Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1.000 lần: Vi sinh vật bắt màu tím, hình que, xếp thành đôi, chuỗi ngắn hoặc đứng đơn độc (Trực khuẩn Gram dương).
c. Phản ứng catalase:
Li tâm 2ml hỗn dịch sinh khối thu được ở tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch, thu sinh khối. Thêm vào sinh khối khoảng 2ml dung dịch oxy già 3%, phải không thấy có bọt khí nổi lên (phản ứng catalase âm tính).
d. Định danh vi sinh vật bằng kit API 50 CH:
- Nguyên tắc: Mỗi vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus có khả năng lên men carbon hydrat khác nhau. Môi trường API 50 CHL chứa chất dinh dưỡng thích hợp và chất chỉ thị tía bromocresol. Mỗi giếng của kit API 50 CH chứa một loại carbon hydrat khác nhau. Nếu vi sinh vật lên men carbon hydrat trong giếng thì sinh acid lactic và làm giảm pH môi trường, kết quả là làm đổi màu của môi trường.
- Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút chính xác 2,0ml dung dịch bari clorid 0,048M vào bình định mức dung tích 100ml và pha loãng bằng dung dịch acid sulfuric 0,18M vừa đủ đến vạch, trộn đều. Độ hấp thụ của độ đục chuẩn số 2 khi đo ở bước sóng 625nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 0,18M làm mẫu trắng, phải nằm trong khoảng 0,32 - 0,40. Độ đục chuẩn chỉ dùng trong vòng 3 tháng kể từ ngày pha.
- Hỗn dịch gốc: Li tâm hỗn dịch vi sinh vật nuôi cấy trong 24 giờ trong môi trường MRS lỏng như đã mô tả ở trên với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút. Loại dịch, thu sinh khối. Rửa sinh khối bằng cách thêm 5ml dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vào, đồng nhất hóa bằng máy lắc. Tiếp tục li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch và thu sinh khối. Thêm 1ml nước cất vô trùng, phân tán đều sinh khối bằng máy lắc.
- Môi trường API 50 CHL (BioMérieux, Pháp):
Polypepton 10,0g Cao nấm men 5,0g Tween 80 1,0ml Dikali hydrophosphat 2,0g Natri acetat 5,0g Diamoni citrat 2,0g Magie sulfat 0,20g Mangan sulfat 0,05g Bromocresol tía 0,17g Nước cất vừa đủ 1.000ml pH sau tiệt trùng 6,7-7,1 - Tiến hành:
Nhỏ từ từ từng giọt hỗn dịch gốc ở trên vào một ống nghiệm đã chứa sẵn 5ml nước cất vô trùng đến khi độ đục trong ống tương đương với độ đục chuẩn
McFarland số 2 (so sánh bằng mắt thường). Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc đã cho vào ống nghiệm trên. Cho vào 10ml môi trường API 50 CHL số giọt hỗn dịch gốc gấp đôi số giọt đã cho vào ống nghiệm trên và lắc đều. Nhỏ khoảng 20µl môi trường API 50 CHL đã cấy vi sinh vật vào các giếng của kit, bắt đầu từ giếng số 0 đến giếng 49, chú ý tránh tạo bọt khí trong giếng. Sau đó nhỏ dung dịch dầu parafin vô trùng lên trên bề mặt giếng và ủ ở 37±1°C. Đọc kết quả sau 24 và 48 giờ nuôi cấy.
- Cách đọc kết quả:
Giếng âm tính nếu có màu tím giống giếng chứng âm tính số 0. Giếng dương tính nếu môi trường trong giếng chuyển từ màu tím sang màu vàng. Riêng giếng số 25, nếu môi trường chuyển từ tím sang đen là dương tính.
Ghi kết quả vào phiếu theo dõi kết quả sau 24 giờ và 48 giờ. Nhập số liệu vào phần mềm Apiweb để định danh chính xác vi sinh vật trong chế phẩm.
2.3. Kim loại nặng: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 7.4.7.
Dùng 2,0ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu để chuẩn bị mẫu đối chiếu.
2.4. Nước: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 6.6.
2.5. Định lượng:
2.5.1. Thuốc thử: Theo DĐVN III.
Công thức môi trường MRS lỏng:
Glucose 20g Natri acetat 5g
Pepton 10g K2HPO4 2g
Cao thịt 10g MgSO4.7H2O 0,2g Cao nấm men 5g MnSO4.4H2O 0,05g Triamoni citrat 2g Nước máy vđ 1.000ml pH 6,8-7,0 Môi trường MRS đặc = Môi trường MRS lỏng + thạch agar (25g/1.000ml môi trường).
2.5.2. Cách thử: Phương pháp pha loãng liên tục.
- Chuẩn bị: Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng. Hòa tan các thành phần tan trong nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Đậy kín bằng nút bông (bông không thấm nước). Hấp tiệt khuẩn môi trường ở 115°C trong 20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Lấy bình ra khỏi nồi hấp và phân phối môi trường lên các đĩa Petri đã rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô. Lớp thạch dày khoảng 2mm, bề mặt nhẵn, phẳng. Chờ thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín.
Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt), đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115°C trong 20 phút, sau đó để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C.
- Phá hạt: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng ở 115°C trong 20 phút, để nguội. Cân chính xác khoảng 1,00g hạt vi nang Ca-alginat-tinh bột cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút trong khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng đến khi vi nang rã hoàn toàn, phân tán đồng nhất.
- Đếm số lượng tế bào: Hút chính xác 1,00ml dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào, pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% đã tiệt trùng thứ nhất, lắc đều. Sau đó lại hút chính xác 1,00ml dịch đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc đều. Tiếp tục pha loãng như vậy cho đến nồng độ pha loãng cuối cùng. Cấy trải lên mỗi đĩa Petri 0,5ml dịch trong các ống tại ba nồng độ pha loãng cuối cùng, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa. Ủ các đĩa trong tủ ấm 5% CO2 ở 37±1°C. Sau 48 giờ đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên mỗi đĩa Petri và lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc của các đĩa ở cùng nồng độ pha loãng (chỉ đếm các đĩa petri có số khuẩn lạc nằm trong khoảng 30 - 300).
- Tính kết quả: Số lượng VSV trong 1g nguyên liệu được tính theo công thức:
= × × + × + ×
× (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trong đó:
X: số VSV có trong 1g hạt.
An: số khuẩn lạc trung bình trong các đĩa petri cấy nồng độ pha loãng 10n. m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng (g).
2.6. Độ nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 10.7.