Luận văn tốt nghiệp dược sĩ nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa lactobacillus acidophilus nguyễn mai hương

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS Lê Ngọc Khánh DS Trần Văn Thái Nơi thực hiện: BM Công nghiệp dược HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS Lê Ngọc Khánh DS Trần Văn Thái, người thầy tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi từ ngày đầu đến em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn TS Đàm Thanh Xuân nhiệt tình giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực đề tài Đồng thời, em xin cảm ơn quan tâm, giúp đỡ thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược suốt trình làm đề tài nghiên cứu thực nghiệm môn Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, người quan tâm, dạy dỗ thời gian em học tập trường Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè động viên giúp đỡ em nhiều trình học tập sống Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Mai Hương MỤC LỤC Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị Trang ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn lactic 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn lactic 1.1.2 Loài Lactobacillus acidophilus 1.2 Tổng quan vi nang hóa probiotic 1.2.1 Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic 1.2.2 Ưu, nhược điểm phương pháp vi nang hóa 1.2.3 Phương pháp tách pha đông tụ 1.2.4 Alginat 1.2.5 Các nghiên cứu nước vi nang hóa 11 1.3 Các tá dược bảo vệ đông khô vi sinh vật 11 1.3.1 Lý thuyết đông khô 11 1.3.2 Các tá dược bảo vệ thường dùng đông khô vi sinh vật 12 1.3.3 Tinh bột 13 Chương NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG 15 PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 15 2.1.1 Chủng vi sinh vật 15 2.1.2 Hóa chất 15 2.1.3 Môi trường 15 2.1.4 Máy móc, dụng cụ 15 2.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột đến thể chất 16 nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ tinh bột độ ổn định nguyên 17 liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trình bảo quản 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Phương pháp nhân giống 17 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17 2.3.3 Phương pháp vi nang hóa alginat sử dụng kỹ thuật tách pha 17 đông tụ 2.3.4 Phương pháp đông khô 18 2.3.5 Phương pháp xác định hàm ẩm 19 2.3.6 Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV 19 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột đến thể chất 21 nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 3.1.1 Đánh giá thể chất dạng nguyên liệu sau đông khô 21 thay đổi nồng độ alginat 3.1.2 Đánh giá ảnh hưởng nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi 25 nang sau đông khô 3.2 Đánh giá khả bảo vệ tinh bột độ ổn định 29 nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trình bảo quản 3.2.1 Đánh giá khả bảo vệ tinh bột trình tạo nguyên 29 liệu đông khô probiotic 3.2.2 Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho trình tạo nguyên liệu 33 đông khô probiotic dạng vi nang 3.2.3 Khảo sát độ ổn định nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa 36 tinh bột trình bảo quản KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Am : Amylose Ap : Amylopectin ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ B infantis : Bifidobacterium infantis Bifidobacterium spp : Các loài thuộc chi Bifidobacterium C (Cytosine) : Xitozin Cfu (Colony-Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc ĐK : Đông khô E faecium : Enterococcus faecium G (Guanine) : Guanin IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn Sữa giới Kl/tt : Khối lượng/thể tích LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn Lactic L acidophilus : Lactobacillus acidophilus L amylophilus : Lactobacillus amylophilus L amylovorus : Lactobacillus amylovorus L brevis : Lactobacillus brevis L kefir : Lactobacillus kefir MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS MT : Môi trường PE (Polyethylene) : Polyetylen TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Các hóa chất dùng nghiên cứu 15 2.2 Các máy móc dùng nghiên cứu 16 3.1 Thể chất mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus 22 sau đông khô thay đổi nồng độ alginat 3.2 Đường kính, hàm ẩm thể chất mẫu nguyên liệu chứa 26 Lactobacillus acidophilus sau đông khô thay đổi nồng độ tinh bột 3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót mẫu sau đông khô 31 3.4 Số lượng vi khuẩn sống sót hàm ẩm mẫu sau đông khô 34 3.5 Hàm ẩm nguyên liệu thời gian bảo quản 37 3.6 Lượng vi sinh vật sống nguyên liệu thời gian bảo quản 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1.1 Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 1.2 Cấu trúc acid alginic 10 1.3 Cấu trúc phân tử Ca-alginat 10 3.1 Vi nang Ca-alginat (2%) sau đông khô 23 3.2 Vi nang Ca-alginat (2%)-TB (10%) sau đông khô 23 3.3 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc hàm ẩm đường kính vào 27 nồng độ tinh bột mẫu sau đông khô 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót mẫu sau đông 31 khô 3.5 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót mẫu sau 35 đông khô 3.6 Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống hàm ẩm nguyên liệu thời gian bảo quản 39 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn probiotic biết đến nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho người như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch… [33] Tuy nhiên, vi sinh vật dễ bị ảnh hưởng điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… [58] Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật… yếu tố làm giảm số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân hệ vi sinh vật đường ruột Ngoài ra, thông số liên quan trình sản xuất ảnh hưởng đến khả sống sót vi khuẩn probiotic [46] Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật chế phẩm đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo nguyên liệu có khả cung cấp lượng vi sinh vật phù hợp chất thích hợp Nhiều nghiên cứu tiến hành nhằm tìm biện pháp làm tăng khả chống chịu vi khuẩn trước điều kiện bất lợi sản xuất, bảo quản sử dụng Một phương pháp phổ biến để bảo quản chế phẩm sinh học đông khô Tuy nhiên, phương pháp giúp bảo vệ chế phẩm khỏi độ ẩm không bảo vệ chúng khỏi yếu tố khác môi trường [40] Vì vậy, phương pháp vi nang hóa nghiên cứu, ứng dụng giúp cách ly tế bào vi khuẩn với môi trường bất lợi nhằm giảm lượng vi sinh vật Ngoài ra, sử dụng tá dược bảo vệ phương pháp khả thi áp dụng rộng rãi Việc sử dụng tinh bột làm tá dược bảo vệ để tăng khả chống chịu vi sinh vật cải thiện thể chất nguyên liệu probiotic sau đông khô dạng vi nang hướng nghiên cứu đáng ý Chính vậy, đề tài “Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus” thực với mục tiêu cụ thể sau: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tinh bột đến thể chất nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô Đánh giá khả bảo vệ tinh bột độ ổn định nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trình bảo quản 38 vệ vững hạt tinh bột chứa lượng