thực phẩm lên men có khả năng tạo ra bacteriocin ức chế sự phát triển của những vi khuẩn gây bệnh như

Listeria monocytogenes và S aureus Sản phẩm bacteriocin tạo thành bởi LAB có thể ức chế được S aureus

1.3.3 Sự t hành h d gen e xide (H 2 O 2 )

Sự tạo thành H2O2 bởi LAB, đặc biệt là lactobacilli, là nhân tố đối kháng với

S aureus Sự tạo thành H2O2 bởi LAB và vai trò thiết yếu của nó đã được trình bày, đặc biệt là lactobacilli phân lập t hệ âm đạo Một vài nghiên cứu đã đề cập đến vai trò của H2O2 có trong thực phẩm [17, 21, 23, 26] Một vài giống lactobacilli có thể

ức chế sự phát triển của S aureus bằng cách tạo ra H2O2 Ở nồng độ 0.18 mmol/l,

H2O2 có thể kìm hãm và ở nồng độ t 0.6 đến 1.0 mmol/l có thể tiêu diệt vi khuẩn

1.3.4 Sự c nh nh dinh dưỡng

Nhu cầu dinh dưỡng của S aureus và LAB đã được nghiên cứu, m i loài đều

cần môi trường sạch và giàu chất dinh dưỡng: các loại vitamin, amino acid, đường, khoáng, kim loại và những thành phần dinh dưỡng khác để đảm bảo sự phát triển của chúng [10, 14, 16, 36, 41, 49]

S aureus cần năng lượng t những hợp chất hữu cơ Cơ chất mà S aureus sử

dụng có thể là đường như fructose, mannose, ribose, maltose, sucrose, trehalose, rượu (mannitol), acid hữu cơ (acetate), và trong một vài trường hợp là amino acid (glutamine, arginine)

Nhu cầu dinh dưỡng cũng phụ thuộc vào điều kiện phát triển Trong điều kiện

hiếu khí và kị khí, S aureus phân giải những nguồn đường khác nhau, như glucose,

lactose, maltose và/hoặc mannitol Phân tích trình tự gen đã cho thấy sự hiện diện

của hệ enzyme lactose phosphotransferase [34] Chính hệ này cho phép S aureus có

thể phát triển trên môi trường sữa [48]

Khía cạnh chất dinh dưỡng trong nuôi cấy h n hợp đã được đề cập đến trong một vài nghiên cứu [9, 29] Vài nghiên cứu cho thấy đồng nuôi cấy LAB làm giảm

số lượng S aureus do cạnh tranh chất dinh dưỡng Iandolo và cộng sự đã cho thấy

sự cạn kiệt chất dinh dưỡng trong những môi trường nuôi cấy pha sẵn (và đặc biệt

là sự cạn kiệt nicotinamide) liên quan đến sự ức chế S aureus bởi L lactis [29]

Trang 21

Vào năm 1973, Haines và Harmon cũng đã chứng minh sự ức chế chất dinh

dưỡng thiết yếu, chẳng hạn như biotin và niacin, liên quan đến sự ức chế S aureus khi nuôi cấy chung với L lactis ở 300C trong môi trường pha sẵn [26]

Điều đáng chú ý là vài nghiên cứu đồng nuôi cấy sử dụng môi trường pha sẵn trong khi những nghiên cứu khác diễn ra trong chất nền thực phẩm, những chất có thể phức tạp hơn nhiều so với môi trường pha sẵn Chẳng hạn như, ảnh hưởng ức

chế của L lactis lên sự phát triển của S aureus có thể quan sát được trong môi

trường sữa nhưng lại hoàn toàn không tồn tại trong môi trường giàu chất dinh dưỡng ở cùng điều kiện (pH giống nhau) khẳng định một điều khả năng ức chế cũng phụ thuộc vào thành phần của môi trường nuôi cấy [13]

