tắc pha loãng liên tục
Chuẩn bị:
Cân, đong chính xác các thành phần theo công thức môi trƣờng MRS đặc (công thức nêu trong mục 2.1.2). Hòa tan các thành phần tan trong nƣớc, phân tán thạch vào dung dịch đựng trong bình nón thích hợp. Tiến hành tiệt khuẩn bằng phƣơng pháp nhiệt ẩm. Sau đó, phân phối môi trƣờng lên các đĩa petri đã đƣợc rửa sạch, hấp tiệt khuẩn và sấy khô (bề dày lớp thạch trên các đĩa khoảng 2mm) sao cho mặt thạch nhẵn, phẳng. Chờ cho thạch nguội và đông rắn lại, đậy kín.
Chuẩn bị các ống nghiệm sạch, mỗi ống chứa 9ml nƣớc muối sinh lí, đậy kín, hấp tiệt khuẩn ở 115oC/20 phút, để nguội xuống nhiệt độ khoảng 37- 40oC.
Phá hạt: cân chính xác khoảng 1,00g hạt nguyên liệu, cho vào bình nón
chứa 100ml dung dịch natri citrat 2%. Hòa tan bằng máy khuấy từ liên tục cho đến khi các hạt rã hoàn toàn và phân tán đồng nhất.
Xác định số lƣợng VSV trong hạt vi nang: Hút chính xác 1,00ml dung dịch
từ bình nón pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml nƣớc muối sinh lí, lắc đều. Hút chính xác 1,00ml dịch đã đƣợc đồng nhất trong ống nghiệm thứ nhất pha loãng sang ống nghiệm thứ 2 (chứa 9 ml nƣớc muối sinh lí), lắc đều. Cứ tiếp tục pha loãng nhƣ vậy cho tới nồng độ pha loãng cuối cùng thích hợp. Cấy trải lên mỗi đĩa petri 0,5 ml
dịch trong các ống pha loãng ở trên (làm với 3 nồng độ cuối, mỗi nồng độ cấy trên 2 đĩa) [1].
Các đĩa petri đƣợc ủ trong tủ ấm 5% CO2, nhiệt độ 37oC trong 48h.Xác định số lƣợng khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch.
Tiến hành xác định số lƣợng VSV trên các mẫu:
Mẫu nguyên liệu dạng hạt sau đông khô.
Mẫu hạt vi nang sau tiếp xúc với dịch acid mô phỏng dịch dạ dày.
Số lƣợng VSV có trong 1,00g mẫuđƣợc tính theo công thức:
𝑿 = 𝟐 ×
𝑨𝒏−𝟐× 𝟏𝟎𝒏−𝟐+ 𝑨𝒏−𝟏× 𝟏𝟎𝒏−𝟏+ 𝑨𝒏× 𝟏𝟎𝒏 𝟑 × 𝐦
Trong đó:
m: Khối lƣợng mẫu đem tiến hành xác định số lƣợng VSV. X: Số VSV có trong 1,00g mẫu.
An: Số khuẩn lạc mọc trên các đĩa petri có cấy nồng độ pha loãng n. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Chƣơng 3.THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Khảo sát khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp tinh bột vớialginat
3.1.1. Đánh giá ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến thể chất hạtvi nang phối hợp tinh bột với alginat phối hợp tinh bột với alginat
Một trong những yêu cầu quan trọng đối với chế phẩm probiotic là không có vi sinh vật khác cạnh tranh với vi sinh vật probiotic. Vì thế các tá dƣợc sử dụng trong chế phẩm phải đƣợc tiệt khuẩn.Trong quá trình tiệt khuẩn, các yếu tố nhiệt và ẩm có thể tác động đến tá dƣợc. Tinh bột đƣợc khoá luận sử dụng làm tá dƣợc tạo vi nang. Vì vậy, các thí nghiệm dƣới đây nhằm khảo sát ảnh hƣởng của hai phƣơng pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm và Tyndall tới chất lƣợng tinh bột.
Mục tiêu
Lựa chọn phƣơng pháp tiệt khuẩn đối với tinh bột để quá trình tạo hạt tốt hơn.
Tiến hành
Chuẩn bị 2 bình nón, cân vào mỗi bình 10g tinh bột và tiệt khuẩn lần lƣợt bằng nhiệt ẩm và bằng phƣơng pháp Tyndall (phƣơng pháp nêu ở mục 2.3.1). Tiến hành tạo hạt với từng loại tinh bột vừa thu đƣợc theo phƣơng pháp đã nêu ở mục 2.3.4 (sử dụng đầu kim truyền 23G và 25G).
