Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa lactobacillus acidophilus

Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 17 2.3.1.. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn

NGUYỄN MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT

LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU

PROBIOTIC CHỨA

Lactobacillus acidophilus

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

NGUYỄN MAI HƯƠNG

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT

LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU

Trần Văn Thái, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều

kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn TS Đàm Thanh Xuân đã nhiệt tình giúp đỡ và

đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực hiện đề tài

Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo,

các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược trong suốt quá trình

làm đề tài nghiên cứu và thực nghiệm tại bộ môn

Nhân dịp này, em xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã quan tâm, dạy dỗ trong thời gian em học tập tại trường

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp

đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống

Em xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên

Nguyễn Mai Hương

1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn lactic 2

1.1.2 Loài Lactobacillus acidophilus 3

1.2.1 Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic 5

1.2.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa 6 1.2.3 Phương pháp tách pha đông tụ 7

1.2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa 11

1.3 Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật 11 1.3.1 Lý thuyết đông khô 11 1.3.2 Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 12

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên

liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản

17

2.3.1 Phương pháp nhân giống 17 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17 2.3.3 Phương pháp vi nang hóa bằng alginat sử dụng kỹ thuật tách pha đông tụ

17

2.3.4 Phương pháp đông khô 18 2.3.5 Phương pháp xác định hàm ẩm 19 2.3.6 Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV 19

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của

nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus

sau đông khô

21

3.1.1 Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi

thay đổi nồng độ alginat

21

3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi

nang sau đông khô

25

3.2 Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của

nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình

bảo quản

29

3.2.1 Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên

liệu đông khô probiotic

29

3.2.2 Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu

đông khô probiotic dạng vi nang

33

3.2.3 Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa 36

2 Kiến nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Ap : Amylopectin

ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ

B infantis : Bifidobacterium infantis

Bifidobacterium spp : Các loài thuộc chi Bifidobacterium

LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn Lactic

L acidophilus : Lactobacillus acidophilus

L amylophilus : Lactobacillus amylophilus

L amylovorus : Lactobacillus amylovorus

L brevis : Lactobacillus brevis

L kefir : Lactobacillus kefir

MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS

2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 15 2.2 Các máy móc dùng trong nghiên cứu 16 3.1 Thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus

ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat

22

3.2 Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa

Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng

độ tinh bột

26

3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót trong 5 mẫu sau đông khô 31 3.4 Số lượng vi khuẩn sống sót và hàm ẩm của các mẫu sau đông khô 34 3.5 Hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 37 3.6 Lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 38

1.1 Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 5 1.2 Cấu trúc của acid alginic 10 1.3 Cấu trúc phân tử Ca-alginat 10 3.1 Vi nang Ca-alginat (2%) sau đông khô 23 3.2 Vi nang Ca-alginat (2%)-TB (10%) sau đông khô 23 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm ẩm và đường kính vào

nồng độ tinh bột của các mẫu sau đông khô

3.6 Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của nguyên

liệu trong thời gian bảo quản

39

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi khuẩn probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch… [33] Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… [58] Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật… là các yếu tố làm giảm số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột Ngoài ra, các thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic [46]

Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật phù hợp và có thể chất thích hợp Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra những biện pháp làm tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn trước điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng Một trong những phương pháp phổ biến để bảo quản chế phẩm sinh học là đông khô Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp bảo

vệ chế phẩm khỏi độ ẩm chứ không bảo vệ chúng khỏi các yếu tố khác của môi trường [40] Vì vậy, phương pháp vi nang hóa đã được nghiên cứu, ứng dụng giúp cách ly tế bào vi khuẩn với môi trường bất lợi nhằm giảm lượng vi sinh vật mất đi Ngoài ra, sử dụng các tá dược bảo vệ cũng là một trong những phương pháp khả thi

và đang được áp dụng rộng rãi Việc sử dụng tinh bột làm tá dược bảo vệ để tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật và cải thiện thể chất của nguyên liệu probiotic sau đông khô ở dạng vi nang là một hướng nghiên cứu đáng chú ý

Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong

quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus” được thực

hiện với các mục tiêu cụ thể sau:

1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic

dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô

2 Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic

1.1.1 Đặc điểm của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic (lactic acid bacteria – LAB) có thể được định nghĩa là một nhóm vi khuẩn Gram dương, gồm các trực khuẩn và cầu khuẩn không sinh bào tử, không ưa khí (non-aerobic) nhưng chịu oxy (aerotolerant), sinh ra acid lactic là sản phẩm chính khi lên men carbohydrat [26] Năm 1857, Louis Pasteur đã tìm ra từ sữa

bị chua các VSV lên men lactic thuộc họ Lactobacteriaceae (ngày nay gọi là

Lactobacterium) Năm 1873, J Lister lần đầu tiên phân lập được một loài vi khuẩn

đặt tên là Bacterium lactis (hay còn gọi là Lactococcus lactis) và ngành công nghiệp

lên men nhờ VK lactic đã được hình thành từ năm 1881 Những nghiên cứu quan trọng trong sự phân loại VK lactic đã cho thấy có nét tương tự giữa VK lactic từ sữa chua và VK lactic trong các sản phẩm chứa acid lactic khác như rượu vang, các sản phẩm muối chua và các loại VK lactic có ích trong đường ruột [60]