nhỏ chất béo nguyên nhân giúp ngăn chặn hấp thụ ẩm hạt [21] Trong trình bảo quản, hàm ẩm mẫu sau tuần tăng mạnh, sau lại giảm Nguyên nhân phần sai số thiết bị đo Tuy nhiên, nguyên nhân giải thích tinh bột có cấu trúc xốp, nên tiếp xúc với độ ẩm không khí khả hút ẩm tinh bột lớn Khi độ ẩm tương đối không khí 75% khả hút ẩm tinh bột 10,33%, độ ẩm tương đối không khí 100% khả hút ẩm tinh bột lên đến 20,92% [11] Do đó, trình lấy mẫu chuẩn bị đo hàm ẩm, tiếp xúc với độ ẩm cao không khí, hạt tinh bột hút ẩm làm cho hàm ẩm mẫu nguyên liệu tăng mạnh Hàm ẩm mẫu phụ thuộc đáng kể vào độ ẩm tương đối không khí thời gian mẫu tiếp xúc với môi trường Chính khả hút ẩm cao tinh bột tiếp xúc với không khí nên nguyên liệu đông khô dạng hạt vi nang có sử dụng tinh bột làm tá dược độn rắn cần bảo quản kín bao bì ngăn khuếch tán ẩm không khí  Lượng vi sinh vật sống mẫu nguyên liệu thời gian bảo quản thể bảng 3.6 Bảng 3.6: Lượng vi sinh vật sống nguyên liệu thời gian bảo quản Thời gian Sau ĐK Sau Sau Sau Sau Sau 12 tuần tuần tuần tuần tuần 5,99×109 2,94×109 1,18×109 3,78×108 Lượng VSV sống sót 1,48×1010 1,15×1010 (cfu/g)  Nhận xét: Từ kết cho thấy, số lượng vi sinh vật mẫu nguyên liệu giảm dần trình bảo quản Lượng vi sinh vật sau đông khô đạt 1,48×1010 cfu/g Sau 12 tuần, số lượng vi sinh vật sống giảm xuống 3,78×108 cfu/g, đạt 108 cfu/g Như vậy, với phối hợp 10% tinh bột, ta tạo thành công 39 nguyên liệu đông khô dạng vi nang với thể chất thích hợp lượng vi sinh vật phù hợp Sau tháng, nguyên liệu giữ độ ổn định đạt yêu cầu 12 3.5 10 2.5 1.5 Hàm ẩm (%) Số lượng VSV (lg CFU/g) nguyên liệu probiotic 0.5 0 Ngay sau đông khô tuần tuần tuần tuần 12 tuần Thời gian bảo quản Hàm ẩm Hình 3.6: Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống hàm ẩm nguyên liệu thời gian bảo quản Lượng vi sinh vật giảm dần trình bảo quản giải thích sau: Khả sống sót Lactobacillus acidophilus phụ thuộc vào nhiều yếu tố: pH, nồng độ oxy hòa tan, nhiệt độ, độ ẩm… Trong đó, Lactobacillus acidophilus vi khuẩn kị khí không bắt buộc (vi hiếu khí) nên nồng độ oxy hòa tan đóng vai trò đáng kể việc hạn chế sống sót vi khuẩn [32] Trong trình bảo quản, oxy ẩm từ môi trường khuếch tán qua bao bì nên thời gian bảo quản dài lượng vi sinh vật giảm 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đề tài hoàn thành mục tiêu đề thu số kết sau: - Việc phối hợp tinh bột cải thiện thể chất nguyên liệu đông khô dạng vi nang Khi phối hợp tinh bột, hạt vi nang có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt hạt giảm nhăn nhúm giữ độ cầu tốt hơn, màu sắc trắng đẹp Hạt cứng, giảm xốp, dễ làm nhỏ, hút ẩm Ta lựa chọn nồng độ alginat 2% tinh bột 10% để tạo hạt cho thể chất tốt - Phối hợp tinh bột để tạo nguyên liệu đông khô dạng vi nang làm tăng lượng vi sinh vật sống sót sau đông khô so với không sử dụng tinh bột điều kiện Tiến hành tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus dạng vi nang sử dụng alginat 2%, tinh bột 10% sinh khối 200ml dịch lên men Nguyên liệu bảo quản túi polyme đựng lọ PE kín 4ºC theo dõi độ ổn định Sau 12 tuần, hàm ẩm nguyên liệu 3,24% lượng vi sinh vật nguyên liệu 3,78×108 (cfu/g) đạt tiêu chuẩn nguyên liệu đông khô probiotic Kiến nghị - Tiếp tục theo dõi độ ổn định nguyên liệu probiotic đông khô dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có phối hợp tinh bột thời gian bảo quản tiêu độ ẩm số lượng vi sinh vật - Đánh giá khả bảo vệ vi sinh vật nguyên liệu probiotic đông khô dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus có phối hợp tinh