1.3.5 Ảnh hưởng c a tỷ lệ LAB/S aureus

Tỷ lệ LAB và S aureus ban đầu trong môi trường quyết định khả năng ức chế

Điều này được khẳng định trong nhiều nghiên cứu sử dụng môi trường pha sẵn, trong sữa, hoặc trong chất nền phô mai và thịt Kết quả của Haines và Harmon đã

cho thấy, ở môi trường giàu dinh dưỡng (APT), khi mật độ S aureus nhiều hơn L lactis (tỷ lệ 10/1, S aureus 105 cfu/ml và S lactis 104 cfu/ml), mật độ của S aureus

trong môi trường đồng nuôi cấy có thể đạt đến giá trị bằng với môi trường đối chứng (1010 cfu/ml, mức có thể sản sinh ra enterotoxin) Tuy nhiên, với tỷ lệ (S aureus: L lactis) là 1/1 hoặc 1/10, mật độ cao nhất mà S aureus có thể đạt được

tương ứng chỉ còn 106 và 105 cfu/ml [25] Sự ảnh hưởng của tỷ lệ được xem như không phụ thuộc vào môi trường và thậm chí trong một vài trường hợp, không phụ thuộc vào chủng cạnh tranh, bởi vì kết quả tương tự cũng đã thu được trong môi

trường tổng hợp khi đồng nuôi cấy với E coli [53]

Nhiều nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng tỷ lệ S aureus/LAB là một thông số quyết định khả năng ức chế, in situ, trong mô hình chất nền phô mai và thịt Trong

một số loại phô mai cứng được làm t sữa tươi, mật độ staphylococci coagulase dương tính (CPS) sau 24 giờ bằng với số lượng ban đầu Tuy nhiên, mật độ CPS trong một vài mẫu lại tăng lên sau khi 6 giờ đầu tiên Vì vậy, mật độ sau 24 giờ còn phụ thuộc vào pH đạt đến sau 6 giờ đầu tiên của quá trình sản xuất [40, 19]

Trong mô hình phô mai mềm (Camembert) sản xuất t sữa dê tươi, lượng S aureus ban đầu (t 102 đến 106 cfu/ml) một phần s quyết định đến số lượng S aureus khi chuẩn bị ướp muối (khoảng 22 giờ sau khi ủ) Tuy nhiên, điều đáng chú

ý là số lượng S aureus tăng trong thời gian hình thành khối đông, không phụ thuộc

Trang 22

vào lượng S aureus ban đầu, và ổn định sau khi ướp muối và giảm trong quá trình

bảo quản [40] Kết quả tương tự với phô mai Manchego (sữa bò và dê, Tây Ban Nha) [24]

Trong chất nền thịt, Metaxopoulos và cộng sự đã kiểm tra lượng S aureus ban

đầu (104

và 105 tế bào/g) với lactobacilli (0, 105 và 106 tế bào/g) trong quá trình lên

men xúc xích Kết quả cho thấy rằng tỷ lệ LAB/S aureus tỷ lệ trực tiếp với sự ức chế S aureus [39]

Nhiệt độ ủ cũng có ảnh hưởng lớn đến sự ức chế Trong môi trường sữa, sự ức chế tối ưu xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn 300C [10, 14, 16, 36, 41, 49]

Trang 23

Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

 Giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus VTCC2156

Các chủng giống này được cấy chuyền sau m i 2 tuần

2.1.2 Nguồn ng ên iệu

Các loại môi trường dùng trong thực nghiệm:

 Môi trường giữ giống và tăng sinh giống vi khuẩn Staphylococcus aureus:

môi trường Nutrient Broth (NB) và Nutrient Agar (NA)

 Môi trường giữ giống và tăng sinh giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus: môi trường MRS và MRS Agar

 Môi trường sữa đậu nành, môi trường nước chiết thịt – peptone để khảo

sát khả năng ức chế Staphylococcus aureus của Lactobacillus acidophilus

 Môi trường Mannitol Salt Agar để phân lập Staphylococcus aureus

Thành phần các loại môi trường này được trình bày ở Phụ lục 7

2.2 Tiến ình hí nghiệm

2.2.1 Sơ ồ nội d ng hí nghiệm

Trang 24

Hình 2.1 Qui trình thí nghiệm

Toàn bộ quá trình thí nghiệm nhằm hai mục tiêu: tìm ra tỷ lệ nuôi cấy

Staphylococcus aureus/Lactobacillus acidophilus tối ưu sao cho L acidophilus ức chế S aureus mạnh nhất; khảo sát tỷ lệ nuôi cấy ức chế Staphyloccocus aureus sao

cho môi trường có pH gần với điểm trung tính nhất (pH ≈ 7) Do đó, qúa trình thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ Hình 2.1

