Nghiên cứu sử dụng alginat phối hợp tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo vi nang chứa lactobacillus acidophilus

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Định nghĩa Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Theo nghĩa gốc, biotic hay biosis từ chữ life là đời sống, và pro là thân thiện, nên probiotic có thể hiểu theo nghĩa cái gì thân thiện với đời sống con người. Hiểu sát nghĩa hơn, đó là chất bổ sung dinh dưỡng chứa những vi khuẩn hay vi nấm có ích 27, 40. Năm 1907, Elie Metchnikoff – người Nga, đạt giải Nobel – đã chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật đường ruột. Ông giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Côdắc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống” – The Prolongation of life (1908). Có thể nói Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về probiotic. Định nghĩa về probiotic phát triển theo thời gian. Lily và Stillwell đã mô tả probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác 41. Phạm vi của định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm 70 bao gồm dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển vi sinh vật. Probiotic là những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ 41. Vì vậy, khái niệm “Probiotic” được ứng dụng để mô tả “cơ quan và chất mà góp phần vào cân bằng hệ vi sinh vật ruột”. Định nghĩa chung này sau đó được làm chính xác hơn bởi Fuller vào năm 1989, theo ông “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” 35.

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LỆ QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LỆ QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân DS. Trần Văn Thái Nơi thực hiện: Bộ môn Công Nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này đƣợc thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – bộ môn Công nghiệp Dƣợc. Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình. Trƣớc tiên, với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới T.S. Đàm Thanh Xuân - ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn DS.Lê Ngọc Khánh và DS.Trần Văn Thái đã nhiệt tình giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi thực hiện đề tài. Đồng thời, xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dƣợc trong suốt quá trình làm đề tài nghiên cứu và thực nghiệm tại bộ môn. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu nhà trƣờng và toàn thể thầy cô giảng viên Đại học Dƣợc Hà Nội đã tạo điều kiện và truyền đạt cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình và bạn bè, những ngƣời đã hết sức quan tâm và hỗ trợ tôi trong cuộc sống và học tập. Do thời gian làm thực nghiệm cũng nhƣ kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận đƣợc sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận đƣợc hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Bùi Thị Lệ Quyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC 2 1.1.1. Khái niệm về probiotic 2 1.1.2. Vai trò của probiotic 2 1.1.3. Các chủng probiotic phổ biến 3 1.1.4. Các thế hệ probiotic 3 1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ Lactobacillus acidophilus 4 1.2.1. Đặc điểm hình thái 4 1.2.2. Tác dụng 4 1.3. PHƢƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 5 1.3.1. Khái niệm đông khô 5 1.3.2. Ưu điểm của đông khô 5 1.3.3. Một số tá dược dùng bảo vệ trong đông khô 6 1.4. VI NANG HOÁ 6 1.4.1. Khái niệm 6 1.4.2. Đặc điểm 6 1.4.3. Phương pháp vi nang hoá bằng tách pha đông tụ 7 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 12 2.1.1. Chủng vi sinh vật 12 2.1.2. Hóa chất 12 2.1.3. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 12 2.1.4. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu 12 2.1.5. Máy móc, dụng cụ 13 2.2.Nội dung nghiên cứu 14 2.2.1. Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bộtvới alginat. 