LAB gồm nhiều chi, trong đó tiêu biểu nhất là các chi Lactobacillus,

Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [26] Có 2 cách chính để phân loại

LAB Cách phân loại thứ nhất dựa trên hình thái, chia LAB làm 2 nhóm chính là trực khuẩn và cầu khuẩn Cách phân loại thứ 2 dựa trên kiểu lên men lactic, chia LAB làm 2 nhóm chính là nhóm vi khuẩn lactic lên men đồng hình (homofermentative LAB) và nhóm vi khuẩn lactic lên men dị hình (heterofermentative LAB) [26]

 Lên men đồng hình

Trong lên men đồng hình, sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men chủ yếu

là acid lactic, chiếm khoảng 90 - 98%, các sản phẩm khác chỉ xuất hiện dưới dạng vết rất nhỏ Quá trình phân giải glucose, acid lactic được tạo ra theo con đường EMP (con đường Embden - Mayerhoff - Parnas) [5] Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn

lactic lên men đồng hình là các chi Streptococcus và Lactococcus [30]

 Lên men dị hình:

Trong lên men dị hình, nhiều sản phẩm khác nhau được tạo thành, bên cạnh

acid lactic còn có một lượng đáng kể các sản phẩm khác như acid acetic, acid formic, acid succinic, ethanol, CO2 [26] [30] [52] Tiêu biểu cho nhóm vi khuẩn

lactic lên men dị hình là chi Leuconostoc và một số loài thuộc chi Lactobacillus như các loài L brevis, L kefir… [5] [30]

Vi khuẩn lactic có thể tồn tại ở dạng các tế bào đơn độc hoặc liên kết tạo chuỗi Hình dạng và kích thước của vi khuẩn lactic khá đa dạng: có thể là hình cầu hoặc hình que, đường kính các loại cầu khuẩn lactic thường từ 0,5 - 1,5µm, trực khuẩn 1 - 8µm LAB hầu hết không di động, catalase âm tính, tỉ lệ G+C thấp dưới 50% [52] LAB là các vi khuẩn ưa ấm và chịu nhiệt, nhiệt độ sinh trưởng tối ưu tùy từng loài dao động từ 28 đến 45oC [5] Nhóm vi khuẩn này có khả năng sinh trưởng trong điều kiện pH thấp từ 4,5 - 6,8; pH tối ưu của chúng là từ 3,5 - 5 LAB có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, khi lên men cần các vitamin, acid amin và peptid ngắn Nguồn carbon là glucose, fructose, lactose, maltose, sucrose; một số chủng vi khuẩn

có thể sử dụng tinh bột như L amylophilus và L amylovorus [5]

LAB phân bố rộng rãi trong nhiều hệ sinh thái, thường được tìm thấy trong thực phẩm (các sản phẩm từ sữa, thịt lên men, rau quả…), thực vật, trong đường tiêu hóa, hô hấp và sinh dục của người và động vật [52]

LAB có lịch sử ứng dụng lâu đời trong thực phẩm lên men Các vi khuẩn lactic sinh trưởng, phát triển và sản sinh ra acid lactic và các loại acid hữu cơ khác làm giảm pH, chống lại hiện tượng thối rữa rau quả, thịt cá, sữa; đồng thời làm tăng hương vị, tăng thời gian bảo quản và thời gian sử dụng sản phẩm được lâu hơn [26] Trong y dược, nhiều loài LAB đã được sử dụng làm probiotic để cải thiện và nâng cao sức khỏe với rất nhiều tác dụng trị liệu đáng chú ý như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, điều trị tiêu chảy, tăng cường đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol máu, giảm nguy cơ mắc ung thư… [52]

1.1.2 Loài Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ

phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật L acidophilus nằm trong chi Lactobacillus,

là chi lớn nhất của họ vi khuẩn lactic, với rất nhiều chủng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất [24]

L acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 - 0,9µm, dài 1,5 -

6,0µm, tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi hay chuỗi ngắn, không sinh bào tử, kỵ khí không bắt buộc, có khả năng chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 37ºC, không phát triển trong khoảng 20 - 22ºC hoặc ở nhiệt độ cao hơn 48ºC [2] [12] [51]