Khảo sát giống S aureus

Xây dựng đường chuẩn quan

hệ giữa OD và mật độ tế bào

Khảo sát giống L acidophilus

Xây dựng đường chuẩn quan hệ giữa OD và mật độ tế bào

Khảo sát sự thay đổi pH của môi trường sữa đậu nành theo thời gian để tìm ra thời gian thí nghiệm thích hợp

Khảo sát tốc độ sinh trưởng của S

aureus ở các mật độ ban đầu khác nhau

để tìm ra mật độ nuôi cấy thích hợp

Khảo sát ảnh hưởng của những tỷ lệ nuôi

cấy Staphylococcus aureus/Lactobacillus acidophilus khác nhau lên khả năng sinh

trường sữa đậu nành

và môi trường nước chiết thịt - peptone Khảo sát sự thay đổi

pH môi trường đồng nuôi cấy theo thời gian

Trang 25

2.2.2 Nội dung bố í hí nghiệm

Gi i n 1

Giống vi khuẩn Staphylococcus aureus được cấy chuyền và giữ trên môi trường NA Giống vi khuẩn Lactobacillus acidophilus được cấy chuyền và giữ trên

môi trường MRS Kiểm tra đại thể bằng cách trải đĩa Kiểm tra vi thể bằng cách

nhuộm Gram và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi

Giai n 2

 Dựng đường chuẩn của Staphylococcus aureus trên môi trường NB

 Dựng đường chuẩn của Lactobacillus acidophilus trên môi trường MRS

dịch thể

 Khảo sát một số đặc tính của Lactobacillus acidophilus như khả năng làm

đông tụ sữa, khả năng sinh acid lactic

Gi i n 3

Khảo sát sự thay đổi pH của môi trường sữa đậu nành có bổ sung L acidophilus theo thời gian đến khi sữa bắt đầu đông tụ Lượng L acidophilus ban

đầu 107

tế bào/ml Tiến hành đo pH sau m i 20 phút

Khảo sát tốc độ sinh trưởng của S aureus trong môi trường nước chiết thịt ở

các mật độ ban đầu khác nhau: 5 105

, 106, 2.5 106 và 5 106

tế bào/ml Định

lượng S aureus bằng phương pháp đếm gián tiếp số khuẩn lạc trên môi trường

Mannitol Salt Agar Ghi nhận lượng tế bào cực đại ở m i thí nghiệm

Gi i n 4

Nghiên cứu khả năng ức chế S aureus của L acidophilus

Khảo sát khả năng ức chế S aureus của L acidophilus trên môi trường sữa đậu nành và nước chiết thịt – peptone theo các tỷ lệ S aureus/L acidophilus = 1/100, 1/50, 1/10, 1/1 Lấy mẫu đo pH và xác định số S aureus sống sót theo thời gian Định lượng S aureus bằng phương pháp đếm gián tiếp số khuẩn lạc trên môi trường Mannitol Salt Agar (chỉ S aureus mới có khả năng mọc được trên môi trường này, L acidophilus thì không)

Trang 26

âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn (do có ít peptidoglycan) và được bao bọc bởi một màng mỏng s có màu hồng [3]

Thực hiện

 Nhỏ vào miếng tiêu bản một giọt nước, lấy giống vi sinh vật hòa vào giọt nước

 Cố định nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn

 Nhuộm Crystal violet trong một phút Sau đó rửa nhanh bằng nước

 Nhuộm Lugol trong 30 giây Sau đó rửa nhanh bằng nước

 Tẩy màu bằng cồn Sau đó rửa nhanh bằng nước

 Nhuộm bổ sung Fuchsin trong một phút, rửa nước và để khô tự nhiên

 Nhỏ vào một giọt dầu soi kính và quan sát ở vật kính dầu (X100)

2.3.3 Khả hả năng ăng ưởng ng i ường th h

Cấy vi khuẩn vào trong môi trường thạch sâu, ủ ở 370C trong 40 giờ Quan sát

sự phát triển của vi khuẩn dọc theo vết cấy Nếu khuẩn lạc chỉ mọc trên bề mặt thạch thì đó là vi khuẩn hiếu khí; khuẩn lạc mọc dọc theo đường cấy t trên xuống thì đó là chủng k khí tuỳ ý và nếu khuẩn lạc chỉ mọc ở đáy môi trường thì đó là vi khuẩn k khí bắt buộc [6]