Đánh giá sơ bộ độ vô trùng của tinh bột thu được: phân tán 1 g tinh bột vào
10ml nƣớc cất đã đƣợc hấp tiệt trùng. Hút chính xác 0,50ml nƣớc cất dùng làm môi trƣờng phân tán nhỏ lên đĩa thạch. Tiến hành tƣơng tự với hỗn dịch tinh bột trong nƣớc vừa tạo.Ủ đĩa thạch trong tủ 37o
C, CO2 5% trong 48h. Quan sát đĩa thạch.
Kết quả thu đƣợc thể hiện qua bảng sau
Bảng 3.1.So sánh 2 phƣơng pháp tiệt khuẩn nhiệt ẩm và Tyndall về một số chỉ tiêu
Tiêu chí Nhiệt ẩm Tyndall
Thể chất tinh bột thu đƣợc Đồng nhất trong dịch tạo hạt + ++ Làm tắc đầu kim + - Độ vô trùng (sơ bộ) Đạt Đạt
Hình dạng hạt vi nang Cầu, ít xù xì Cầu, ít xù xì Đƣờng kính
hạt vi nang (mm)
Nhỏ giọt bằng đầu kim 23G 2,14 ± 0,06 2,21 ± 0,05
Nhỏ giọt bằng đầu kim 25G - 1,64 ± 0,07
Hàm ẩm hạt sau đông khô 1,21% 1,17%
Chú thích:
(-) : không quan sát thấy.
(+) : có, ở mức độ vừa phải.
(++) : có, ở mức độ tốt.
Nhận xét và bàn luận
Tiệt khuẩn bằng phƣơng pháp Tyndall tốn nhiều thời gian, phải trải qua nhiều bƣớc tiến hành hơn so với phƣơng pháp nhiệt ẩm. Tinh bột tiệt khuẩn theo phƣơng pháp Tyndall cho chất lƣợng tốt hơn so với tiệt khuẩn theo phƣơng pháp nhiệt ẩm. Nguyên nhân do trong quá trình tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm, tinh bột tiếp xúc với hơi nƣớc ở nhiệt độ cao sẽ bị hồ hóa một phần[9], dẫn đến hiện tƣợng vón cục làm tắc đầu kim. Trong khi đó, tiệt khuẩn bằng phƣơng pháp Tyndall, tinh bột chỉ tiếp xúc với nhiệt mà không có hơi nƣớc nên giữ đƣợc các tính chất ƣu việt của tinh bột: mịn, trơn…, thuận lợi cho quá trình tạo hạt bằng nhỏ giọt qua đầu kim nhỏ. Nghiên cứu trƣớc đây của tác giả Mai Hƣơng đã tạo đƣợc hạt vi nang khi phối hợp alginat 2% với tinh bột 10% bằng nhỏ giọt qua đầu kim truyền 23G [6], tuy nhiên khi tiệt khuẩn tinh bột bằng nhiệt ẩm, quá trình nhỏ giọt hay bị tắc đầu kim. Trong thí nghiệm này, khi tiệt khuẩn tinh bột theo phƣơng pháp Tyndall, quá trình tạo hạt vi nang bằng nhỏ giọt qua đầu kim 23G đã đƣợc cải thiện, không còn hiện tƣợng tắc đầu kim.
Khi sử dụng đầu kim truyền 25G, việc nhỏ giọt vẫn thuận lợi và tạo đƣợc hạt vi nang có kích thƣớc nhỏ hơn (sau đông khô, đƣờng kính hạt vi nang nhỏ giọt qua đầu kim 23G: 2,21± 0,05mm; qua đầu kim 25G: 1,64± 0,07 mm). Khi kích thƣớc hạt vi nang nhỏ hơn, hạt vi nang dễ dàng đi qua môn vị và phân bố đều trong ruột,
ngoài ra, có thể tiến hành bao bảo vệ vi nang để tăng tác dụng bảo vệ vi sinh vật. Tuy nhiên, kích thƣớc hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột thu đƣợc bằng phƣơng pháp nhỏ giọt (cỡ 1,64– 2,21mm) vẫn lớn hơn so với kích thƣớc hạt vi nang tạo bởi phƣơng pháp nhũ tƣơng hoá (cỡ 0,5 μm – 1 mm) [28].
