Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mgml bằng phương pháp pha loãng ethanol

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ du

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU TRANG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML

BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU TRANG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME DOXORUBICIN 2MG/ML

BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHA LOÃNG ETHANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn

Ths Nguyễn Văn Lâm

Nơi thực hiện

Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể Ban giám hiệu trường Đại học Dược

Hà Nội và bộ môn Bào chế đã tạo điều kiện cho em được làm khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường đã dìu dắt giúp đỡ em hoàn thành chương trình học tập trong suốt 5 năm qua

Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến

ThS Nguyễn Văn Lâm

Là người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè những người đã quan tâm động viên, khích lệ giúp em hoàn thành khóa luận

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thu Trang

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 7

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ 8

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Doxorubicin 2

1.1.1 Đại cương về doxorubicin 2

1.1.2 Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường 3

1.2 Đại cương về liposome 4

1.2.1 Khái niệm 4

1.2.2.1 Ưu điểm 4

1.2.2.2 Nhược điểm 5

1.2.3 Phân loại 6

1.2.3.1 Theo kích thước và số lớp 6

1.2.3.2 Theo cấu trúc lớp vỏ 6

1.2.4 Phương pháp bào chế 7

1.2.4.1 Phương pháp Batzri và Korn 7

1.2.4.2 Phương pháp Bangham 8

1.2.4.3 Phương pháp Deamer và Bangham 8

1.3 Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol 9

1.4 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin 11

1.4.1 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới 11

1.4.2 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 14

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14

2.1.2 Nguyên vật liệu 14

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 15

2.2.2 Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin 15

2.2.2.1 Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố

kích thước tiểu phân 15

2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu suất liposome hóa 16

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu 17

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm 17

Chương 3 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 18

3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn 18

3.2 Xây dựng quy trình bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 19

3.2.1 Quy trình bào chế chung 19

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế đến kích thước tiểu phân và hiệu suất liposome hóa 20

3.2.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi 20

3.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 24

3.2.3 Đánh giá vai trò của giai đoạn làm giảm kích thước tiểu phân trong quy trình bào chế 27

3.2.3 Đề xuất quy trình bào chế và đánh giá một số chỉ tiêu của liposome doxỏubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol 29

3.2.3.1 Quy trình bào chế 29

3.2.3.2 Đánh giá một số chỉ tiêu của liposome tạo ra 30

3.3 Bàn luận 32

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

2 HSPC Phosphatidyl dầu đậu nành đã hydrogen hóa

3 SPC Phosphatidylcholin dầu đậu nành

4 HEPES Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – 2 – ethan

sulfonic acid

7 DOX.HCl Doxorubicin hydroclorid

10 TKKH Tinh khiết hóa học

13 TMT-LS Liposome tác động vào khối u di căn

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin ở

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP, phân bố KTTP

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến KTTP và hiệu suất

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến KTTP

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến KTTP và hiệu suất liposome

hóa

25

Bảng 3.7 So sánh các giai đoạn trong quy trình bào chế liposome

doxorubicin bằng các phương pháp khác nhau

27

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của quá trình làm giảm KTTP đến KTTP và

hiệu suất liposome hóa

28

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 3.1 Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ doxorubicin 18

Hình 3.2 Liposome doxorubicin bào chế theo các tỷ lệ dung môi khác

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất

Hình 3.6 Đồ thị biểu diến sự thay đổi KTTP, PDI (A) và hiệu suất

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, liposome là lĩnh vực nghiên cứu được đẩy mạnh ứng dụng trong nhiều ngành nghề khoa học khác nhau như sinh học, hóa sinh, dược phẩm, mỹ phẩm, hóa trị liệu ung thư, enzym trị liệu đặc biệt trong lĩnh vực đưa thuốc tới đích Trong bào chế hiện đại, liposome thu hút được rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới với những ưu điểm nổi bật như: khả năng hướng đích thụ động đối với các tế bào ung thư, tăng hiệu quả điều trị và khoảng điều trị, tăng khả năng ổn định của dược chất được bao gói, tránh tác dụng trên các tế bào lành, cải thiện dược động học, giảm chuyển hóa và tăng thời gian tuần hoàn, bắt cặp linh động với các vị trí phối tử đặc biệt để đạt tác dụng hướng đích…