Trang 27

Các vi sinh vật hiếu khí và k khí tuỳ nghi chứa chu i truyền điện tử có

cytochrome thì đều có enzyme catalase (tr các Streptococcus spp.) Enzyme này là

một trong những enzyme có vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các tổn thương bởi các dẫn xuất độc tính cao của oxy phân tử trong tế bào

Các vi sinh vật này có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy là chất điện tử cuối cùng trog chu i truyền điện tử, tạo H2O2 Catalase

là enzyme có tác dụng thuỷ phân hydrogen peroxide (H2O2) thành nước và oxygen, ngăn cản sự tích tụ của phân tử có độc tính cao này trong tế bào Sự thuỷ phân hydrogen peroxide giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí [37]

H2O2 catalase H2O + O2 Thử nghiệm này thường được dùng để phân biệt các vi sinh vật hiếu khí với vi

sinh vật k khí Ví dụ nhu Bacillus ( ) với Clostridium (-), Streptococcus (-) với Staphylococcus (+)

Thực hiện

Làm ngập mặt thạch nghiêng có vi khuẩn sinh trưởng với 1ml H2O2 3% Nếu

có bọt khí sinh ra chứng tỏ phản ứng là dương tính Ta cũng có thể tạo nhũ tương khuẩn lạc vi khuẩn trong một giọt H2O2 3% trên bề mặt phiến kính Nếu có sự tạo bọt ngay lập tức thì chứng tỏ phản ứng là dương tính [3]

2.3.5 Phương h dựng ường chuẩn

Đây là một bước trong tiến trình thí nghiệm

Thực hiện

Cấy tăng sinh: lấy một vòng que cấy vi khuẩn t thạch nghiêng cho vào ống

nghiệm chứa 10ml môi trường MRS lỏng (đối với L acidophilus) và môi trường

NB (đối với S aureus) Nuôi cấy ở nhiệt độ 370C trong vòng 24 giờ Sau đó cho

toàn bộ dịch nuôi cấy L acidophilus và erlen chứa 250 ml môi trường MRS dịch thể, dịch nuôi cấy S aureus vào erlen chứa 250 ml môi trường NB Tiếp tục ủ hai

erlen này ở 370C trong vòng 14 giờ

T bình tăng sinh, hút các thể tích canh trường nuôi cấy cho vào ống nghiệm rồi đem pha loãng 2, 4, 6, 8, 10, 12 lần trong môi trường MRS dịch thể đã vô trùng

(đối với L acidophilus) và NB đã vô trùng (đối với S aureus) Sau đó tiếp tục pha

loãng t ng mẫu này theo dãy thập phân Bậc pha loãng đầu tiên được thực hiện bằng cách cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng

Trang 28

Vortex cho mẫu tan đều, được mẫu pha loãng ở nồng độ 10-1 Tiến hành pha loãng các bậc tiếp theo bằng cách hút 1ml t dung dịch nồng độ trước cho vào 9ml nước muối sinh lý vô trùng, được các nồng độ pha loãng 10-2 , 10-3 , 10-4…

Sau đó dùng micropipette hút 100μl dịch pha loãng này sang các đĩa thạch

petri chứa môi trường (MRS agar đối với L acidophilus và NA đối với S aureus),

trang đều trên bề mặt thạch, m i nồng độ thực hiện với 3 đĩa petri Lật ngược đĩa và đem ủ lượng đĩa này ở nhiệt độ 370

C trong 48 giờ, đếm số khuẩn lạc quan sát được Tính số tế bào sống/ml dịch huyền phù trước khi pha loãng theo dãy thập phân Số khuẩn lạc tối ưu là 25 - 250 khuẩn lạc/đĩa

Lấy 1.5 ml các dịch chứa tế bào trước khi pha loãng theo dãy thập phân vào các cuvette, đọc độ hấp thu ở bước sóng 600 nm trên máy đo mật độ quang

Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa mật độ tế bào (số tế bào /ml) và độ hấp thu [3]