bột môi trường dày nhân tạo TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đỗ Quốc Cường (2009), Nâng cao chất lượng sữa chua phương pháp vi gói vi khuẩn lactic, Trường Đại Học Kỹ thuật công nghệ TP HCM, TP HCM Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Thị Hoa (2013), Khảo sát tác dụng bảo vệ vi khuẩn alginat trình tạo nguyên liệu Probiotic chứa Lactobacilus acidophilus, Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội Nguyễn Văn Long (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, NXB y học, Hà Nội Biền Văn Minh, Kiều Hữu Ảnh, Phạm Ngọc Lan, Đỗ Thị Bích Thủy (2008), Giáo trình điện tử Vi sinh vật học công nghiệp, Huế Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế sinh dược học, NXB Giáo dục, Hà Nội Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng Nguyễn Văn Thanh, Huỳnh Thị Ngọc Lan, Trần Cát Nông, Võ Thị Mại (2002), "Nghiên cứu phối hợp Bifidobacterium bifidum với Lactobacillus acidophilus sản xuất chế phẩm loạn khuẩn đường ruột", Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh, 6, pp 142-144 Quách Thu Trang (2010), Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp vi nang hóa alginat tới tỉ lệ sống sót Lactobacillus acidophilus, Đại Học Dược Hà Nội, Hà Nội 10 Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm quốc Thăng, NguyễnThị Thịnh, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Doãn Biên (2000), Hoá sinh công nghiệp, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 11 Lê Ngọc Tú, Bùi Đức Hợi, Lưu Duẩn, Ngô Hữu Hợp, Đặng Thị Thu, Nguyễn Trọng Cẩn (1999), Hóa học thực phẩm, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội 12 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2006), Công nghệ sinh học, NXB Giáo dục, Hà Nội 13 Đàm Thanh Xuân, Lê Ngọc Khánh, Lê Thị Thu Hiền (2012), "Nghiên cứu sử dụng tế bào vi khuẩn Lactobacillus acidophilus cố định chất mang alginat lên men sản xuất calci lactat", Tạp chí hóa học, 50(5A), pp 117-121 Tài liệu tiếng Anh 14 Abadias M., Benabarre A., Teixido N., Usall J., Vinas I (2011), "Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake", International Journal of Food Microbiology, 65, pp 173-182 15 Agnihotri N., et al (2012), "Microencapsulation - a novel approach in drug delivery: a review", Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(1), pp 1-20 16 Amir Mortazavian, Seyed Hadi Razavi, Mohammad Reza Ehsani, Sara Sohrabvandi (2007), "Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms", Iranian journal of biotechnology, 5(1), pp 1-17 17 Anindya Kishore Maiti, Amal Kumar Dhara, Arunabha Nanda (2012), "Preparation and Evaluation of Starch coated Alginate Microsphere of Diclofenac potassium", International Journal of PharmTech Research, 4(2), pp 630-636 18 Arnauld J.P., Laroix C., Choplin L (1992), "Effect of agitation rate on cell release raye and metabolism during continues fermentation with entrapped growing Lactobacillus casei subsp casei", Biotech Tech, pp 261-265 19 Bozoglu T.F., Ozilgen M., Bakir U (1987), "Survival kinetics of lactic acid starter cultures during and after freeze-drying", Enzyme and Microbial Technology, 9, pp 531–537 20 Champagne C.P., Morin N., Couture R., Gagnon C., Jelen P., Lacroix C (1992), "The potential of immobilized cell technology to produce freezedried, phageprotected cultures of Lactococcus lactis", Food Research International, 25(6), pp 419-427 21 Chan Eng-Seng, et al (2011), "Effects of starch filler on the physical properties of lyophilized calcium–alginate beads and