L acidophilus có khả năng sống 2 ngày trong dịch vị, 5 ngày trong dịch mật,

8 ngày trong dịch tràng và có khả năng kháng được 40 loại kháng sinh [8] L

acidophilus đóng vai trò sinh lý quan trọng như tổng hợp các vitamin Ngoài ra,

chúng có khả năng sản xuất acid lactic và các chất diệt khuẩn như Lactocidin,

Bacteriocin [8] L acidophilus ngăn cản sự xâm nhập và ức chế tăng sinh các vi

khuẩn gây bệnh [8] [12] Chúng giúp cơ thể đề kháng với nhiễm khuẩn đường ruột,

ngăn ngừa tiêu chảy đặc biệt là tiêu chảy do kháng sinh Hơn nữa, L acidophilus

còn có tác dụng ngăn ngừa ung thư nhất là ung thư ruột kết và có ảnh hưởng nhất định đến sự lão hóa [8] [12]

L acidophilus tạo ra môi trường acid là môi trường thuận lợi cho hệ vi sinh

vật lên men đường ruột và ngược lại ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh

Gram âm Ngoài ra, L acidophilus cũng có tác dụng hoạt hóa đại thực bào nhưng mức độ yếu hơn Bifidobacterium bifidum [38]

Tuy nhiên, khả năng sống sót của L acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố:

pH, sự acid hóa trong sản phẩm lên men (trong bảo quản), nồng độ oxy hòa tan (oxy khuếch tán từ bao bì, trong môi trường nuôi cấy, bảo quản), nhiệt độ (trong bảo quản), độ ổn định của dạng khô hoặc đông khô Trong đó, nồng độ oxy hòa tan

đóng vai trò quan trọng trong việc hạn chế sự sống sót của L acidophilus Do đó, sau thời gian bảo quản, lượng L acidophilus sống sót sẽ bị giảm đáng kể [32] Hiện nay, L acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm men tiêu

hóa như Antibio, Lacbio pro, Kidlac… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa

do dùng kháng sinh dài ngày, hoặc các trường hợp tiêu chảy, đầy bụng, khó tiêu, trẻ

kém ăn, chậm lớn

Hình 1.1: Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus

1.2 Tổng quan về vi nang hóa probiotic

1.2.1 Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic

a Khái niệm

Vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định tế bào được sử dụng rộng rãi hiện nay Phương pháp sử dụng các chất tạo màng (gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, alginat, chitosan, cellulose… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các tế bào,

cơ thể vi sinh vật sống trong các nang nhỏ [6]

b Đặc điểm

Vi nang có cấu tạo giống như một màng bán thấm hình cầu, mảnh và có lớp thành bảo vệ vững chắc Vi khuẩn được bao giải phóng theo các cơ chế: gãy vỡ màng, hòa tan màng và khuếch tán qua màng [32] Mỗi loại vật liệu bao vi nang và mỗi loại tế bào sống lại hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều kiện để tạo thành vi nang như: pH, nhiệt độ, thời gian…

Vi nang hóa không làm tổn hại đến các tế bào sống mà còn bảo vệ tế bào Vi nang hóa cho phép cố định lượng lớn tế bào sống [59] Độ bền cơ học của lớp màng bao vi nang là một đặc điểm quan trọng Màng phải có độ bền tương đối để có thể bảo vệ được các tế bào sống, tuy nhiên nó lại không được quá vững chắc vì như thế

sẽ ảnh hưởng đến khả năng phóng thích tế bào khi cần thiết Kích thước hạt vi nang

cũng là đặc điểm cần lưu ý Giữa kích thước hạt, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích tế bào có mối quan hệ với nhau Kích thước hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ tế bào sống càng cao, nhưng khả năng phóng thích tế bào càng khó Ngược lại, kích thước hạt càng nhỏ thì độ bền càng thấp, khả năng bảo vệ tế bào sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích tế bào sẽ dễ dàng hơn Ngoài ra còn có một số đặc điểm khác cần chú ý như: sự mài mòn của các hạt vi nang do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn của hạt… [6] [32]

1.2.2 Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa

a Ưu điểm

Vi nang hóa có khả năng tạo ra mật độ vi sinh vật lớn do có thể cố định lượng lớn tế bào sống Hạt vi nang như tấm áo choàng giúp tế bào cách ly với môi trường xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng tế bào, bằng cách này các tế bào sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các môi trường khắc nghiệt như pH thấp, muối mật, sốc nhiệt Ngoài ra, vi nang hóa cũng giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt các chất ức chế trong môi trường lên men Do đó, vi nang hóa làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng thời gian bảo quản chủng, giống [16] [59]

Màng bao vi nang giống như một rào chắn hạn chế giải phóng tế bào, giảm thiểu sự nhiễm bẩn, bảo vệ tế bào chống lại tác nhân gây hại, từ đó đảm bảo cho quá trình lên men không bị tạp nhiễm, hư hại Lớp màng bao có thể được thiết kế để bảo

vệ và giải phóng vi khuẩn ở những điều kiện môi trường khác nhau cho phép kiểm soát giải phóng vi khuẩn [16] [59]

Vi nang hóa có thể tạo ra các gradien nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm, nồng độ oxy hòa tan, pH môi trường lên men… từ đó có thể tạo ra các môi trường khác nhau cho tế bào trong các lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng khác nhau Vi nang hóa cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [6] [59]