2.3.6 Định ượng vi sinh vật bằng hương h ếm khuẩn l c

Đây là phương pháp sử dụng chính trong thí nghiệm

Nguyên tắc

Nuôi cấy một lượng xác định mẫu huyền phù vi sinh vật hoặc pha loãng mẫu lên môi trường thạch dinh dưỡng thích hợp trong đĩa petri Sau thời gian nuôi cấy, trên bề mặt thạch s xuất hiện các khuẩn lạc và ta có thể quan sát được bằng mắt thường Dựa vào số khuẩn lạc đếm được, thể tích mẫu đã cấy và hệ số pha loãng, ta

có thể suy ra số khuẩn lạc có trong 1ml mẫu khảo sát ban đầu

Trang 29

Kết quả

Khi khuẩn lạc đã mọc, đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa Số khuẩn lạc tối ưu trên m i đĩa là 25 - 250 khuẩn lạc Số lượng vi sinh vật trung bình có trong 1ml mẫu được tính theo công thức:

N (tế bào/ml) =

d 2

C

Trong đó:

N là số khuẩn lạc trong 1ml mẫu ban đầu

C1, C2 là số khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa petri ở độ pha loãng đã chọn

d là hệ số pha loãng mẫu

2.3.7 Khả hả năng inh id

Cấy sinh khối vi khuẩn lên môi trường Carbonate agar (Phụ lục 7) Xác định khả năng sinh acid làm tan CaCO3 trong môi trường tạo thành vòng trong suốt quanh sinh khối

2.3.8 Phương h ịnh ính id i

Nguyên tắc

Khi tác dụng với acid lactic, thuốc thử Uphenmen s đổi t màu xanh tím sang màu vàng Quan sát sự đổi màu của thuốc thử ta có thể xác định được khả năng tạo acid lactic của vi khuẩn

Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các thành phần như sau:

 Ống đối chứng 1: thuốc thử Uphenmen

 Ống đối chứng 2: 5ml acid lactic 98%, 3ml thuốc thử Uphenmen

 Ống đối chứng 3: 5ml dịch không lên men, 3ml thuốc thử Uphenmen

 Ống đối chứng 4: 5ml dịch lên men, 3ml thuốc thử Uphenmen [6]

Quan sát và nhận xét sự đổi màu của thuốc thử

Trang 30

Chương 3: Kết quả thí nghiệm

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

3.1 Sự h ổi pH c i ường sữ ậ nành he hời gian

Kết quả thí nghiệm được biểu diễn trên đồ thị Hình 3.1 và kết quả thô được ghi lại ở Phụ lục 4

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH sữa đậu nành theo thời gian khi mật

độ L acidophilus ban đầu là 107

tế bào/ml (thí nghiệm được thực hiện 3 lần) Kết quả cho thấy pH của môi trường sữa giảm dần theo thời gian nuôi cấy Trong

2 giờ 40 phút đầu tiên của thí nghiệm, pH môi trường không đổi và bằng pH ban đầu 6.65 Sau đó, giá trị pH bắt đầu giảm dần và giảm nhanh sau 7 giờ Đến 11 giờ, sữa bắt đầu xuất hiện hiện tượng đông tụ, lúc đó pH = pI = 5.58 Thí nghiệm kết thúc

Vì pH của sữa đậu nành thay đổi không đáng kể sau m i hai giờ, nên ở thí nghiệm tiếp theo, s tiến hành lấy mẫu sau m i hai giờ trước khi sữa đậu nành đông tụ

Qua đó khảo sát khả năng ức chế của L acidophilus lên S aureus vào thời gian trước

đông tụ, đánh giá có thể ứng dụng khả năng ức chế để bảo quản sữa đậu nành dạng lỏng hay không

3.2 Kết quả khả hả năng ức chế S aureus c a L acidophilus

3.2.1 L acidophilus ó hả năng ức chế S aureus

Kết quả khảo sát khả năng ức chế S aureus của L acidophilus được biểu diễn

5,4 5,6 5,8 6 6,2 6,4 6,6 6,8

Thời gian (h)