14 2.2.2. Khảo sát khả năng bảo vệ L. acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hoá. 14 2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu 14 2.3.1. Phương pháp tiệt khuẩn 14 2.3.2. Phương pháp nhân giống 14 2.3.3. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 15 2.3.4. Phương pháp tạo hạt vi nang chứa L.acidophilus 15 2.3.5. Phương pháp đông khô 16 2.3.6. Phương pháp xác định hàm ẩm 16 2.3.7. Phương pháp xác định đường kính hạt vi nang 16 2.3.8. Phương pháp xác định độ trương nở của hạt vi nang 17 2.3.9. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật trong hạt vi nang theo nguyên tắc pha loãng liên tục 18 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bột vớialginat 20 3.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến thể chất hạt vi nang phối hợp tinh bột với alginat 20 3.1.2. So sánh khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy 22 3.2. Khảo sát khả năng bảo vệ L. acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng 28 3.2.1. Khảo sát khả năng bao gói và giải phóng vi sinh vật của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đường tiêu hóa mô phỏng 28 3.2.2. So sánh tác dụng bảo vệ L. acidophilus của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ATCC (American Type Culture Collection) ACE CFU (Colony-Forming Units) Cps (Cycles per second) h LAB (Lactic acid bacterium) L. acidophilus L. gasseri L. rhamnosus B. longum B. bifidum MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) MT VSV WHO (World health organization) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ : Acetylcholinesterase : Số đơn vị khuẩn lạc : Vòng/giây : giờ : Vi khuẩn lactic : Lactobacillus acidophilus : Lactobacillus gaseri : Lactobacillus rhamnosus : Bifidobacterium longum : Bifidobacterium bifidum : Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lactic : Môi trƣờng : Vi sinh vật : Tổ chức y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 2.1. Các hoá chất dùng trong nghiên cứu 12 2 Bảng 2.2. Các máy móc dùng trong nghiên cứu 13 3 Bảng 3.1. So sánh 2 phƣơng pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm và Tyndall về một số chỉ tiêu 20 4 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của tinh bột và sữa gầy đến thể chất hạt vi nang tạo thành 23 5 Bảng 3.3. Độ trƣơng nở của các loại hạt vi nang sau khi tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng 29 6 Bảng 3.4. Thời gian rã của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch ruột mô phỏng 30 7 Bảng 3.5. Số lƣợng L. acidophilus sống sót trong các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau khi tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng 32 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang 1 Hình 1.1. Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 4 2 Hình 1.2. (a1-3) hình ảnh chụp CT cắt lớp tia X và (b1-3) hình ảnh kính hiển vi điện tử quét của hạt alginat đông khô ở các nồng độ tá dƣợc độn khác nhau 9 3 Hình 3.1. Hình ảnh hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau đông khô 24 4 Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện hàm ẩm và đƣờng kính của hạt vi nang phối hợp tinh bột và sữa gầy ngay sau đông khô 25 5 Hình 3.3. Hình ảnh phân tử tinh bột và sữa gầy phân tán trong nƣớc dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần 25 6 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn số lƣợng L. acidophilus sống sót trong các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau khi tiếp xúc với dịch dạ dày mô phỏng 33 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic là lợi khuẩn và là vấn đề đƣợc các nhà nghiên cứu quan tâm trong các thập kỉ gần đây.Ngày càng có thêm nhiều các bằng chứng khoa học về giá trị của probiotic trong việc hỗ trợ sức khỏe cho con ngƣời. Các tác dụng có lợi của chế phẩm probiotic đặc biệt liên quan đến sự kích