Trong các ngành sản xuất, đặc biệt là ngành sản xuất các sản phẩm liên quan đến probiotic, thì việc vi nang hóa tế bào có ý nghĩa rất quan trọng, giúp tăng độ ổn định, thời gian bảo quản, kiểm soát giải phóng và cải thiện về mặt cảm quan cho sản phẩm Trong các ngành thực phẩm sản xuất các sản phẩm lên men như bia, rượu… thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những lựa chọn để cố định tế bào vi sinh vật sử dụng trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng vi sinh vật tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn [16] [32]

b Nhược điểm

Mặc dù có nhiều ưu điểm đáng chú ý, song vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược điểm Trong quá trình trao đổi chất, tế bào vi sinh vật sản sinh ra nhiều enzym trong đó có những enzym có thể cho xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp vật liệu vi nang và cả chính tế bào Để giải quyết vấn đề này phải chọn lựa giống vi sinh vật thích hợp không tạo ra các enzym không mong muốn mà vẫn đảm bảo hoạt tính của các enzym mong muốn [6] [59]

Đa số các vật liệu vi nang như gelatin, thạch… đều là các nguồn dinh dưỡng

mà vi sinh vật có thể tiêu hóa được Điều này khá nghiêm trọng vì như thế vi sinh vật được vi gói bên trong hoặc vi sinh vật tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho lớp vi nang bị rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể Có bằng chứng cho thấy một số chủng vi khuẩn có khả năng tiêu hóa, sử dụng chính vật liệu vi nang Vì vậy, mỗi chủng vi sinh vật ta phải nghiên cứu vật liệu vi nang phù hợp nhất cho đối tượng vi sinh vật đó

1.2.3 Phương pháp tách pha đông tụ

a Nguyên tắc

Tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang Từ dung dịch keo trong một dung môi thích hợp, tiến hành các tác động nhằm thay đổi độ tan của nó, kết quả là một lượng đáng kể keo được tách ra thành pha mới Như vậy hệ trở thành hai pha, một pha có nồng độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ

(coacervat) Sau đó, các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ trên bề mặt chất cần bao gói tạo thành lớp màng bao [4] [15]

b Phân loại

Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ đơn giản, nếu sử dụng nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ phức hợp [4] [15]

Tách pha đông tụ đơn giản là quá trình loại nước của các chất keo thân

nước dùng trong hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo Phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose) Quá trình làm giảm độ tan của chất keo có thể bằng các cách sau: thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol…), thêm vào một

muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [55]

Tách pha đông tụ phức hợp là quá trình tương tác giữa phân tử tích điện

âm và tích điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử, có thể do sự thay đổi nồng độ các chất tan cao phân tử hoặc thay đổi pH Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [4] [15] [55]

Tách pha còn có thể được thực hiện do thêm vào một polyme khác không tương đồng, do thêm vào một dung môi thứ hai, do sự hóa muối (đông tụ thông thường), hoặc do tương tác giữa các polyme… [4]

Tách pha do sự hóa muối (đông tụ thông thường)

Tách pha do sự hóa muối được thực hiện theo nguyên tắc sau: khi thêm dung

dịch đậm đặc hoặc muối điện ly mạnh (muối vô cơ) vào hệ chế tạo vi nang sẽ tạo thành hai pha, kết quả là một pha trong đó sẽ trở nên bão hòa các tiểu phân keo

Kỹ thuật đông tụ hóa muối hay còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion hóa tạo gel (ionic gelation method, ionotropic gelation techniques) để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel) Phương pháp này thường hay sử dụng các polyme

có nguồn gốc tự nhiên, có tính tương thích sinh học cao như alginat, chitosan, gôm gellan… Trong phương pháp này, các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy dược

chất hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn Hydrogel được bào chế bằng hai kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt và kỹ thuật phun đông tụ [45]

1.2.4 Alginat

a Cấu tạo, nguồn gốc

Alginat là tên gọi chung cho các muối của acid alginic Acid alginic là một heteropolyme saccharid mạch thẳng, cấu tạo từ hai gốc uronic là acid α-L-guluronic

và acid β-D-mannuronic nối với nhau bằng liên kết 1-4-glucosid

Alginat được sản xuất từ tảo nâu Phaeophyta, trong tảo các acid chủ yếu ở dạng muối hỗn hợp (Na, K, Mg, Ca) [42]

b Tính chất

Alginat có tính ưa nước, tương hợp sinh học cao, rẻ tiền và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Alginat có hai tính chất quan trọng là độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel [42]

Độ nhớt của dung dịch alginat phụ thuộc vào số lượng nhánh của phân tử alginat Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch còn thay đổi tùy theo nồng độ, nhiệt độ, pH

và sự có mặt của ion kim loại [18] [29]