Trang 31

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi mật độ tế bào S aureus theo thời gian ở

những tỷ lệ S aureus/L acidophilus khác nhau (m i thí nghiệm đƣợc thực hiện hai

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Trang 32

3.2.1.1 M i ường sữ ậ nành

Kết quả thí nghiệm trên môi trường sữa đậu nành với mật độ S aureus ban

đầu là 105 tế bào/ml (thí nghiệm 1) được thể hiện trên đồ thị Hình 3.2 a

Kết quả cho thấy ở tất cả các tỷ lệ đồng nuôi cấy, vào những giờ đầu, sinh

khối S aureus tăng đều theo theo thời gian Đến giờ thứ 15, lượng sinh khối ở tỷ

lệ 1/100 bắt đầu giảm dần Tiếp đến lượng S aureus ở các tỷ lệ 1/50, 1/10 cũng

lần lượt giảm ở 17 và 20 giờ, trong khi sinh khối ở mẫu đối chứng (không được

đồng nuôi cấy với L acidophilus) lúc này vẫn tiếp tục tăng

Riêng ở tỷ lệ 1/1, hoạt động ức chế diễn ra rất yếu Thậm chí trong vòng 10

giờ đầu, lượng S aureus ở tỷ lệ này còn có xu hướng lớn hơn ở mẫu đối chứng Trong suốt thời gian thí nghiệm, lượng S aureus chỉ thật sự giảm sau 21.5 giờ

Đặc biệt, tỷ lệ 1/10 thể hiện khả năng ức chế vượt trội 15 giờ đầu tiên

Nhưng sau thời gian đó, lượng S aureus ở tỷ lệ này lại cao hơn các tỷ lệ 1/100,

1/50

Kết quả sau 26 giờ nuôi cấy, mật độ S aureus của mẫu đồng nuôi cấy ở tỷ

lệ 1/100 nhỏ hơn mẫu đối chứng (không được đồng nuôi cấy với L acidophilus)

900 lần (mẫu đối chứng 7.5 108 tế bào/ml, mẫu đồng nuôi cấy 8.3 105 tế

bào/ml) Trong thí nghiệm này, mật độ tế bào ở các tỷ lệ nuôi cấy S aureus/L acidophilus = 1/100 ; 1/50 ; 1/10 đều không vượt quá 8.107 tế bào/ml - mật độ

mà vi khuẩn có thể sinh ra lượng enterotoxin gây ngộ độc cho cơ thể con người [25]

3.2.1.1 M i ường nước chiết thịt – peptone

Kết quả thí nghiệm trên môi trường nước chiết thịt - peptone với mật độ S aureus ban đầu là 105 tế bào/ml (thí nghiệm 2) được thể hiện trên đồ thị Hình 3.2

b và Phụ lục 6

Sự thay đổi về lượng vi khuẩn gây bệnh cũng tương tự như thí nghiệm 1

Vào 8 giờ đầu tiên của thí nghiệm, lượng S aureus tăng đều theo thời gian rồi

sau đó bắt đầu giảm dần

Sau 26 giờ nuôi cấy, mật độ S aureus ở tỷ lệ 1/100 nhỏ hơn 6000 lần so với mẫu đối chứng không được đồng nuôi cấy với L acidophilus (mẫu đối chứng

Trang 33

này, mật độ tế bào ở các tỷ lệ nuôi cấy S aureus/L acidophilus = 1/100 ; 1/50 ;

1/10 ; 1/1 đều không vượt quá 8 107

Vào 2.5 giờ đầu của thí nghiệm, lượng S aureus giảm nhẹ, sau đó tăng trở

lại Vi khuẩn này tiếp tục phát triển và đạt cực đại tại 13 giờ (đối với tỷ lệ 1/100, 1/50) và 15 giờ (đối với tỷ lệ 1/10) T sau đó đến 21 giờ, số lượng vi khuẩn bắt