Các hạt thu đƣợc khi sử dụng hai loại tinh bột trong thí nghiệm sơ bộ cho hình dạng giống nhau và hàm ẩm hạt sau đông khô chênh lệch không đáng kể (hàm ẩm của hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột tiệt khuẩn bằng phƣơng pháp nhiệt ẩm là 1,21% và tiệt khuẩn bằng phƣơng pháp Tyndall là 1,17%), chứng tỏ phƣơng pháp tiệt khuẩn không ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh bột ở hai tiêu chí này. Mặt khác, các thiết bị sử dụng trong phƣơng pháp Tyndall không đòi hỏi phải chịu đƣợc áp lực cao nhƣ thiết bị trong phƣơng pháp nhiệt ẩm, thao tác đơn giản, tinh bột thu đƣợc đều vô trùng. Nhƣ vậy,sử dụng phƣơng pháp Tyndall để tiệt khuẩn có nhiều ƣu điểm hơn so với sử dụng phƣơng pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm.
Trong các thí nghiệm tiếp theo, phƣơng pháp Tyndall đƣợc lựa chọn làm phƣơng pháp tiệt khuẩn chính cho tinh bột vàsử dụng đầu kim truyền 25G để tạo hạt.
3.1.2. So sánh khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy gầy
Qua rất nhiều nghiên cứu, sữa gầy đã đƣợc chứng minh là có tác động tốt tới vi sinh vật trong quá trình bảo quản cũng nhƣ sử dụng. Do đó, nhiều tác giả đã sử dụng sữa gầy làm tá dƣợc tạo vi nang [7], [13], [16], [17]. Nghiên cứu sau đây đƣợc thực hiện nhằm so sánh khả năng tạo hạt vi nang với alginat của tinh bột và sữa gầy.
Mục tiêu
Đánh giá khả năng tạo hạt vi nang khi phối hợp với tinh bột và sữa gầy,kết hợp đánh giá chất lƣợng hạt tạo thành.
Tiến hành
Tiến hành tạo hạt vi nang (phƣơng pháp đã nêu ở mục 2.3.4), các hạt vi nang có chứa các tá dƣợc với tỉ lệ nhƣ sau: alginat 2% + tinh bột 10%, alginat 2% + tinh bột 5% + sữa gầy 5%, alginat 2% + sữa gầy 10%.
Tiến hành đông khô hạt vi nang (phƣơng pháp nêu ở mục 2.3.5), quan sát và khảo sát các thông số thể chất hạt vi nang (các phƣơng pháp nêu ở mục 2.3.6, 2.3.7).
Xác định độ bở vụn bằng cách cho từng loại hạt vi nang vào trong túi polymer riêng rẽ, lắc các túi trong cùng 1 hộp lớn trong 15 phút. Quan sát tỉ lệ bở vụn của các loại hạt.
Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng sau:
Bảng 3.2.Ảnh hƣởng của tinh bột và sữa gầy đến thể chất hạtvi nang tạo thành Các tiêu chí Tinh bột 10% (I) Tinh bột + sữagầy = 5:5 (II) Sữa gầy 10% (III) Đƣờng kính hạt vi nang (mm)* 1,64 ± 0,07 1,53 ± 0,06 1,35 ± 0,05
Hàm ẩm ngay sau đông
khô (%) 1,05 2,70 2,95 Độ hút ẩm trở lại (sau 20 phút) Hàm ẩm (%) 6,09 6,56 7,76 Độ dính đĩa - + ++ Độ dính giữa các hạt với nhau - + ++ Độ cầu Gần cầu, bề mặt tƣơng đối nhẵn mịn
Tƣơng đối cầu, bề mặt xù xì hơn so với hạt tinh bột 10% Bề mặt xù xì, xấu xí Độ bở vụn - + ++ Màu sắc Trắng tinh Trắng ngà Trắng vàng Chú thích:
(-) : Không quan sát thấy.
(+) : Có, ở mức độ vừa phải.
(++) : Có, ở mức độ nhiều.
*
: p< 0,05.