Trên thế giới liposome được bào chế bằng nhiều phương pháp khác nhau, được đưa vào sản xuất với nhiều chế phẩm sử dụng rộng rãi trên thị trường dưới dạng thuốc tiêm liposome doxorubicin Trong nước các nghiên cứu về liposome hiện nay còn nhiều hạn chế, chưa có chế phẩm nào được đưa vào sản xuất Các nghiên cứu về liposome ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sử dụng phương pháp hydrat hóa film, tuy nhiên phương pháp này hiện có nhiều nhược điểm như: liposome thu được không đồng nhất, kích thước lớn và đa lớp, sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại với môi trường, thời gian quy trình bào chế kéo dài (12 – 14h), khó áp dụng được trên quy

mô công nghiệp…

Yêu cầu đặt ra cần có một phương pháp bào chế mới thay thế và hạn chế các nhược điểm của phương pháp nói trên Do vậy đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol” được tiến hành nhằm mục đích:

1 Bào chế liposome doxorubicin 2mg/ml bằng phương pháp pha loãng ethanol

2 Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của liposome tạo ra

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Doxorubicin

1.1.1 Đại cương về doxorubicin

Hình 1.1 Công thức hóa học của doxorubicin hydroclorid

- Tên khoa học: (8S, 10S)-10-((3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α-L-lyxo-hexopyranosyl) oxy) -7, 8, 9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)-1-methoxy-5, 12-napthacenedion [22]

- Tính chất: điều kiện thường tồn tại ở dạng tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam không mùi, tan trong nước, methanol, acetonotril, tetrahydrofuran Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen [22]

- Doxorubicin bền trong dung dịch có pH gần 4 [10]

- Doxorubicin là chất nhạy cảm với ảnh sáng ở nồng độ thấp, tuy nhiên ở nồng độ điều trị doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng, không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ Thực tế dung dịch doxorubicin trong NaCl 0,9% có thể ổn định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PVC ở 25oC, lâu hơn khi bảo quản trong xylanh làm bằng polypropylen ở 4oC [22]

- Cơ chế tác dụng: doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA, đặc biệt gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân [2]

- Dược động học: sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến các mô phổi, gan, tim, lách, thận, bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol

- Công thức phân tử:

C27H29NO11 HCl

- Khối lượng phân tử: 579,99

Khoảng 40 – 50% bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa; 5%

bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày Doxorubicin không qua hàng rào máu não nhưng qua nhau thai và bài tiết qua tuyến sữa [2], [5], [22]

Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự do Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn Các liposome doxorubicin phân bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch không bình thường Dạng liposome doxorubicin không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần trong huyết tương cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [5], [22]

- Chỉ định chính: ung thư vú, u xương ác tính (sarcom xương) và u xương Ewing,

u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin, ung thư biểu mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp) Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn Khối u đặc ở trẻ em: Sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp… [2]

Chỉ định tương đối: ung thư tuyến tiền liệt, cổ tử cung, âm đạo, dạ dày Có tác dụng tốt trên một số ung thư hiếm gặp như đa uy tủy xương, u màng hoạt dịch, u nguyên bào võng mạc [2], [22]

- Chống chỉ định: có biểu hiện suy giảm chức năng tủy xương rõ, suy tim, quá mẫn với các thành phần của thuốc [2], [22]

- Tác dụng không mong muốn: độc tính cao, phụ thuộc đường dùng, liều dùng và tần số dùng thuốc Các tác dụng không mong muốn thường gặp: rụng tóc, buồn nôn, đặc biệt là chèn ép tủy và độc tính trên tim Ngoài ra còn gặp một số tác dụng phụ khác như: suy giảm chức năng tủy xương, viêm miệng, rối loạn tiêu hóa, nóng rát bàng quang và niệu đạo… [2], [22]

1.1.2 Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường

- Chế phẩm dạng liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet…

1.2 Đại cương về liposome

- Liposome có thể mang đồng thời cả dược chất thân nước và dược chất thân dầu Dược chất có thể phân bố ở các vị trí khác nhau tùy thuộc đặc tính thân dầu thân nước

và tương tác lý hóa của dược chất với lớp phospholipid [18]