đầu giảm mạnh Tuy nhiên sau 21 giờ, số lượng S aureus lại đột ngột tăng và chỉ

có xu hướng giảm sau 42 giờ

Sau 25 giờ nuôi cấy, mật độ S aureus nhỏ hơn 37000 lần so với mẫu đối chứng không được đồng nuôi cấy với L acidophilus (mẫu đối chứng 5.2 108 tế bào/ml, mẫu đồng nuôi cấy 1.4 104 tế bào/ml) Trong thí nghiệm này, mật độ tế

bào ở các tỷ lệ nuôi cấy S aureus/L acidophilus = 1/100 ; 1/50 ; 1/10 đều không

vượt quá 8 107 tế bào/ml

Tuy số lượng tăng giảm không theo qui luật như những thí nghiệm trước

nhưng cuối giai đoạn của quá trình thí nghiệm, mật độ S aureus lại tương đương với ban đầu, chỉ xấp xỉ 2.5 106 tế bào/ml Đặc biệt ở tỷ lệ 1/100, 1/50, sau 48 giờ, lượng staphylocci hoàn toàn thấp hơn lượng ban đầu (3.4 105 và 4.2 105 tế bào/ml)

Dựa vào những kết quả nêu trên, có thể kết luận rằng ở 300C, trong vòng 20

giờ, S aureus có thể bị ức chế hoàn toàn bởi L acidophilus (với mật độ nhiễm khuẩn S aureus ban đầu trong môi trường sữa đậu nành là 105 tế bào/ml, trong môi trường nước chiết thịt - peptone lần lượt là 105 và 2.5 106 tế bào/ml)

3.2.2 Sự ức chế ng i ường nước thịt m nh hơn ng i ường sữa

ậ nành

Trong suốt 26 giờ thí nghiệm, lượng S aureus ở môi trường nước thịt luôn

thấp hơn ở môi trường sữa đậu nành (Bảng 3.1) Xét cùng một mật độ nhiễm khuẩn

S aureus ban đầu là 105 tế bào/ml, tỷ lệ vi khuẩn cho vào là S aureus/L acidophilus = 1/100 thì sau 26 giờ đồng nuôi cấy, ở môi trường nước thịt, lượng S aureus là 1.4 104 tế bào/ml trong khi ở môi trường sữa đậu nành là 8.3 105

tế bào/ml (Phụ lục 6)

Trang 34

Kết quả cho thấy, yếu tố môi trường có ảnh hưởng đến khả năng ức chế

S.aureus của L acidophilus Sự ức chế diễn ra trong môi trường nước chiết thịt –

peptone thuận lợi hơn trong môi trường sữa đậu nành

Bảng 3.1 Log (tế bào S aureus/ml) theo thời gian ở môi trường sữa đậu nành và

nước chiết thịt với mật độ S aureus ban đầu 105

tế bào/ml Thời gian

26 5.9196 4.1461 6.0128 4.8129 6.8921 4.8774 8.1761 5.4472 M1 : Môi trường sữa đậu nành

M2 : Môi trường nước chiết thịt - peptone

3.2.3 Tỷ lệ ức chế tối ư à S aureus/L acidophilus = 1/100

Kết quả t 3 đồ thị Hình 3.2 cho thấy, tại t ng mốc thời gian khác nhau, mật

độ S aureus ở tỷ lệ 1/100 hầu như luôn thấp hơn những tỷ lệ khác

Trang 35

Bảng 3.2 Ảnh hưởng ức chế của L acidophilus trong 26 giờ (Môi trường sữa đậu

nành, mật độ S aureus ban đầu 105 tế bào/ml) – Trích t Phụ lục 6

Tỷ lệ

Lượng S aureus

cực đại (tế bào/ml)

Lượng S aureus

sau cùng (tế bào/ml)

Thời gian lượng S aureus bắt đầu giảm

Bảng 3.3 trình bày mật độ S aureus cực đại cũng như mật độ S aureus sau

cùng tương ứng trong t ng tỷ lệ, với số staphylococci ban đầu là 105 tế bào/ml Tương tự như kết quả trong thí nghiệm với môi trường sữa đậu nành ở cùng mật

độ S aureus lúc bắt đầu, tỷ lệ 1/100 vẫn là tối ưu nhất Chỉ sau 8 giờ, lượng S aureus đạt cực đại tại mật độ 2.9 106 tế bào/ml và bắt đầu giảm xuống

chiết thịt - peptone, Mật độ S aureus 105 tế bào/ml) – Trích t Phụ lục 6

Tỷ lệ

Lượng S aureus

cực đại (tế bào/ml)

Lượng S aureus

sau cùng (tế bào/ml)