the viability of encapsulated cells", Carbohydrate Polymers, 83, pp 225-232 22 Filomena Nazzaro, Florinda Fratianni, Raffaele Coppola, Alfonso Sada, Pierangelo Orlando (2009), "Fermentative ability of alginat-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions", Journal of Functional Food, 1, pp 319-323 23 Gislene Mari Fujiwara, et al (2013), "Production and characterization of alginate-starch-chitosan microparticles containing stigmasterol through the external ionic gelation technique", Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 49(3), pp 537-546 24 Gomes A.M.P., Malcata F.X (1990), "Bifidobacterium spp and Lactobacillus acidophilus: biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as probiotics", Trends in Food Science & Technology, 10(4), pp 139-157 25 Guergoletto Karla Bigetti (2012), "Dried Probiotics for Use in Functional Food Applications", Food Industrial Processes-Methods and Equipment, pp 227-247 26 Halász Anna (2007), "Lactic Acid Bacteria", Food Quality and Standards, 3, pp 70-82 27 Harry W Leach, L.D MeCowen, Thomas J Schoch (1959), "Swelling and Solubility Patterns of Various Starches", In Structure of grannle, 56, pp 534543 28 Hekmat S., et al (1992), "Survival of Lactobacillus and Bifidobacterium bifidum in ice cream for use as a probiotic food", Journal of Dairy Science, 75, pp 1415–1422 29 Jankowski T., Zielinska M (1997), "Encapsulation of lactic and bacteria with alginate/starch capsules", Biotechnol Technol, pp 31-34 30 José Luis Parada, Carolina Ricoy Caron, Adriane Bianchi P Medeiros, Carlos Ricardo Soccol (2007), "Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria: Purification, Properties and use as Biopreservatives", Brazilian Archives of Biology and Technology, 50(3), pp 521-542 31 Kaewkaukul Naparat (1998), Development of mixed culture Lactobacillus products, Thesis of master of science, Mahidol University, Thailand 32 Kailasapathy Kaila (2002), "Microencapsulation of Probiotic Bacteria: Technology and Potential Applications", Horizon Scientific Press, pp 39-48 33 Kailasapathy Kaila, James Chin (2000), "Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp", Immunology and Cell Biology, 78, pp 80-88 34 Kailasapathy Kaila, Sultana K (2003), "Survival and b-D-galactosidase activity of encapsulated and free Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in ice cream", Australian Journal of Dairy Technology, 58(3), pp 223–227 35 Kebary K.M.K., Hussein, S.A., Badawi , R.M (1998), "Improving viability of bifidobacteria and their effect on frozen milk", Egyptian J Dairy Sci , 26, pp 319-337 36 Khalida S., et al (2000), "Encapsulation of probiotic bacteria with alginatestarch and evaluation of survival in simulated gastro-intestinal conditions and in yoghurt", Int Food Microbiol, 62, pp 47-55 37 Latha Sabikhi, Dabu R., D.K Thompkinson, Suman Kapila (2008), "Resistance of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus LA1 to Processing Treatments and Simulated Gut Conditions", Food Bioprocess Technol, 3, pp 586-593 38 Laurent Verschuere, Geert Rombaut, Parich Sorgeloos, Willy Verstraete (2000), "Probiotic bacteria as Biological Control Agents in Aquaculture", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(4), pp 655-671 39 Lim Chi Minh, Raha Abd Rahim, Ho Yin Wan, Arbakariya B Ariff (2009), "Formulation of Protective Agents for Improvement of Lactobacillus salivarius I 24 Survival Rate Subjected to Freeze Drying for Production of Live Cells in Powderized Form", Food