- Cấu tạo và tính chất hóa lý tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm qua tế bào làm tăng sinh khả dụng của dược chất, mang các dược chất chữa bệnh nội bào [3], [4]

- Liposome cho phép vận chuyển thuốc tới tế bào đích thậm chí là đến các tổ chức bên trong tế bào đích bằng cách gắn thêm các ligand trên màng liposome do đó làm thay đổi chỉ số điều trị của thuốc [23]

- Làm thay đổi phân bố sinh học của một số dược chất có độc tính cao, dùng liều thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc sát khuẩn do đó làm giảm phân bố thuốc tại

cơ quan lành, tăng phân bố tại đích so với dược chất tự do, làm giảm độc tính và tác dụng không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị, tiết kiệm dược chất [3], [4], [23]

- Thể hiện ưu điểm của dạng siêu vi nang: bảo vệ dược chất tránh tác động bất lợi của ngoại môi trong quá trình bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác dụng trong cơ thể: pH, enzym, tác nhân oxy hóa… làm tăng độ tan của dược chất hoặc kéo dài tác dụng của thuốc [3], [4]

- Tỷ lệ liposome hóa của dược chất thấp, khó mang dược chất có phân tử lượng lớn [4]

- Phospholipid chủ yếu được chiết tách từ nguồn nguyên liệu tự nhiên do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên liệu Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm khác của quá trình oxy hóa phospholipid [21]

- Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [26]

- Hầu hết các phương pháp bào chế liposome đều chỉ thích hợp với quy mô phòng thí nghiệm, khó triển khai trên quy mô lớn [21]

- Hiện chưa có thông tin đầy đủ về mức độ an toàn của các chế phẩm liposome Ví

dụ như hội chứng tay chân (Hand and foot syndrome) không xuất hiện khi sử dụng doxorubicin dạng tự do nhưng lại được tìm thấy khi sử dụng liposome doxorubicin tuần hoàn kéo dài [21]

1.2.3 Phân loại

1.2.3.1 Theo kích thước và số lớp [11]

Gồm các loại: Liposome đa lớp đồng

trục (MLV), liposome kép (liposome

trong liposome – MVV), Liposome đơn

lớp lớn (LUV), Liposome đơn lớp nhỏ

(SUV), Liposome đơn lớp khổng lồ

(GUV), Liposome đa lớp nhỏ (OLV)…

Hình 1.3 Kích thước một số loại liposome [5]

1.2.3.2 Theo cấu trúc lớp vỏ

- Liposome quy ước: cấu tạo gồm có vỏ lipid và nhân nước Nhược điểm: thời gian tồn tại ngắn trong hệ tuần hoàn do bị các tế bào trong hệ thống miễn dịch bắt giữ, khả năng hướng đích kém do cơ chế thụ động, có nguy cơ giải phóng dược chất vào các

+ Liposome miễn dịch tồn tại lâu trong tuần hoàn (long circulating immune liposomes): liposome kết hợp ưu điểm của liposome tồn tại lâu trong tuần hoàn và

liposome miễn dịch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome [1], [4]

+ Liposome nhạy cảm nhiệt độ (temperature sensitive liposome) [1], [4]

+ Liposome nhạy cảm pH (pH sensitive liposome) [1], [4]

+ Lipoplexes: gồm phospholipid cationic liên kết với AND (lipofectin) để chuyển gen, điều trị bệnh về gen, không bền và độc ở liều cao [4]

+ Virosome: dùng vỏ virus làm chất mang đóng vai trò như một vaccin tạo đáp ứng miễn dịch cho cơ thể [4], [13]

+ Proliposome: là liposome ở dạng bột đông khô, khi dùng thêm pha nước hydrat hóa tạo hỗn dịch liposome [4]

+ Ethosome: ngoài thành phần phospholipid còn chứa tỷ lệ lớn alcol (ethanol, isopropanol), bào chế với mục đích tăng thấm thuốc qua da [4]

+ Liposome linh động (flexible liposome): là liposome đơn lớp nhỏ, được bào chế

từ phosphatidylcholin với sự có mặt của chất diện hoạt (Tween 80, muối mật, natri cholat,…) và ethanol, có tác dụng tăng thấm thuốc qua da, được ứng dụng nhiều trong

mỹ phẩm Liposome linh động có khả năng thấm qua lớp sừng còn được gọi là transferosome [4]