Thời gian lượng S aureus bắt đầu giảm

Trang 36

Bảng 3.4 trình bày mật độ S aureus cực đại cũng như mật độ S aureus sau

cùng tương ứng trong t ng tỷ lệ, với số staphylococci ban đầu là 2.5 106

ở thời điểm bắt đầu) Lượng tế bào ở 48 giờ chỉ còn 3.4 105

tế bào/ml

chiết thịt - peptone, Mật độ S aureus 2.5 106 tế bào/ml) – Trích t Phụ lục 6

Tỷ lệ Lượng S aureus cực đại

(tế bào/ml)

Lượng S aureus sau

cùng (tế bào/ml) 1/100 2.5 106 (ban đầu) 3.4 105

Trang 37

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi pH của môi trường theo thời gian ở những

tỷ lệ S aureus/L acidophilus khác nhau (m i thí nghiện được thực hiện hai lần) (a) MT sữa đậu nành S aureus: 105 tế bào/ml

Trang 38

Vì thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế trên chất nền thực phẩm, nên yêu cầu đặt ra là phải đảm bảo pH ở mức trung tính nhất (hoặc cao nhất có thể) Theo

yêu cầu đó, thì tỷ lệ 1/1 nên được chọn Tuy nhiên, mật độ S aureus tối đa xuất

hiện ở tỷ lệ này là 2.3 108 tế bào/ml (Bảng 3.2) Mật độ này đã vượt quá ngưỡng

8 107

tế bào/ml (mật độ S aureus có thể sản sinh ra lượng độc tố enterotoxin

gây ngộ độc cho cơ thể con người) [25] Do đó, tỷ lệ thích hợp trong trường hợp

này nên là 1/10 Ở tỷ lệ này, mật độ S aureus lớn nhất xuất hiện là 6.7 107 tế bào/ml, và mật độ này chỉ tồn tại trong vòng tối đa 4.5 giờ (vì 3 giờ trước đó,

lượng S aureus mới chỉ là 3.4 107 tế bào/ml Và trong 1.5 giờ sau, lượng S aureus đã giảm xuống còn 6.7 107 tế bào/ml, và tiếp tục giảm trong những giờ tiếp theo) nên không thể sinh lượng enterotoxin gây độc cho con người

trước đó, lượng S aureus mới chỉ là 1.0 107 tế bào/ml Và trong 7 giờ sau, lượng

S aureus đã giảm xuống còn 8.8 106 tế bào/ml, và tiếp tục giảm trong những giờ tiếp theo) nên không thể sinh lượng enterotoxin gây độc cho con người

Xét cùng thời gian thí nghiệm là 26 giờ thì ở thí nghiệm với mật độ S aureus ban đầu là 2.5 106 tế bào/ml, tỷ lệ phù hợp nhất là 1/10 (tỷ lệ 1/1 đã không được khảo sát) Vì ở tỷ lệ này, mật độ staphylococci lớn nhất tìm được là 6.7 106 tế bào/ml, và mật độ này chỉ tồn tại trong vòng tối đa 4 giờ (vì 2 giờ

trước đó, lượng S aureus mới chỉ là 4.2 106 tế bào/ml Và trong 2 giờ sau, lượng

S aureus đã giảm xuống còn 4.5 105 tế bào/ml) Tuy lượng S aureus có tăng nhẹ trong những giờ sau, nhưng với thời gian ngắn và mật độ S aureus như vậy

không thể sinh lượng enterotoxin gây độc cho con người [25]

Với hai mật độ S aureus ban đầu khác nhau, có thể kết luận chung rằng, tỷ

lệ S aureus/L acidophilus phù hợp là 1/10

Trang 39

Trong cùng một tỷ lệ, lượng L acidophilus cấy vào s ảnh hưởng lên S aureus khác nhau nếu môi trường nuôi cấy khác nhau Qua đó cho thấy rằng yếu tố

môi trường cũng như lượng staphylococci ban đầu cần được xem xét trước khi quyết định tỷ lệ ức chế phù hợp

3.2.5 pH th à ột trong những yếu tố ức chế khả năng h i n c a S aureus

Hình 3.4 Đồ thị thể hiện mối liên hệ giữa pH và mật độ tế bào trong môi trường

sữa đậu nành có mật độ S aureus ban đầu là 105 tế bào/ml (m i thí nghiệm được thực

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	1,45 MB