Dung dịch alginat có khả năng tạo gel khi phản ứng với các ion kim loại hóa trị II, III; sự tạo gel được giải thích qua mô hình vỉ trứng Bình thường trong dung dịch alginat tồn tại block M là các dải hẹp và block G là các dải gấp khúc Khi có mặt ion kim loại đa hóa trị (Ca2+, Ba2+, Sr2+ ) ở nồng độ thích hợp thì sự tạo gel xảy ra Các phân tử alginat sắp xếp lại song song nhau, các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng Các ion Ca2+ khớp vào các khoảng trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều Với cấu trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống lại những yếu tố bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vi sinh vật được bao theo hướng kiểm soát được [42]

Hình 1.2: Cấu trúc của acid alginic Hình 1.3: Cấu trúc phân tử Ca-alginat

c Ưu, nhược điểm của vật liệu bao vi nang alginat

Sử dụng alginat làm vật liệu bao vi nang có nhiều ưu điểm Alginat là vật liệu an toàn, không độc với cơ thể, có khả năng tạo chất kết dính với Calci clorid [32] Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định cao Quá trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản,

có thể thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong Hạt vi nang tạo thành đẹp và tương đối đồng đều [18] [29]

Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào vi sinh vật cũng có một số nhược điểm Độ bền của gel phụ thuộc vào một số ion hóa trị một và các chất tạo phức với ion Calci Vì vậy, khi sử dụng lên men lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm giảm độ bền của gel Calci alginat và làm cho tế bào thoát ra ngoài Ngoài ra, trong quá trình vi nang hóa, cần phải khuấy để phân phối đều tế bào được

vi gói nên khá tốn kém [18] [29]

d Ứng dụng của alginat

Alginat được sử dụng trong vi nang hóa tế bào vi sinh vật sống Muối Natri của alginat tan trong nước được phối hợp với các tế bào vi sinh vật sống, sau đó nhỏ giọt vào dung dịch Calci clorid sẽ tạo thành hạt gel Ca-alginat bao bọc tế bào sống bên trong Ngoài ra, alginat cũng được sử dụng trong kỹ thuật cố định tế bào và cố định enzym [22] [37]

Trong công nghệ bào chế dược phẩm, alginat được sử dụng làm tá dược rã,

tá dược dính trong viên nén, tá dược kiểm soát giải phóng trong viên giải phóng kéo dài, tá dược độn trong viên nang Ngoài ra, Natri alginat còn được sử dụng làm tá dược tăng độ nhớt, ổn định thể chất của nhũ tương, hỗn dịch trong các chế phẩm dạng kem, gel, bột nhão dùng tại chỗ… [42]

1.2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa

Vi nang hóa là một trong những phương pháp mới và hiệu quả nhất đang được nghiên cứu và áp dụng để cải thiện khả năng tồn tại của vi sinh vật trong chế phẩm probiotic Sheu và Marshall (1993) đã nghiên cứu quá trình đông lạnh sữa, vi

khuẩn lactobacilli trong sữa được vi gói trong nang Calci alginat cho thấy khả năng

sống sót tăng hơn 40% so với khi ở dạng tự do [53] Kebary và cộng sự (1998) cũng

báo cáo rằng vi nang hóa Bifidobacterium bifidum và B infantis sử dụng alginat

hoặc kappa-carrageenan đã cải thiện đáng kể khả năng sống sót của VSV trong sữa đông lạnh trong suốt thời gian lưu trữ (-20ºC trong 10 tuần) [35] Khalida và cộng

sự (2000) đã báo cáo, vi nang hóa L acidophilus và Bifidobacterium spp trong

nang Calci alginat phối hợp tinh bột cải thiện khả năng sống sót của VSV trong sữa chua sau khi bảo quản trong 8 tuần ở 4ºC [36]

Tại Việt Nam, Đỗ Quốc Cường (2009) đã tiến hành vi gói L acidophilus

trong nang gelatin – alginat và cho thấy khả năng tồn tại của của VK ở dạng vi nang trong môi trường dạ dày nhân tạo tốt hơn dạng tự do [1] Quách Thu Trang (2010)

đã báo cáo, L acidophilus trong hạt vi nang Calci alginat có sử dụng sữa gầy làm tá

dược bảo vệ cho tỉ lệ sống sót sau đông khô và sau 4 tuần bảo quản ở 4ºC cao hơn đáng kể so với không vi nang hóa [9]

Một số chế phẩm probiotic dạng vi nang lưu hành trên thị trường: Probiocap

(chứa L acidophilus) của viện Rosell/Lallemand The Americas, Canada; Cernivet (chứa E faecium SF 68) của Cerbios-Pharma; Geneflora (chứa Lactobacillus

sporogenes) của công ty America’s Bio-Plus… [32]

1.3 Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật

1.3.1 Lý thuyết đông khô

Đông khô được định nghĩa là một quy trình tạo sự ổn định mà trong đó vật

cần đông khô được làm đông lạnh trước, tiếp theo lượng dung môi có trong vật (dung môi thường là nước) được loại đi nhờ quá trình thăng hoa, sau đó là quá trình khử ẩm liên kết còn lại đến giá trị ngăn cản vi sinh vật phát triển hoặc xúc tác các phản ứng hóa học [39] [41]