Bioprocess Technol, 2, pp 431-436 40 Martin M.J., Lara-Villoslada F., Ruiz M.A., Morales M.E (2013), "Effect of unmodified starch on viability of alginate-encapsulated Lactobacillus fermentum CECT5716", Food Science and Technology, 53, pp 480-486 41 Morgan C., Vesey G (2009), Freeze-Drying of Microorganisms, Elsevier, Australia, pp 162-173 42 Murtaza G., et al (2011), "Alginat microparticles for biodelivery: a review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp 2726-2737 43 Nussinovitch A., Zvitov-Marabi R (2008), "Unique shape, surface and porosity of dried electrified alginate gels", Food Hydrocolloids, 22, pp 364372 44 Olivas G.I., Barbosa-Canovas G.V (2008), "Alginate–calcium films: Water vapor permeability and mechanical properties as affected by plasticizer and relative humidity", Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 41, pp 359– 366 45 Patil J.S., et al (2010), "Ionotropic gelation and polyelectrolyte complexation: the novel techniques to design hydrogel particulate sustained, modulated drug delivery system: a review", Digest Journal of Nanomaterial and Biostructures, 5(1), pp 241-248 46 Pramod Kumar Singh, Parneet Kaur Deol, Indu Pal Kaur (2011), "Entrapment of Lactobacillus acidophilus into alginat beads for the effective treatment of cold restraint stress induced gastric ulcer", Food Funct, 3, pp 83-90 47 Rassis D.K., Saguy I.S., Nussinovitch A (2002), "Collapse, shrinkage and structural changes in dried alginate gels containing fillers", Food Hydrocolloids, 16, pp 139-151 48 Rastello De Boisseson, et al (2004), "Physical alginate hydrogels based on hydrophobic or dual hydrophobic/ionic interactions: Bead formation, structure, and stability", Journal of Colloid and Interface Science, 273, pp 131-139 49 Rhim J (2004), "Physical and mechanical properties of water resistant sodium alginate films", Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 37, pp 323–330 50 Ribeiro C.C., Barrias C.C., Barbosa M.A (2004), "Calcium phosphate– alginate microspheres as enzyme delivery matrices", Biomaterials, 25, pp 4363–4373 51 Robert S Breed, Murray E.G.D., Nathan R Smith (1957), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, Baillierek Tilldall and Cox Ltd., The United States of America, pp 541-552 52 Savadogo Aly, Ouattara Cheik A.T., Bassole Imael H.N., Traore S Alfred (2006), "Bacteriocins and lactic acid bacteria - a minireview", African Journal of Biotechnology, 5(9), pp 678-683 53 Sheu T.Y., Marshall, R.T (1993), "Microentrapment of lactobacilli in calcium alginate gels", J Food Sci , 58, pp 557-561 54 Sriamornsak P., Thirawong N., Cheewatanakornkool K., Burapapadh W., Sae-Ngow W (2007), "Cryo-scanning electron microscopy (cryo-SEM) as a tool for studying the ultrastructure during bead formation by ionotropic gelation of calcium pectin", International Journal of Pharmaceutics, 352, pp 115-122 55 Swarbrich J., et al (2007), Encyclopedia of pharmaceutical technology, Informa Healthcare, NewYork, pp 2315-2327 56 Tal Y., Van Rijn J., Nussinovitch A (1997), "Improvement of structural and mechanical properties of denitrifying alginate beads by freeze-drying", Biotechnology Progress, 13, pp 788-793 57 Tal Y., Van Rijn J., Nussinovitch A (1999), "Improvement of mechanical and biological properties of freeze-dried denitrifying alginate beads by using starch as a filler and carbon source", Appl Microbiol Biotechnol, 51, pp 773779 58 Vilaichone R.K., Mahachai V., Tumwasorn S., Nunthapisud P., Kullavanijaya P (2002), "Inhibitory effect of Lactobacillus acidophilus on Helicobacter pylori in peptic ulcer patients: in vitro study", Chotmaihet Thangphaet, 85, pp 79-84 59 Vivek K.B (2013), "Use of encapsulated probiotic in dairy based foods", International Journal of Food, Agriculture and Veterinary Sciences ISSN: 2277-209X (Online), 3(1), pp 188-199 60 Wood B.J., Holzapfel W.H.N (1995), The Genera of Lactic Acid Bacteria, Blackie Academic and Professional, London UK 61 Zohar-Perez, C Chet I., Nussinovitch A (2004), "Irregular textural features of dried alginate-filler beads", Food Hydrocolloids, 18, pp 249-258 PHỤ LỤC Tiêu chuẩn chất lượng dự kiến nguyên liệu đông khô dạng hạt vi nang có kết hợp tinh bột chứa Lactobacillus acidophilus YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Tính chất: Hạt vi nang màu trắng, hình cầu, tương đối đồng đều, đường kính khoảng 2mm 1.2 Định tính: Chế phẩm phải thể phép thử định tính Lactobacillus acidophilus 1.3 Kim loại nặng: Không 20 phần triệu 1.4 Nước: Không 5,0% 1.5 Định lượng: Chế phẩm phải chứa Lactobacillus acidophilus không 108 cfu/g 1.6 Độ nhiễm khuẩn: - Tổng số Enterobacteria vi sinh vật Gram âm: không 500 cfu/g; - Nấm men nấm mốc: không 100 cfu/g; - Không có: E coli, Salmonella sp., P aeruginosa S aureus 1g PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Tính chất: Thử cảm quan, chế phẩm phải đạt yêu cầu nêu 2.2 Định tính: 2.2.1 Thuốc thử: Theo DĐVN III 2.2.2 Cách thử: Sau nuôi cấy vi sinh vật môi trường thạch đặc ta thu khuẩn lạc đặc trưng (mô tả mục định lượng) Lựa chọn khuẩn lạc đặc trưng, tách biệt cấy chuyển sang ống nghiệm chứa 5,0 ml môi trường MRS lỏng tiệt khuẩn làm nguội Ủ ống nghiệm cấy giống tủ ấm 5% CO2 24 37±1°C a Sự phát triển vi sinh vật: Vi sinh vật phát triển tốt điều kiện kị khí b Nhuộm Gram: Tiến hành nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộm Gram soi kính hiển vi với vật kính dầu có độ phóng đại 1.000 lần: Vi sinh vật bắt màu tím, hình que, xếp thành đôi, chuỗi ngắn đứng đơn độc (Trực khuẩn Gram dương) c Phản ứng catalase: Li tâm 2ml hỗn dịch sinh khối thu tốc độ 4.000 vòng/phút 15 phút, loại dịch, thu sinh khối Thêm vào sinh khối khoảng 2ml dung dịch oxy già 3%, phải không thấy có bọt khí lên (phản ứng catalase âm tính) d Định danh vi sinh vật kit API 50 CH: - Nguyên tắc: Mỗi vi sinh vật thuộc chi Lactobacillus có khả lên men carbon hydrat khác Môi trường API 50 CHL chứa chất dinh dưỡng thích hợp chất thị tía bromocresol Mỗi giếng kit API 50 CH chứa loại carbon hydrat khác Nếu vi sinh vật lên men carbon hydrat giếng sinh acid lactic làm giảm pH môi trường, kết làm đổi màu môi trường - Độ đục chuẩn McFarland số 2: Hút xác 2,0ml dung dịch bari clorid 0,048M vào bình định mức dung tích 100ml pha loãng dung dịch acid sulfuric 0,18M vừa đủ đến vạch, trộn Độ hấp thụ độ đục chuẩn số đo bước sóng 625nm, cốc đo dày 1cm, sử dụng dung dịch acid sulfuric 0,18M làm mẫu trắng, phải nằm khoảng 0,32 - 0,40 Độ đục chuẩn dùng vòng tháng kể từ ngày pha - Hỗn dịch gốc: Li tâm hỗn dịch vi sinh vật nuôi cấy 24 môi trường MRS lỏng mô tả với tốc độ 4.000 vòng/phút 15 phút Loại dịch, thu sinh khối Rửa sinh khối cách thêm 5ml dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vào, đồng hóa máy lắc Tiếp tục li tâm với tốc độ 4.000 vòng/phút 15 phút, loại dịch thu sinh khối Thêm 1ml nước cất vô trùng, phân tán sinh khối máy lắc - Môi trường API 50 CHL (BioMérieux, Pháp): Công thức: Polypepton 10,0g Cao nấm men 5,0g Tween 80 1,0ml Dikali hydrophosphat 2,0g Natri acetat 5,0g