+ Niosome: sử dụng chất diện hoạt không ion hóa thay cho phospholipid Độ ổn định có thể cao hơn, hiệu suất gắn dược chất cao hơn, rẻ tiền hơn so với liposome Niosome gần đây được phát triển như một chất mang thuốc tương tự liposome, cải thiện sinh khả dụng cho các dược chất ít tan, thấm kém, tăng độ ổn định cho các dược chất kém bền [4]

+ Arsonoliposome: là dạng liposome sử dụng arsonolipid thay cho phosphonolipid, dùng trong điều trị ung thư và diệt ký sinh trùng vì khả năng tăng độc tính với tế bào ung thư và đơn bào [4]

1.2.4 Phương pháp bào chế

1.2.4.1 Phương pháp Batzri và Korn (pha loãng ethanol)

Được Batzri và Korn mô tả năm 1973, còn được gọi là phương pháp pha loãng ethanol hay tiêm ethanol Quy trình bào chế gồm các bước: Hòa tan phospholipid và

các thành phần tạo màng vào ethanol Bơm nhanh dung dịch này vào môi trường nước hoặc hệ đệm, kết hợp khuấy trộn Do thay đổi dung môi sẽ tạo thành các SUV

có kích thước khoảng 25 nm Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome Liposome thu được có kích thước nhỏ (30-110 nm) khá đồng nhất mà không phải trải qua quá trình siêu âm [3], [4], [17], [19]

1.2.4.2 Phương pháp Bangham (hydrat hóa màng film)

Do Bangham đưa ra từ năm 1965, với các bước tiến hành: Hòa tan phospholipid

và các thành phần tạo vỏ liposome vào dung môi hữu cơ (chloroform, methanol…) Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm trong bình cất quay tạo màng mỏng phospholipid bám trên thành bình cất Thêm dung dịch nước có hệ đệm (như hệ đệm phosphat pH 7,0 – 7,4) vừa cho vừa lắc để xảy ra quá trình hydrat hóa màng phospholipid tạo thành liposome Quá trình hydrat hóa nên được tiến hành ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ chuyển pha của lipid Tc, thông thường từ 50 – 60oC Dược chất được phối hợp vào liposome theo cơ chế chủ động hoặc thụ động Phương pháp này thu được liposome nhiều lớp, kích thước không đồng nhất (từ 50-1000 nm) [3], [4], [19]

1.2.4.3 Phương pháp Deamer và Bangham (bơm ether)

Hòa tan dược chất trong nước, đun cách thủy để duy trì nhiệt độ khoảng 55 – 65oC Hòa tan các thành phần tạo màng liposome vào ether Bơm từ từ dung dịch ether vào dung dịch nước từ phía đáy, khi tiếp xúc với pha nước, ether sẽ bốc hơi tạo thành liposome to một lớp có kích thước 200 – 1000 nm Phương pháp tiến hành nhanh nhưng hiệu suất tạo liposome thấp, dược chất phải tiếp xúc với nhiệt độ và dung môi,

có thể ảnh hưởng tới độ ổn định của chế phẩm [3], [4], [19]

Ngoài ra còn có thể bào chế liposome theo một số phương pháp khác [4], [17]:

- Phương pháp bốc hơi pha đảo

- Phương pháp đông khô

- Phương pháp dùng chất diện hoạt

- Phương pháp màng tiếp hợp

- Phương pháp phun hỗn hợp chất lỏng hòa tan trong khí siêu tới hạn

- Phương pháp bốc hơi pha đảo siêu tới hạn

1.3 Bào chế liposome bằng phương pháp pha loãng ethanol

So với các phương pháp bào chế trước đây, phương pháp pha loãng ethanol có ưu điểm nổi bật với quy trình bào chế đơn giản, dễ thực hiện, tạo ra các liposome có kích thước nhỏ, tương đối đồng nhất mà không cần trải qua quá trình siêu âm làm giảm KTTP