Tinh bột 10% Tinh bột + sữa gầy = 5%+5%
Sữa gầy 10%
Hình 3.1.Hình ảnh hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy sau đông
Hình 3.2. Biểu đồ thể hiện hàm ẩm và đƣờng kính của hạt vi nang phối hợp tinh bột
và sữa gầy ngay sau đông khô
Tinh bột Sữa gầy
Hình 3.3. Hình ảnh phân tử tinh bột và sữa gầy phân tán trong nƣớc dƣới kính hiển
vivới độ phóng đại 100 lần
Nhận xét và bàn luận
Quá trình tạo hạt: Quá trình tạo hạtvi nang I bằng nhỏ giọt dễ dàng, không bị tắc đầu kim trong khi đó tạo hạt vi nang III khó và hay bị tắc đầu kim. Hiện
1.64 1.53 1.35 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
Tinh bột 10% Tinh bột + sữa gầy Sữa gầy 10% Hàm ẩm h ạt vi n an g n gay sau đ ôn g kh ô (% ) Đƣờ n g kín h h ạt vi n an g n gay sau đ ôn g kh ô (m m ) Đường kính hạt vi nang Hàm ẩm
tƣợng này là do tinh bột có bản chất là tá dƣợc trơn, không tan trong nƣớc, trong khi đó sữa gầy khi phân tán đều trong nƣớc tạo dịch có thể chất nhớt, dẫn đến dịch tạo hạt bằng sữa khó đùn qua đầu kim hơn so với dịch tạo hạt bằng tinh bột. Vậy sử dụng tinh bột thuận lợi hơn trong quá trình tạo hạt.
Quá trình đông khô:Mức độ dính đĩa tăng dần từ hạt tinh bột 10% (I), hạt tinh bột + sữa gầy đến hạt sữa gầy 10% (III) với hạt I trơn, không dính đĩa và hạt III dính, khó lấy ra khỏi đĩa. Sử dụng tinh bột làm tá dƣợc giúp giảm độ dính đĩa của hạt sau đông khô so với sử dụng sữa gầy.
Đường kính hạt vi nang sau đông khô:Đƣờng kính các hạt vi nang thu đƣợc lớn nhất ở tinh bột 10% (1,64± 0,05 mm). Khi giảm nồng độ tinh bột và tăng nồng độ sữa gầy để đảm bảo lƣợng tá dƣợc vẫn chiếm 10% dịch tạo hạt thì đƣờng kính hạt vi nang giảm dần nhƣ sau: hạt II: 1,53 ± 0,06 mm; hạt III: 1,35 ± 0,05mm. Sự khác nhau về đƣờng kính của các loại hạt vi nang này đƣợc giải thích do quá trình đông khô làm các phân tử nƣớc thăng hoa dẫn đến co rút hạt, mức độ co rút của hạt càng cao thì kích thƣớc hạt càng giảm. Hạt tạo bởi alginat đơn thuần có các lớp đồng tâm alginat, khi cho thêm tá dƣợc độn vào thì chúng tạo thành các cầu nối giữa các lớp đồng tâm này. Các tá dƣợc độn cung cấp cấu trúc hỗ trợ và ngăn chặn sự sụp đổ hoặc co ngót cho mạng gel sau đông khô [22]. Ở thí nghiệm này tá dƣợc độn là tinh bột và sữa gầy, phân tử tinh bột đƣợc phối hợp vào trong hạt vi nang tồn tại ở kích thƣớc lớn hơn các phân tử sữagầy (dựa theo hình 3.3: hình ảnh của các phân tử tinh bột và sữa gầy phân tán trong nƣớc dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 100 lần). Do đó khi cấu trúc gel bị co ngót do đông khô thì tinh bột có khả năng chống đỡ và tạo khung tốt hơn sữa. Vì vậy, hạt chứa tinh bột co ngót ít hơn hạt chứa sữa.