Diamoni citrat 2,0g Magie sulfat 0,20g Mangan sulfat 0,05g Bromocresol tía 0,17g Nước cất vừa đủ 1.000ml pH sau tiệt trùng 6,7-7,1 - Tiến hành: Nhỏ từ từ giọt hỗn dịch gốc vào ống nghiệm chứa sẵn 5ml nước cất vô trùng đến độ đục ống tương đương với độ đục chuẩn McFarland số (so sánh mắt thường) Ghi lại số giọt hỗn dịch gốc cho vào ống nghiệm Cho vào 10ml môi trường API 50 CHL số giọt hỗn dịch gốc gấp đôi số giọt cho vào ống nghiệm lắc Nhỏ khoảng 20µl môi trường API 50 CHL cấy vi sinh vật vào giếng kit, giếng số đến giếng 49, ý tránh tạo bọt khí giếng Sau nhỏ dung dịch dầu parafin vô trùng lên bề mặt giếng ủ 37±1°C Đọc kết sau 24 48 nuôi cấy - Cách đọc kết quả: Giếng âm tính có màu tím giống giếng chứng âm tính số Giếng dương tính môi trường giếng chuyển từ màu tím sang màu vàng Riêng giếng số 25, môi trường chuyển từ tím sang đen dương tính Ghi kết vào phiếu theo dõi kết sau 24 48 Nhập số liệu vào phần mềm Apiweb để định danh xác vi sinh vật chế phẩm 2.3 Kim loại nặng: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 7.4.7 Dùng 1,0g chế phẩm tiến hành thử theo phương pháp Dùng 2,0ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu để chuẩn bị mẫu đối chiếu 2.4 Nước: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 6.6 2.5 Định lượng: 2.5.1 Thuốc thử: Theo DĐVN III Công thức môi trường MRS lỏng: Glucose 20g Natri acetat 5g Pepton 10g K2HPO4 2g Cao thịt 10g MgSO4.7H2O 0,2g Cao nấm men 5g MnSO4.4H2O 0,05g Triamoni citrat 2g Nước máy vđ 1.000ml pH 6,8-7,0 Môi trường MRS đặc = Môi trường MRS lỏng + thạch agar (25g/1.000ml môi trường) 2.5.2 Cách thử: Phương pháp pha loãng liên tục - Chuẩn bị: Cân, đong thành phần công thức môi trường MRS lỏng Hòa tan thành phần tan nước, phân tán thạch vào dung dịch đựng bình nón thích hợp Đậy kín nút (bông không thấm nước) Hấp tiệt khuẩn môi trường 115°C 20 phút nồi hấp tiệt khuẩn Lấy bình khỏi nồi hấp phân phối môi trường lên đĩa Petri rửa sạch, hấp tiệt khuẩn sấy khô Lớp thạch dày khoảng 2mm, bề mặt nhẵn, phẳng Chờ thạch nguội đông rắn lại, đậy kín Chuẩn bị ống nghiệm sạch, ống chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% (kl/tt), đậy kín, hấp tiệt khuẩn 115°C 20 phút, sau để nguội xuống nhiệt độ 37 – 40°C - Phá hạt: Chuẩn bị bình nón chứa 100ml dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt), hấp tiệt trùng 115°C 20 phút, để nguội Cân xác khoảng 1,00g hạt vi nang Ca-alginat-tinh bột cho vào bình nón trên, khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút khoảng 30 phút nhiệt độ phòng đến vi nang rã hoàn toàn, phân tán đồng - Đếm số lượng tế bào: Hút xác 1,00ml dịch chứa vi khuẩn cần đếm số lượng tế bào, pha loãng vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch NaCl 0,9% tiệt trùng thứ nhất, lắc Sau lại hút xác 1,00ml dịch đồng ống nghiệm thứ pha loãng sang ống nghiệm thứ hai, lắc Tiếp tục pha loãng nồng độ pha loãng cuối Cấy trải lên đĩa Petri 0,5ml dịch ống ba nồng độ pha loãng cuối cùng, nồng độ cấy đĩa Ủ đĩa tủ ấm 5% CO2 37±1°C Sau 48 đếm số lượng khuẩn lạc mọc đĩa Petri lấy giá trị trung bình số khuẩn lạc đĩa nồng độ pha loãng (chỉ đếm đĩa petri có số khuẩn lạc nằm khoảng 30 - 300) - Tính kết quả: Số lượng VSV 1g nguyên liệu tính theo công thức: = × × + × + × × Trong đó: X: số VSV có 1g hạt An: số khuẩn lạc trung bình đĩa petri cấy nồng độ pha loãng 10n m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng (g) 2.6 Độ nhiễm khuẩn: Thử theo DĐVN III – Phụ lục 10.7 ĐÓNG GÓI, GHI NHÃN VÀ BẢO QUẢN Nguyên liệu đóng gói kín, ghi nhãn đầy đủ bảo quản 4°C