Đông khô từ nhiều năm nay đã được sử dụng để ổn định khả năng sống sót của vi sinh vật trong thời gian bảo quản Nhờ đông khô, tế bào vi sinh vật được bảo

vệ trong hàng thập kỷ mà không suy giảm số lượng sống sót Ưu điểm lớn nhất của đông khô vi sinh vật là ổn định khả năng sống sót của vi sinh vật và làm quá trình vận chuyển, bảo quản trở nên dễ dàng hơn [14] [41]

Quá trình đông khô vi sinh vật tuy có nhiều ưu điểm nhưng cũng là một trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá trình tạo nguyên liệu và chế phẩm probiotic Đặc biệt, giai đoạn tiền đông là nguyên nhân gây áp lực cho thành tế bào vi khuẩn Đông lạnh làm cho lớp lipid màng tế bào dễ

bị tổn thương Một nghiên cứu khác lại cho rằng sự thay đổi hình thái tự nhiên của lipid màng và sự thay đổi cấu trúc của các protein nhạy cảm là nguyên nhân chính gây ra sự suy giảm số lượng tế bào trong quá trình đông khô [25] Cũng có tài liệu cho rằng việc hình thành phân tử đá nội phân tử có thể là nguyên nhân gây phá vỡ màng tế bào [39]

1.3.2 Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật

Một trong những phương pháp để tăng số lượng vi sinh vật sống sót sau đông khô là bổ sung vào nguyên liệu đông khô các tá dược bảo vệ Các tá dược này được thêm vào nhằm mục đích bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật trong quá trình làm khô Khả năng bảo vệ phụ thuộc vào bản chất của tá dược Ngoài ra, nồng độ tá dược cũng đóng vai trò quan trọng giúp tăng khả năng sống sót của VSV [31] [39]

Các tá dược thường dùng trong đông khô vi sinh vật gồm: nhóm carbohydrat (sucrose, trehalose…), nhóm polyme (gelatin, polyethylen glycol, tinh bột…), nhóm protein (sữa gầy, trypsin…), nhóm polyol/alcohol (mannitol, glycerol…), nhóm

amino acid (natri glutamat, proline…), các chất chống oxy hóa (ascorbic acid, natri thiosulfat…), và một số chất khác (natri acetat…) [41]

1.3.3 Tinh bột

a Cấu tạo, nguồn gốc

Trong tự nhiên, tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến và dồi dào, chỉ đứng sau cellulose Người ta thấy tinh bột có trong cây xanh, rễ, cành, hạt, củ và quả Walton đã sưu tầm trên 300 nghiên cứu về tinh bột, tất cả đều cho thấy tinh bột của mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ Amylose (Am) và Amylopectin (Ap) [11] [27] Cả hai cấu tử này đều được cấu tạo từ α-D glucose Các gốc glucose trong Am kết hợp với nhau qua liên kết α-1,4-glucosid tạo nên chuỗi dài khoảng 500-2.000 đơn vị glucose, phân tử lượng trung bình 10.000-300.000 Ap có cấu trúc phân nhánh, ngoài liên kết α-1,4-glucosid còn có các liên kết α-1,6-glucosid ở điểm phân nhánh [10] Cấu trúc phân tử gồm một nhánh trung tâm, từ các nhánh này phát

ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose, phân tử lượng Ap khoảng 5×105 - 1×106 Trong những nguyên liệu khác nhau thì hàm lượng Am và

Ap cũng không giống nhau, nhưng thường tỉ lệ Am và Ap của các tinh bột bằng 1/4 Nước ta có nguồn nguyên liệu tinh bột rất đa dạng và phong phú Trong đó, sắn là loại cây lương thực có sản lượng cao và tinh bột sắn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp dược phẩm, thực phẩm… Vì vậy, ta sử dụng tinh bột sắn làm nguyên liệu trong nghiên cứu này

b Tính chất

Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan Ở môi trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose Trong môi trường

kiềm, tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn

Khi hòa tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương

phồng lên, tăng thể tích Hiện tượng này gọi là hiện tượng trương nở của tinh bột

Trên 55 - 70ºC, các hạt tinh bột trương lên do hấp thụ nước vào các nhóm hydroxyl phân cực, độ nhớt của dung dịch tăng mạnh Kéo dài thời gian xử lý nhiệt có thể

gây nổ vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan phần nào các phần tử cấu thành của tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch Nhiệt độ để phá vỡ hạt, chuyển tinh bột từ trạng thái đầu có mức độ oxy hóa khác nhau thành dung dịch keo gọi là nhiệt hồ hóa [10] [27]

c Ưu điểm

Tinh bột là một polysaccharid tự nhiên, tương thích sinh học, phân hủy sinh học Tinh bột không độc, không sinh đáp ứng miễn dịch [17] Tinh bột là tá dược độn phổ biến, giá rẻ và có thể tiêu hóa được [21] Tinh bột thường được sử dụng để