Quy trình bào chế liposome theo phương pháp pha loãng ethanol được bố trí rất đơn giản: Lipid và các thành phần tạo màng với nồng độ phù được được hòa tan trong ethanol, tiêm nhanh vào môi trường nước hoặc hệ đệm phù hợp kết hợp khuấy trộn ở tốc độ phù hợp Dược chất được hòa tan dung dịch ethanol hoặc trong môi trường đệm phụ thuộc vào độ tan Do thay đổi dung môi, các SUV có kích thước khoảng 25

nm được tạo thành Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome [3], [4], [11], [19] Phương pháp pha loãng ethanol hiện nay được cải tiến bằng cách sử dụng hệ thống kim phun nhằm khắc phục hạn chế, nâng cao quy mô bào chế Pha nước, pha ethanol được làm nóng tới 55oC Pha nước được bơm liên tục nhờ bơm nhu động từ (2) sang (3), quay trở lại (2), trong quá trình bơm khi pha nước đi qua hệ thống kim phun, pha ethanol có hòa tan phospholipid được bơm dưới áp lực nén của (5) qua thiết bị đầu kim phun (1) [25]

Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống kim phun tạo dòng [25]

Hiệu suất và chất lượng liposome tạo thành có thể phụ thuộc vào các yếu tố: tốc

độ tiêm; nồng độ phospholipid trong dung dịch ethanol và trong dung dịch đệm; đường kính bơm kim tiêm, áp suất bơm; pH và áp suất thẩm thấu dung dịch đệm; tốc

1 Hệ thống kim phun (2, 3) Pha nước

4 Pha ethanol

5 Thiết bị nén khí nito

6 Bơm nhu động

độ khuấy trộn; tỷ lệ thể tích ethanol/đệm…[4], [17].Trong nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố trên được tiến hành bởi Kremer và cộng sự năm 1977 đã chỉ ra rằng tốc độ tiêm không ảnh hưởng đến quá trình tạo liposome [17]

Một số dung môi thân nước có thể thay thế cho ethanol như propanol, isopropanol, ethyl acetat… Đặc biệt trong trường hợp ethanol ảnh hưởng đến độ ổn định của dược chất [12]

Dược chất được liposome hóa bằng phương pháp tiêm ethanol rất đa dạng như enrofloxacin, cyprofloxacin, indomethacin, triamcinolon [17], beclomethason với hiệu suất liposome hóa lên đến 93% [14] Dược chất có thể gắn theo cơ chế thụ động: dược chất thân nước được hòa tan vào pha nước, dược chất thân dầu được hòa tan trong ethanol Cũng có thể gắn theo cơ chế chủ động: thường áp dụng với dược chất thân nước Theo cơ chế thụ động dược chất thân dầu đạt hiệu suất gắn vào liposome rất cao (~100%), hiệu suất gắn của dược chất thân nước rất thấp (~16%) Kích thước

và độ đồng nhất của liposome không khác nhau nhiều giữa hai loại dược chất Từ đó cho thấy phương pháp tiêm ethanol phù hợp cao hơn với việc liposome hóa dược chất thân dầu [15]

Bên cạnh đó, phương pháp pha loãng ethanol còn tồn tại nhiều hạn chế như: giới hạn về độ tan của phospholipid trong ethanol (40mM đối với phosphatidylcholin) và

tỷ lệ thể tích ethanol/pha đệm (≤ 7,5 v/v) do đó liposome thu được thường bị pha loãng; hiệu suất liposome hóa thấp đặc biệt với các dược chất thân nước, dung môi ethanol tồn dư cần được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tách…[4], [17], [19] Phương pháp pha loãng ethanol hiện được ứng dụng nhiều trên thế giới, được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu bào chế liposome

Năm 2008, Johnston Micheal J W và cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome DOX bằng phương pháp pha loãng ethanol Các lipid được sử dụng là disteroyl phosphatidylcholin, cholesterol, spingomyelin trứng được hòa tan trong ethanol, bơm vào dung dịch MgSO4 để tạo liposome Lọc ép 10 lần qua màng polycacbonat 100

nm thu được liposome có kích thước 110 nm ± 25 nm Dược chất DOX được hòa tan thành dung dịch rồi phối hợp vào liposome ủ trong 90 phút ở 65oC Các tác giả đã

tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ lipid – thuốc đến khả năng giải phóng thuốc

và sự toàn vẹn của liposome trong công thức liposome DOX Kết quả nghiên cứu chỉ

ra rằng DOX có thể gắn vào liposome để đạt giá trị D/L cao đến 0,46% Tỷ lệ thuốc được giải phóng từ liposome có thể thay đổi trong một khoảng rộng tương ứng với

sự thay đổi các giá trị D/L và sự liposome hóa Đồng thời nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi cấu trúc và làm vỡ màng liposome là do sự lắng thuốc ở các cấu trúc bên trong liposome [16]