Hàm ẩm và độ hút ẩm trở lại: Sau đông khô, hàm ẩm của hạt tăng theo độ tăng của hàm lƣợng sữa (hạt tinh bột: 1,05%, hạt tinh bột + sữa: 2,70%, hạt sữa: 2,95%), tuy nhiên hàm ẩm của các hạt vi nang vẫn đạt yêu cầu đối với chế phẩm đông khô. Sau 20 phút để ngoài môi trƣờng, độ hút ẩm trở lại của hạt cũng tăng theo độ tăng của hàm lƣợng sữa với hạt tinh bột 10%- các hạt vẫn giữ thể chất
ban đầu, đứng riêng rẽ với nhau (hàm ẩm 6,09%); hạt tinh bột + sữa gầy - hạt hút ẩm (6,56%), hơi dính đĩa; hạt sữa gầy 10% - hạt hút ẩm mạnh (7,76%), dính vào nhau và dính vào đĩa. Điều này đƣợc giải thích do tinh bột không tan trong nƣớc nên tƣơng tác liên kết giữa các tiểu phân tinh bột với phân tử nƣớc thấp, ở giai đoạn bay hơi ẩm liên kết còn lại trong quá trình đông khô, nƣớc dễ dàng thoát ra hơn, còn sữa thì ngƣợc lại. Mặt khác, sữa hút ẩm nhanh hơn nhiều so với tinh bột, đồng thời, cấu trúc xốp rỗng của hạt chứa nhiều sữa dẫn đến tăng diện tích tiếp xúc với môi trƣờng cũng là một điều kiện làm khả năng hút ẩm tăng nhanh. Và một phần do hạt tinh bột chứa một lƣợng nhỏ chất béo giúp giảm sự hấp thụ độ ẩm [22]. Kết quả này đồng nhất với kết quả thực nghiệm trƣớc đó của tác giảMai Hƣơng và Hà Huyền [6], [7]. Vậy kết quả cho thấy sử dụng tinh bột làm tá dƣợc trong hạt vi nang sẽ tạo đƣợc hạt vi nang có hàm ẩm và độ hút ẩm trở lại thấp hơn so với sử dụng sữa gầy.
Độ cầu: Độ cầu tăng dần theo thứ tự: hạt sữa gầy 10%, hạt tinh bột + sữa gầy, hạt tinh bột 10%, cho thấy tinh bột có khả năng định khung tốt hơn nhiều so với sữa gầy. Do hạt chứa sữa sau đông khô bị sụp đổ cấu trúc gel nhiều hơn so với hạt chứa tinh bột nên bề mặt bị biến dạng nhiều hơn.
Độ bở vụn: Hạt vi nang sữa gầy 10% dễ bở vụn hơn so với hạt tinh bột 10% do bề mặt của hạt vi nang sữa gầy 10% xù xì, cấu trúc hạt xốp hơn. Nhƣ vậy, sử dụng tinh bột làm giảm độ bở vụn của hạt vi nang so với sử dụng sữa gầy.
Màu sắc: Màu của các hạt tinh bột 10% (trắng tinh), tinh bột + sữa gầy = 5% + 5% (trắng ngà), sữa gầy 10% (trắng vàng) là màu của tá dƣợc sử dụng. Theo các nghiên cứu thị trƣờng thì màu trắng tinh là màu sắc có ƣu thế hơn trong phân phối cũng nhƣ thị hiếu của ngƣời sử dụng.
Nghiên cứu cho thấy có thể tạo đƣợc nguyên liệu dạng vi nang từ alginat phối hợp với tinh bột và sữa gầy ở nồng độ từ 5 – 10%, tuy nhiên thể chất của các loại hạt này có sự khác biệt.Hạt có chứa tinh bột 10% có thể chất tốt nhất về các tiêu chí so sánh: hàm ẩm sau đông khô: 1,05%; độ cầu cao, bề mặt nhẵn mịn, hầu nhƣ không bị bở vụn, màu trắng tinh. Hạt tinh bột + sữa gầy có thể chất tƣơng đối gần
với hạt tinh bột 10%. Khi phối hợp hai loại tá dƣợc, chúng không triệt tiêu tính chất của nhau, mà vẫn giữ tính chất theo tỉ lệ nồng độ của chúng trong hạt vi nang.
Nhƣ vậy, nếu chỉ xét ở hai tiêu chí quá trình tạo hạt và thể chất hạt tạo thành thì tinh bột là lựa chọn tốt hơn so với sữa gầy.
Kết luận sơ bộ:
Sử dụng phƣơng pháp Tyndall để tiệt khuẩn tinh bột giúp cải thiện thể chất tinh
bột và tạo thuận lợi cho quá trình tạo hạt vi nang bằng nhỏ giọt qua đầu kim, đồng thời có thể dùng đầu kim nhỏ tạo đƣợc hạt vi nang có kích thƣớc nhỏ hơn (1,64 mm).
Tạo đƣợc hạt vi nang khi phối hợp alginat với tinh bột và sữa gầy bằng nhỏ giọt
qua đầu kim truyền 25G, trong đó hạt vi nang phối hợp alginat với tinh bột 10%