ổn định thực phẩm trong sản xuất sữa chua vì vậy tính tương hợp sinh học và độc tính của nó với vi khuẩn đã được thử nghiệm rộng rãi [40]

bảo quản [21] L acidophilus không có khả năng tiêu thụ tinh bột, vì vậy tinh bột có

thể được lựa chọn trong vi nang hóa L acidophilus

Tinh bột là nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp keo dán vì những tính chất đặc trưng của nó như tạo hình, tạo dáng, tạo khung, tạo độ dẻo, độ dai, độ đàn hồi, độ xốp và có khả năng tạo gel, tạo màng cho nhiều sản phẩm

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 1.2 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653 (Viện kiểm

nghiệm thuốc trung ương)

2.1.2 Hóa chất

Bảng 2.1: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu Tên hóa chất Nguồn gốc Tên hóa chất Nguồn gốc

Glucose Trung Quốc Triamoni citrat Trung Quốc

Pepton Ấn Độ Natri acetat Trung Quốc

Cao thịt Merk-Đức Natri citrat Trung Quốc

Cao nấm men Merk-Đức Alginat Ấn Độ

K2HPO4 Trung Quốc Calci clorid Trung Quốc

MgSO4.7H2O Trung Quốc Tinh bột sắn Việt Nam

MnSO4.4H2O Trung Quốc Thạch (Agar) Việt Nam

Natri clorid Trung Quốc Sữa gầy Trung Quốc

2.1.3 Môi trường

 MRS lỏng (MT1):

Glucose 20g Natri acetat 5g Pepton 10g K2HPO4 2g Cao thịt 10g MgSO4.7H2O 0,2g Cao nấm men 5g MnSO4.4H2O 0,05g Triamoni citrat 2g Nước máy vừa đủ 1.000ml

Bảng 2.2 Các máy móc dùng trong nghiên cứu

Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo)

Nồi hấp tiệt khuẩn ALP- Nhật

Cân phân tích Đức (Satorious)

Cân kỹ thuật Đức (Satorious)

Máy đo hàm ẩm Mỹ (Ohaus)

Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd)

Máy lắc (Vortex) Trung Quốc

 Dụng cụ

Bình nón 250, 1.000ml Giá rửa hạt

Cốc có mỏ Ống nghiệm

Ống đong Pipet chia vạch

Ống li tâm Pipet tip ( Đầu côn)

Bơm tiêm Pipetman (Pipet Eppendorf)

Đĩa petri đường kính 9cm

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô

 Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi thay đổi nồng

độ alginat

 Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông khô

2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản

 Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic

 Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic dạng vi nang

 Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan, phân tán hết các thành phần Phân chia môi trường vào các ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm 10ml MRS lỏng Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước) Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C Cấy giống vào những ống nghiệm trên Ủ các ống nghiệm đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2 trong

24 giờ ở 37±1°C [7]

2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan, phân tán hết các thành phần Đong 100ml môi trường vào bình nón dung tích phù hợp Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước) Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C Cấy giống vào những bình nón trên, mỗi bình 1 ống giống 10ml Ủ các bình nón đã được cấy giống trong tủ ấm 5% CO2

trong 24 giờ ở 37±1°C

2.3.3 Phương pháp vi nang hóa bằng alginat sử dụng kỹ thuật tách pha đông tụ

Chuẩn bị hỗn dịch gel chứa vi khuẩn: Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS lỏng ở 37±1°C trong 24 giờ trong tủ ấm 5% CO2 (phương pháp nêu trong mục 2.3.2) Dịch nuôi cấy được cho vào ống li tâm đã được hấp tiệt

trùng, đem li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút Bỏ dịch, thu sinh khối Pha dung dịch Natri alginat, hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội

Tạo hỗn dịch Ca-alginat chứa VK: Phân tán sinh khối vào dung dịch Natri alginat, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 15 phút

Tạo hỗn dịch Ca-alginat-tinh bột chứa VK: Phân tán tinh bột đã hấp tiệt trùng, sấy khô và sinh khối vào dung dịch Natri alginat, đồng nhất hóa bằng máy khuấy từ trong 15 phút

Chuẩn bị dung dịch hóa rắn: Pha dung dịch Calci clorid 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội

Tiến hành tạo vi nang: Hỗn dịch gel chứa vi sinh vật được nhỏ qua một kim tiêm, kích thước đầu kim (đường kính trong 900µm, đường kính ngoài 1400µm) xuống dung dịch Calci clorid 2% (kl/tt) tạo thành các hạt hình cầu Để yên 30 phút cho hạt ổn định, sau đó vớt lấy hạt, rửa hạt ba lần bằng dung dịch NaCl 0,9% đã hấp tiệt trùng và làm nguội Tiến hành cân khối lượng hạt và đếm số lượng VSV trong 1g hạt ướt