Năm 2010, Chiraz Jaafar – Maalei đã cải tiến phương pháp tiêm ethanol bằng cách

sử dụng thêm một màng liên kết để bào chế liposome với dược chất indomethacin và beclomethason, khảo sát một số yếu tố như dòng chảy pha nước, nồng độ phospholipid…Hiệu suất liposome hóa thu được với indomethacin là 63%, beclomethason 93%, kích thước giao động trong khoẳng 50 – 160 nm [14]

Philippe Gentine năm 2011 đã tiến hành nghiên cứu một số dung môi thân nước thay thế cho ethanol sử dụng trong phương pháp pha loãng ethanol như propanol, butanol, isopropanol, ethyl acetat… Kết quả cho thấy chỉ có isopropanol tạo liposome

có kích thước nhỏ (84,8 ± 5,5 nm), chỉ số đa phân tán PDI nhỏ (0,224 ± 0,012) và không phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khảo sát như nồng độ phospholipid, thể tích dung môi, tốc độ bơm, tốc độ khuấy trộn Tác giả cho rằng có thể dùng isopropanol

để thay thế cho ethanol trong sản xuất liposome [12]

1.4 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin

1.4.1 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới

Trong những năm gần đây trên thế giới, liposome DOX vẫn thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học

Zhaohui Wang và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế liposome miễn dịch gắn peptid hướng đích trong điều trị ung thư di căn (TMT-LS) sử dụng liposome có gắn một peptid hướng đích di căn ung thư cụ thể Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film (SPC: CHL: DSPE PEG = 20: 10: 2) hydrat hóa bằng 123mM amoni sulfat, siêu âm trong 30 phút sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-50 thu lấy các liposome có kích thước 100 nm, nạp DOX nhờ phương pháp tạo chênh

lệch pH, tinh chế liposome bằng phương pháp lọc trên gel Sau quy trình bào chế thu được các TMT-LS có kích thước 94,41 ± 0,1 nm, hiệu suất liposome hóa gần 100% Phân tích qua đo dòng tế bào cho thấy nồng độ TMT-LS-DOX tập trung tại dòng tế bào ung thư di căn (MDA-MB-435S và MDA-MB-23J) cao hơn hẳn so với LS-DOX trong khi đó không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ dược chất tại khối u giữa TMT-LS-DOX và LS-DOX ở dòng tế bào ung thư không di căn (MCF-7) Sau 14 ngày, kích thước khối u từ 6,6 ± 1,57 cm giảm xuống 3,63 ± 0,37 cm khi điều trị bằng LS-DOX và 1,71 ± 0,33 cm khi sử dụng TMT-LS-DOX [24]

Antonella Accardo và cộng sự (năm 2012) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng của liposome DOX gắn nhóm peptid MonY-BN tới các receptor bombesin tại

tế bào ung thư (DSPC-MonY-BN-DOX) Liposome với thành phần bao gồm DSPC

và MonY-BN (tỷ lệ mol 97: 3) được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo, được đùn qua màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 100 nm nhờ áp suất khí Nitơ tạo

ra liposome đường kính 145,5 ± 31,5nm và chỉ số đa phân tán PDI 0,2 ± 0,05, thế Zeta -12,8 ± 3,6mV Nạp DOX bằng phương pháp chênh lệch pH sử dụng đệm HEPES pH 7,4 bên ngoài liposome, hiệu suất liposome hóa 95,0 ± 2,7% Liposome DSPC/MonY-BN tập trung trong tế bào PC-3 là 2,7% ± 0,3% ở 37oC so với liposome DSPC peptid tự do 1,4 ± 0,2% Ở 37oC DSPC-MonY-BN-DOX ức chế sự phát triển khối u cao hơn (60%) so với DSPC/ DOX liposome không đặc hiệu (36%) [9]