thích hệ thống miễn dịch, chống vi khuẩn cũng nhƣ đặc tính chống đột biến và chống ung thƣ, cải thiện tiêu hóa lactose, chuyển hóa protein, cholesterol hoặc calci [36]. Tuy nhiên, trong quá trình đi vào đƣờng tiêu hóa, các lợi khuẩn phải chống chọi với các yếu tố bất lợi gặp phải trong dạ dày và đƣờng ruột, chẳng hạn, môi trƣờng acid của dịch vị, các enzym tiêu hóa và muối mật của ruột non làm suy giảm số lƣợng vi sinh vật. Để cải thiện khả năng sống sót của probiotic, nhiều tác giả trên thế giới đã sử dụng các dạng bào chế nhƣ bao pellet, cốm, nhũ tƣơng… và hoặc sử dụng các loại tá dƣợc bảo vệ. Một trong các hƣớng nghiên cứu đáng chú ý gần đây là sử dụng chất bảo vệ nhƣ sữa gầy, chitosan, tinh bột…để tạo vi nang. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài“Nghiên cứu sử dụng alginat phối hợp tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus” với hai mục tiêu: 1.Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợptinh bột với alginat. 2. Khảo sát khả năng bảo vệ L. acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng. 2 Chƣơng 1.TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Khái niệm về probiotic Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, từ pro và biota, có nghĩa là “dành cho sự sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn sống có thể cạnh tranh với các tác nhân gây bệnh và giúp cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa [31]. Năm 2001 tổ chức y tế thế giới WHO định nghĩa: “Probiotic làvi sinh vật sống, khi đƣa vào cơ thể với một lƣợng đủ lớn, sẽ mang lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [40]. 1.1.2. Vai trò của probiotic Kể từ những năm 1990, các nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng liệu pháp probiotic có thể giúp điều trị một số căn bệnh tiêu hóa, làm chậm sự phát triển của bệnh dị ứng ở trẻ em, điều trị và ngăn ngừa nhiễm trùng âm đạo và tiết niệu ở phụ nữ… Có thể kể ra một số tác dụng nhƣ sau:  Cải thiện chức năng miễn dịch:Probiotic là tác nhân quan trọng trong cải thiện chức năng miễn dịch của cơ thể. Probiotic có thể cải thiện chức năng miễn dịch bằng cách kích thích tăng số lƣợng tế bào sản xuất IgA, tăng tỷ lệ tế bào lympho T và tế bào Killer tự nhiên [34], [37].  Ngăn ngừa các vi khuẩn gây bệnh, lặp lại thế cân bằng vi khuẩn đƣờng ruột:Probiotic có thể bảo vệ cơ thể, chống lại vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh chất dinh dƣỡng và năng lƣợng. Ngoài ra, trong quá trình trao đổi chất probiotic tạo ra các sản phẩm có tính kháng khuẩn nhƣ acid hữu cơ (acid lactic và acid acetic), hydroperoxid, ethanol, diacetyl, acetaldehyde, CO 2 , reuterin, reutericyclin và bacteriocin…[34].  Cải thiện tình trạng không dung nạp lactose:Vi khuẩn lactic tích cực chuyển đổi lactose thành acid lactic. Vì vậy, khi sử dụng các chế phẩm probiotic sẽ cải thiện đƣợc tình trạng không dung nạp lactose [42].  Giảm cholesterol huyết thanh:Những nghiên cứu trên động vật đã chứng minh tính hiệu quả của một số probiotic trong việc giảm lƣợng cholesterol huyết thanh. [...]... nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bộtvới alginat  Đánh giá ảnh hƣởng của phƣơng pháp tiệt khuẩn đến thể chấthạtvi nang phối hợp tinh bột với alginat  So sánh khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy 2.2.2 Khảo sát khả năng bảo vệ L acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng  Khảo... tới vi sinh vật trong quá trình bảo quản cũng nhƣ sử dụng Do đó, nhiều tác giả đã sử dụng sữa gầy làm tá dƣợc tạo vi nang [7], [13], [16], [17] Nghiên cứu sau đây đƣợc thực hiện nhằm so sánh khả năng tạo hạt vi nang với alginat của tinh bột và sữa gầy  Mục tiêu Đánh giá khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp với tinh bột và sữa gầy,kết hợp đánh giá chất lƣợng hạt tạo thành  Tiến hành Tiến hành tạo. .. mm)  Tạo đƣợc hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy bằng nhỏ giọt qua đầu kim truyền 25G, trong đó hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột 10% có nhiều ƣu điểm hơn so với hạt vi nang phối hợp sữa gầy 3.2 Khảo sát khả năng bảo vệ L acidophilus của các hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng 3.2.1 Khảo sát khả năng bao gói và giải phóng vi sinh... sinh khối Phƣơng pháp tạo hạtvi nang phối hợp  Tạo hỗn dịch vi nang Hạt phối hợp tinh bột 10%:Phân tán đều sinh khối thu đƣợc trong 100ml nƣớc cất bằng máy lắc Hỗn dịch sinh khối trong nƣớc cất đem phối hợp với 100ml dung dịch alginat 4% và 20g tinh bột bằng khuấy từ trong 15 phút thu đƣợc 200ml hỗn dịch sinh khối trong dung dịch alginat 2% và tinh bột 10% Hạt phối hợp tinh bột 5% + sữa gầy 5%:Phân... hạt vi nang so với sử dụng sữa gầy  Màu sắc: Màu của các hạt tinh bột 10% (trắng tinh) , tinh bột + sữa gầy = 5% + 5% (trắng ngà), sữa gầy 10% (trắng vàng) là màu của tá dƣợc sử dụng Theo các nghiên cứu thị trƣờng thì màu trắng tinh là màu sắc có ƣu thế hơn trong phân phối cũng nhƣ thị hiếu của ngƣời sử dụng Nghiên cứu cho thấy có thể tạo đƣợc nguyên liệu dạng vi nang từ alginat phối hợp với tinh bột. .. độ ổn định cao, độ xốp cao và có khả năng chống chịu các muối và chất tạo phức Nghiên cứu về hạt vi nang tạo bởi alginat: Vi nang alginat đã đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu để bảo vệ tế bào, protein, vi khuẩn, các loại thuốc kém bền với dịch vị [33] Trong đó, nghiên cứu của Eng-Shen Chang và cộng sự (2011) cho thấy vi nang tạo bởi alginat đơn thuần có cấu trúc là các lớp đồng tâm, khi thêm tá dƣợc... nồng độ của chúng trong hạt vi nang Nhƣ vậy, nếu chỉ xét ở hai tiêu chí quá trình tạo hạt và thể chất hạt tạo thành thì tinh bột là lựa chọn tốt hơn so với sữa gầy Kết luận sơ bộ:  Sử dụng phƣơng pháp Tyndall để tiệt khuẩn tinh bột giúp cải thiện thể chất tinh bột và tạo thuận lợi cho quá trình tạo hạt vi nang bằng nhỏ giọt qua đầu kim, đồng thời có thể dùng đầu kim nhỏ tạo đƣợc hạt vi nang có kích thƣớc... tán đều trong nƣớc tạo dịch có thể chất nhớt, dẫn đến dịch tạo hạt bằng sữa khó đùn qua đầu kim hơn so với dịch tạo hạt bằng tinh bột Vậy sử dụng tinh bột thuận lợi hơn trong quá trình tạo hạt  Quá trình đông khô:Mức độ dính đĩa tăng dần từ hạt tinh bột 10% (I), hạt tinh bột + sữa gầy đến hạt sữa gầy 10% (III) với hạt I trơn, không dính đĩa và hạt III dính, khó lấy ra khỏi đĩa Sử dụng tinh bột làm tá... môn vị và phân bố đều trong ruột, 22 ngoài ra, có thể tiến hành bao bảo vệ vi nang để tăng tác dụng bảo vệ vi sinh vật Tuy nhiên, kích thƣớc hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột thu đƣợc bằng phƣơng pháp nhỏ giọt (cỡ 1,64– 2,21mm) vẫn lớn hơn so với kích thƣớc hạt vi nang tạo bởi phƣơng pháp nhũ tƣơng hoá (cỡ 0,5 μm – 1 mm) [28] Các hạt thu đƣợc khi sử dụng hai loại tinh bột trong thí nghiệm sơ... năng bao gói và giải phóng vi sinh vật của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong đƣờng tiêu hóa mô phỏng  So sánh tác dụng bảo vệ L acidophilus của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy trong dịch dạ dày mô phỏng 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn 2.3.1.1 Tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm Nguyên liệu cần tiệt khuẩn đƣợc đựng trong bình nón, đậy kín bằng . tài Nghiên cứu sử dụng alginat phối hợp tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo vi nang chứa Lactobacillus acidophilus với hai mục tiêu: 1.Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợptinh. ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LỆ QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC. HỌC DƢỢC HÀ NỘI BÙI THỊ LỆ QUYÊN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT PHỐI HỢP TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO VI NANG CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC