Để được coi là có tác dụng bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus acidophilus thì trước tiên tinh bột phải cho thấy khả năng cải thiện được lượng vi sinh vật sống sót sau quá trình đông khô ít nhất là so với các mẫu nguyên liệu đông khô không sử dụng tinh bột ở cùng điều kiện. Vì vậy, thí nghiệm tiếp theo được tiến hành nhằm xác định số lượng vi sinh vật sống sót của các mẫu ngay sau quá trình đông khô.
Mục tiêu:
Đánh giá ảnh hưởng của tinh bột lên lượng VSV sống sót trong mẫu nguyên liệu probiotic sau đông khô, so sánh với mẫu không sử dụng tinh bột và mẫu đông khô VSV với nước cất.
Tiến hành:
Nuôi cấy VSV trong bình nón (phương pháp nêu trong mục 2.3.2). Thu sinh khối của 20ml dịch lên men.
Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng bột với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch tá dược bảo vệ khác nhau như sau (phương pháp nêu trong mục 2.3.4).
Mẫu 1: Nước cất.
Mẫu 2: Dung dịch alginat 2%.
Mẫu 3: Dung dịch alginat 2% + tinh bột 10%.
Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat 2% có hoặc không thêm tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.3).
Mẫu 4: Không thêm tinh bột. Mẫu 5: Thêm tinh bột 10%.
Tiến hành đông khô các mẫu trên (phương pháp nêu trong mục 2.3.4). Kết thúc quá trình, lấy hết mẫu ra khỏi đĩa, tiến hành xác định số lượng vi sinh vật sống sót trong các mẫu trên bằng phương pháp pha loãng liên tục (phương pháp nêu trong mục 2.3.6). Tiến hành làm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Số lượng VSV Lactobacillus acidophilus có trong 1ml dịch nuôi cấy trước đông khô đạt 1,42×109 VSV/1ml.
Kết quả các mẫu được thể hiện trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Số lượng vi khuẩn sống sót trong 5 mẫu sau đông khô
Tá dược bảo vệ Nước cất Alginat 2% Alginat 2% + TB 10% Alginat 2% Alginat 2% + TB 10% Dạng nguyên liệu Bột Bột Bột Hạt Hạt Lượng VSV sau ĐK (cfu/ml) 9,02×105 2,79×107 7,92×107 1,04×108 3,16×108 Tỉ lệ VSV so với mẫu nước
cất (lần)
1 30,93 87,80 115,30 350,33
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của 5 mẫu sau đông khô
Nhận xét:
Từ kết quả trên cho thấy, việc phối hợp tinh bột làm tăng lượng VSV sống sót sau đông khô so với khi không thêm tinh bột. Với nguyên liệu dạng bột, khi sử
44.5 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 Nước cất (bột) Alginat (bột) Alginat-TB (bột) Alginat (hạt) Alginat-TB (hạt) S ố l ư ợ n g V S V ( lg C F U /g )
dụng tá dược bảo vệ alginat, lượng VSV sống sót sau đông khô đạt 2,79×107 cfu/ml gấp 30,93 lần so với mẫu sử dụng nước cất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Hoa (2013) [3]. Khi thêm tinh bột, lượng VSV sống sót cao hơn đạt 7,92×107 cfu/ml gấp 87,80 lần so với mẫu sử dụng nước cất. Khi tạo nguyên liệu dạng bột, lượng VSV sống sót sau đông khô khi thêm tinh bột đạt 3,16×108 cfu/ml tăng hơn so với mẫu không thêm tinh bột chỉ đạt 1,04×108 cfu/ml.
Ngoài ra, tạo nguyên liệu dạng hạt không chỉ cải thiện về mặt thể chất mà còn tăng khả năng sống sót VSV sau đông khô so với nguyên liệu dạng bột. Trong cùng điều kiện và sử dụng các tá dược độn giống nhau, với nồng độ và thể tích như nhau thì lượng VSV sống sót sau đông khô của dạng hạt vi nang đều lớn hơn so với dạng bột. Khi sử dụng alginat phối hợp tinh bột để tạo nguyên liệu dạng vi nang cho kết quả bảo vệ VSV trong đông khô tốt nhất. Lượng VSV sống sót sau đông khô đạt 3,16×108 cfu/ml gấp 350,33 lần so với mẫu nguyên liệu dạng bột sử dụng nước cất.
Như vậy, việc tạo nguyên liệu dạng vi nang đã góp phần làm tăng lượng VSV sống sót sau đông khô so với nguyên liệu dạng bột và việc phối hợp tinh bột cũng góp phần bảo vệ VSV trong quá trình đông khô.
Kết quả trên có thể giải thích như sau: Đông khô là phương pháp loại nước được sử dụng rộng rãi để bảo quản tế bào. Tuy nhiên, đã có một số báo cáo liên quan đến việc tác dụng phụ của đông khô trên cấu trúc và chức năng của tế bào, cuối cùng dẫn đến giảm lượng tế bào sống sót [25]. Một trong số các tác động của quá trình đông khô là sự biến tính protein và tổn thương tế bào và màng tế bào. Quá trình vi nang hóa tạo ra lớp màng bao bảo vệ tế bào VSV khỏi điều kiện bất lợi của môi trường trong quá trình đông khô. Vì vậy, nguyên liệu dạng vi nang cải thiện khả năng sống sót của tế bào VSV hơn so với nguyên liệu ở dạng bột. Tuy nhiên, Champagne và các cộng sự (1992) đã phát hiện ra rằng chỉ sử dụng mạng lưới hydrogel Ca- alginat không đủ để bảo vệ các tế bào đóng gói [20]. Vì vậy, việc phối hợp tá dược để tăng khả năng bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô là cần thiết. Sau đông khô, tế bào đóng gói trong vi nang không sử dụng tinh bột có tỉ lệ sống thấp đạt 1,04×108 cfu/ml. Trong khi đó, sử dụng tinh bột làm tăng lượng tế bào
đóng gói sống sót sau đông khô lên 3,16×108 cfu/ml. Việc sử dụng phối hợp tinh bột giúp cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic trong hạt vi nang sau đông khô, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Eng-Seng Chan và cộng sự (2011); M.J. Martin và cộng sự (2013) [21] [40].
Sự khác biệt về khả năng sống sót của tế bào đóng gói hạt Ca-alginat có và không sử dụng tinh bột sau đông khô có thể do các nguyên nhân sau:
- Các hạt không sử dụng tinh bột có mức độ co rút cao hơn, gây ra các tác động vật lý lên tế bào. Ngoài ra, hạt không phối hợp tinh bột có độ xốp cao hơn nên diện tích tiếp xúc của tế bào với môi trường trong quá trình đông khô cao hơn. Chính sự tiếp xúc này là nguyên nhân làm giảm lượng tế bào sống sót, kể từ khi có báo cáo rằng xác suất tử vong trong đông khô tỷ lệ thuận với diện tích bề mặt tiếp xúc (Bozo Glu và cộng sự, 1987) [19].
- Việc bổ sung các chất độn tạo môi trường có mật độ dày đặc làm tăng khả năng bảo vệ các tế bào chống lại các yếu tố ảnh hưởng của quá trình đông khô.
- Tinh bột cũng là một trong số tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô. Cơ chế bảo vệ của tinh bột là làm giảm lượng nước liên kết trong mẫu [41].
Ngoài ra, hạt vi nang có sử dụng tinh bột có độ ẩm sau đông khô thấp hơn giúp VSV ổn định hơn trong quá trình bảo quản.