Từ một số nghiên cứu nói trên ta có thể nhận thấy rằng xu hướng hiện nay trên thế giới là tập trung phát triển các dạng liposome nhạy cảm với điều kiện môi trường hoặc có bề mặt gắn thêm các nhóm liên kết với kháng nguyên của tế bào u… nhằm tăng tính hướng đích, tăng tác dụng điều trị, giảm tác dụng phụ

1.4.2 Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin tại Việt Nam

Năm 2011, Đào Thanh Tùng đã nghiên cứu bào chế và đánh giá các đặc tính của liposome DOX bằng phương pháp hydrat hóa film với thành phần tạo màng gồm có SPC và CHL, dược chất được đưa vào liposome bằng hai phương pháp thụ động và chủ động qua tạo chênh lệch pH qua màng Kết quả đã khảo sát được công thức tỷ lệ mol SPC: CHL (7:3), tỷ lệ mol dược chất: lipid (5:1) và xây dựng quy trình bào chế

liposome DOX với kích thước < 300 nm, hiệu suất liposome hóa > 80% Hàm lượng dược chất trong hệ phân tán~1mg/ml Nghiên cứu bước đầu đã khảo sát và đưa ra công thức bào chế liposome DOX tuy còn nhiều hạn chế như: liposome tạo ra có kích thước lớn và không đồng đều bằng các nghiên cứu tham khảo trước đó, hiệu suất liposome hóa chưa cao do sử dụng phương pháp tạo chênh lệch pH bằng cách điều chỉnh pH thông thường sau khi hydrat hoá, do đó trong và ngoài liposome vẫn cùng một hệ đệm [7]

Dựa trên cơ sở tiếp nối các kết quả thu được và khắc phục những hạn chế còn tồn tại từ nghiên cứu của Đào Thanh Tùng, năm 2012 Nguyễn Văn Lâm đã tiến hành nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome DOX 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm

và đánh giá tác dụng của chế phẩm trên khối u động vật Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film có thành phần tạo màng SPC: CHL (10:2), dược chất đưa vào liposome bằng phương pháp chủ động thông qua tạo chênh lệch pH giữa hai bên màng bằng thay đệm amoni sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến ở môi trường bên ngoài liposome Giảm KTTP bằng quá trình siêu âm Liposome thu được có KTTP < 200 nm, hiệu suất liposome hóa > 80% TCCS cho thuốc tiêm liposome DOX đã được đề xuất và thẩm định tại Viện kiểm nghiệm thuốc TW Đánh giá tác dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ưu thế vượt trội của thuốc tiêm dạng liposome so với dạng dung dịch đặc biệt trên khối u dưới da Tuy nhiên nghiên cứu vẫn chưa giải quyết được những nhược điểm chung của phương pháp hydrat hóa màng film (quy trình kéo dài, nhiều công đoạn, cần siêu âm làm giảm kích thước tiểu phân…) [5]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Liposome

- Liposome DOX

2.1.2 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu được sử dụng

chuẩn

3 Phosphatidylcholin dầu đậu nành

6

HEPES

(N-2-hydroxy ethyl piperazin – N –

2 – ethan sulfonic acid)

8 Triton X100 (Octylphenolpoly –

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu

- Bể điều nhiệt (hãng Buchi-Đức)

- Thiết bị đồng nhất hóa tốc độ cao Unidriver X1000

- Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros® Filter Modules, màng polysulfone, kích cỡ lỗ 10kD, diện tích lọc 20cm2 (Mỹ)

- Thiết bị phân tích kích thước tiểu phân Zetasizer ZS90 (Malvern-Anh)

- Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich-Đức)

- Máy quang phổ UV-VIS U-1800 (Hitachi-Nhật Bản)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin

2.2.1.1 Bào chế liposome trắng chưa mang dược chất

Được tiến hành theo các nghiên cứu đã tham khảo trước đó [5]:

- Cân phosphatidylcholin và cholesterol (100: 30 kl/kl) hòa tan hoàn toàn trong thể tích ethanol phù hợp

- Chuẩn bị dung dịch đệm citrat 300mM pH 4

- Phối hợp pha ethanol vào pha nước bằng loại bơm tiêm phù hợp, kết hợp khuấy trộn và duy trì nhiệt độ thích hợp

- Lọc tiếp tuyến để cô đặc hệ liposome về 10ml

- Đổi môi trường bên ngoài liposome bằng phương pháp lọc tiếp tuyến sử dụng

đệm HBG (20mM HESPES / 1l dung dịch glucose)

2.2.1.2 Nạp dược chất

Dựa trên sự chênh lệch pH

- Sau khi đổi đệm HEPES bên ngoài liposome, sự chênh lệch pH tạo động lực cho quá trình nạp dược chất theo cơ chế chủ động

- Cân chính xác lượng DOX.HCl để đạt hàm lượng 2mg/ml sử dụng thiết bị khuấy

từ để DOX hòa tan và khuếch tán vào trong liposome Ủ trong 10p để khuếch tán hoàn toàn

- Liposome được đóng lọ thủy tinh, đậy kín, bọc giấy và bảo quản ở 2 – 8oC

2.2.2 Phương pháp đánh giá liposome doxorubicin

2.2.2.1 Phương pháp đánh giá hình thức, kích thước tiểu phân và phân bố kích thước

tiểu phân

- Hình thức: liposome doxorubicin sau khi được bào chế phải là hỗn dịch đục mờ màu đỏ cam, để lâu có thể bị lắng cặn nhưng dễ dàng phân tán đều trở lại khi lắc nhẹ

- Hình dạng và cấu trúc liposome: sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua với kỹ thuật nhuộm soi âm bản xác định hình thái và cấu trúc của liposome

- KTTP và phân bố KTTP: sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) với thiết bị Zetasizer ZS90 Đánh giá KTTP và phân bố KTTP dựa vào giá trị đường kính trung bình (Zaverage), bảng và đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, chỉ số đa phân tán (PDI)

2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng doxorubicin toàn phần và hiệu suất liposome hóa

- Xây dựng đường chuẩn định lượng DOX tự do ở bước sóng 233 nm, DOX toàn phần ở bước sóng 481 nm, xây dựng đường hồi quy tuyến tính biểu hiện tương quan giữa mật độ quang và nồng độ DOX

- Định lượng DOX toàn phần: tiến hành theo các nghiên cứu được tham khảo trước

đó [1], [7], với các giai đoạn chính:

+ Phá vỡ cấu trúc liposome bằng Triton 10%

+ Pha loãng đến tỷ lệ thích hợp, đo quang ở 481 nm [1], [7]

+ Nồng độ DOX.HCL toàn phần tính theo công thức:

Ctp = DTP

D’ C × 𝐶′c × K'

DTP, D’C: mật độ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn đem đo

CTP: hàm lượng DOX toàn phần của mẫu liposome doxorubicin (mg/ml)

C’C: Nồng độ DOX trong dung dịch chuẩn (mg/ml)

CN: Hàm lượng DOX tự do của mẫu liposome doxorubicin (mg/ml)

CC: Nồng độ DOX trong dung dịch chuẩn (mg/ml)

H: Hiệu suất liposome hóa

CN, CTP: Hàm lượng DOX tự do và DOX toàn phần (mg/ml)

VN, V0: Thể tích dung dịch DOX tự do và toàn phần (ml)

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu:

- Mỗi thí nghiệm làm 3 lần và lấy kết quả theo giá trị trung bình Các số liệu được

xử lý thống kê để xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn S, ở mức tin cậy p = 0,95

- Xử lý thống kê bằng phần mềm và Microsoft Office Excel

2.2.4 Điều kiện thí nghiệm

DOX là một chất có độc tính, không dễ khuếch tán hay bay hơi nhưng có khả năng lây nhiễm qua dụng cụ, môi trường thí nghiệm và tiếp xúc trực tiếp Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện:

- Khu vực thí nghiệm riêng biệt, tránh ánh sáng, được vệ sinh trước và sau làm thí nghiệm Có thiết bị bảo hộ cho người làm nghiên cứu

- Trang thiết bị, dụng cụ dùng xong phải được xử lý riêng Các dụng cụ được ngâm với dung dịch sulfocromat để oxy hóa hết DOX

- Các chất thải được ngâm với sulfocromat trước khi xử lý riêng