2.3.4 Phương pháp đông khô

 Chuẩn bị mẫu:

- Các mẫu hạt vi nang (phương pháp nêu trong mục 2.3.3) được dàn đều vào các đĩa petri đã làm sạch và tiệt khuẩn, đậy kín, sau đó đem đi tiền đông ở -80°C cho đông rắn hoàn toàn rồi tiến hành làm khô trong máy đông khô

- Các mẫu tạo nguyên liệu dạng bột:

Nuôi cấy VSV trong các bình nón chứa môi trường MRS lỏng ở 37°C trong

24 giờ trong tủ ấm 5% CO2 (phương pháp nêu trong mục 2.3.2) Dịch nuôi cấy được cho vào ống li tâm đã được hấp tiệt trùng, đem li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút Các ống li tâm được lấy khỏi máy, loại phần dịch Phần sinh khối còn lại được thêm dung dịch tá dược độn đã tiệt khuẩn và để nguội Phân tán đều sinh khối trong dung dịch tá dược độn bằng máy lắc Đổ hỗn dịch thu được vào các đĩa petri (đã làm sạch và hấp tiệt khuẩn), đậy kín, sau đó đem đi tiền đông ở -80°C cho đông rắn hoàn toàn rồi tiến hành làm khô trong máy đông khô

 Tiến hành:

Các mẫu được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu -80°C trong 24 giờ, sau đó được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô ở điều kiện khoảng -54°C, 0,055mbar trong 24 giờ

Kết thúc quá trình làm khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, cân khối lượng hạt khô

và tiến hành đếm số lượng tế bào được gói trong 1g hạt Mẫu được bảo quản trong túi polyme đựng trong lọ nhựa PE, đậy kín, để trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4°C

2.3.5 Phương pháp xác định hàm ẩm

Tiến hành đo trên thiết bị đo hàm ẩm Ohaus

Làm nhỏ mẫu cần đo hàm ẩm Cho lên mặt đĩa của thiết bị khoảng 1g mẫu, dàn đều mẫu ra mặt đĩa, đậy nắp, chạy máy Chờ máy gia nhiệt đến khi máy hiện kết quả Đọc, ghi lại số liệu hàm ẩm của mẫu hiện trên màn hình

2.3.6 Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV

 Chuẩn bị:

Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức nêu trong mục 2.1.3) Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước) Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn Lấy bình ra khỏi nồi hấp và phân phối môi trường lên các đĩa petri (đã rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô) Lớp thạch dày khoảng 2mm, bề mặt nhẵn, phẳng Chờ thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín

Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt), đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C

 Xác định số lượng VSV trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy:

- Mẫu nguyên liệu dạng hạt vi nang: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500

vòng/phút trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng đến khi vi nang rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất

- Mẫu nguyên liệu dạng bột: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội Cân chính xác khoảng 1,00g nguyên liệu rồi cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng đến khi mẫu phân tán đồng nhất

Hút chính xác 1,00ml dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào, pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng thứ nhất, lắc đều Sau

đó lại hút chính xác 1,00ml dịch đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ pha loãng cuối cùng Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5ml dịch trong các ống của 3 nồng độ pha loãng cuối cùng, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 37±1°C Sau 48 giờ đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa petri và lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc trong các đĩa ở cùng nồng độ pha loãng (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 - 300)

Số lượng VSV trong 1g nguyên liệu hoặc 1ml dịch nuôi cấy được tính theo công thức:

= × × + × + ×

×Trong đó:

X: số VSV có trong 1g hạt hoặc 1 ml dịch nuôi cấy

An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa petri cấy nồng độ pha loãng 10n

m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng (g)

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu

probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô

Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh, sử dụng tinh bột như một tá dược độn có khả năng cải thiện tính chất cơ học và sinh học của hạt vi nang Ca-alginat

sau đông khô [57] Các thí nghiệm dưới đây nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ

tinh bột đến thể chất của hạt nguyên liệu tạo thành sau đông khô và lựa chọn nồng

độ alginat và tinh bột phù hợp nhất để tạo vi nang

3.1.1 Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat

 Mục tiêu:

Khảo sát thể chất của các dạng vi nang tạo thành sau đông khô với các nồng

độ alginat khác nhau và lựa chọn nồng độ alginat thích hợp nhất

Mẫu 1: Dung dịch alginat 1% Mẫu 4: Dung dịch alginat 1% + tinh bột 10% Mẫu 2: Dung dịch alginat 2% Mẫu 5: Dung dịch alginat 2% + tinh bột 10% Mẫu 3: Dung dịch alginat 3% Mẫu 6: Dung dịch alginat 3% + tinh bột 10% Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng bột với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat 2% có hoặc không thêm tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.4)

Mẫu 7: Không thêm tinh bột Mẫu 8: Thêm tinh bột 10% (kl/tt) Các dung dịch và tá dược thêm vào đều được tiệt khuẩn bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 115 ºC trong 20 phút

Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4)