Bài viết nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế liposome amphotericin B (AmB) bằng phương pháp tiêm ethanol (pha loãng ethanol). Hoà tan hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol, AmB trong hỗn hợp ethanol và N,N-dimethylacetamid (DMA) ở 60oC, tiêm nhanh dung dịch này vào pha nước với tỷ lệ thể tích khác nhau để tạo liposome.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƢƠNG PHÁP TIÊM ETHANOL Nguyễn Tuấn Quang*; Phạm Thúy Ngọc** Vũ Thị Hồng Hạnh**; Nguyễn Văn Lâm**; Phạm Thị Minh Huệ** TĨM TẮT Nghiên cứu xây dựng quy trình bào chế liposome amphotericin B (AmB) phương pháp tiêm ethanol (pha lỗng ethanol) Hồ tan hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), o cholesterol, AmB hỗn hợp ethanol N,N-dimethylacetamid (DMA) 60 C, tiêm nhanh dung dịch vào pha nước với tỷ lệ thể tích khác để tạo liposome Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ ethanol/nước, nhiệt độ phối hợp pha tốc độ khuấy trộn pha thơng qua đặc tính kích thước tiểu phân, độ đồng nhất, hình thái hiệu suất liposome hóa Kết quả: bào chế hỗn dịch liposome AmB 50 mg/10 ml có kích thước nhỏ (khoảng 190 nm), đồng (PDI = 0,136), hiệu suất liposome hóa > 70%, cấu trúc đa khoang đa lớp * Từ khoá: Liposome; Amphotericin B; Phương pháp tiêm ethanol; Bào chế INITIAL STUDY OF PREPARATION OF THE LYPOSOME AMPHOTERICIN B USING ETHANOL INJECTION METHOD SUMMARY Liposome amphotericin B (AmB) is prepared by the ethanol injection method (diluting ethanol) Hydrogenated soybean phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol, amphotericin B are dissolved in the mixture of ethanol and N,N-dymethilacetamid (DMA) at 60 C, then this solution is quickly injected into water phase with different volumes to create liposome An investigation has been made on the effects of the proportion of ethanol phase over water phase, the combining temperature and the stirring speed of the two phases, basing on the characteristics of the subdivision dimension, the homogeneity, the morphology and the percentage of entrapment of AmB The result is a suspension of liposome AmB 50 mg/10 ml with small dimension (about 190 nm), morphology (PDI = 0.136), percent of entrapment of AmB (above 70%) and multi-cavity, multi-layer structure * Key words: Liposome; Amphotericin B; Ethanol injection method; Preparation ĐẶT VẤN ĐỀ Amphotericin B hệ mang thuốc nhiều nhà khoa học giới quan tâm nhờ có ưu điểm bật khả mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc khả đưa thuốc tới quan đích Liposome * Học viện Quân y ** Đại học Dược Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Tuấn Quang (dsquang2000@yahoo.com) Ngày nhận bài: 25/06/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 17/09/2014 Ngày báo đăng: 23/07/2014 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 ứng dụng điều trị bệnh ký sinh trùng, nhiễm khuẩn điều trị ung thư [1, 4] AmB thuốc điều trị nhiễm nấm toàn thân phổ rộng, sử dụng từ lâu, chủ yếu dạng tiêm tĩnh mạch trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân Tuy nhiên, hạn chế dược chất không tan nước nên sinh khả dụng thấp thuốc gây nhiều tác dụng phụ, đặc biệt gây độc cho thận Vì vậy, việc nghiên cứu dược chất amphotericin B liposome nhằm kiểm soát giải phóng dược chất, tăng sinh khả dụng vấn đề có ý nghĩa Bài báo này, chúng tơi trình bày số kết nghiên cứu bước đầu bào chế liposome AmB phương pháp tiêm ethanol NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết bị - Nguyên liệu: AmB, hydrogenated soybean phosphatidylcholin (HSPC), cholesterol, ethanol, đường sucrose, dinatrisuccinat hexahydrat hóa chất khác theo tiêu chuẩn USP tiêu chuẩn nhà sản xuất Acetonitril, methanol dùng cho HPLC - Thiết bị: máy đồng hoá Unidrive X1000 (Mỹ), thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros Filter Moducles (Mỹ), hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Anh); hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu cao Waters e2695 (Mỹ), hệ thống kính điện tử truyền qua JEOL 1010 (Nhật Bản) Phƣơng pháp nghiên cứu * Phương pháp bào chế liposome AmB: Theo phương pháp Batzri Korn mô tả năm 1973, với thành phần lựa chọn gồm: AmB 50 mg, HSPC 213 mg, cholesterol 84 mg, succrose 900 mg, dinatri succinat 27 mg, ethanol tuyệt đối DMA vđ [3] Quá trình bào chế theo bước sau: - Chuẩn bị pha ethanol: hòa tan HSPC cholesterol vào ml ethanol 60oC, điều chỉnh pH axít HCl 2,5N đến pH 1,0 - 3,0 Hũa tan 50 mg AmB vo ml hỗn hp dùng môi DMA:EtOH (1:1 v/v) Phối hợp dung dịch AmB vào dung dịch phospholipid Đun cách thuỷ 60oC đến thu pha ethanol màu vàng da cam suốt - Chuẩn bị pha nước: đệm dinatri succinat mM pH - + sucrose 7,5% - Phối hợp pha ethanol với pha nước: tiêm nhanh pha ethanol vào pha nước, khuấy máy khuấy tốc độ cao với tốc độ khuấy nhiệt độ định thời gian 10 phút - Lọc tiếp tuyến để cô đặc dung dịch thể tích 10 ml Tiếp tục lọc rửa tiếp tuyến 100 ml dung dịch pha nước để thu hỗn dịch chứa liposome AmB Tiến hành khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước, nhiệt độ phối hợp pha tốc độ khuấy trộn pha đến đặc tính liposome * Phương pháp đánh giá số đặc tính liposome: - Xác định kích thước tiểu phân (KTTP) độ đồng nhất: phương pháp tán xạ ánh sáng động với thiết bị Zetasizer ZS90 Pha loãng hệ phân tán liposome 100 lần nước cất, tiến hành đo KTTP Đánh giá kết thông qua đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, Zaverage, số đa phân tán (PDI) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 - Xác định hình thái cấu trúc tiểu phân phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm - Xác định hiệu suất liposome hóa: định lượng AmB liposome thô liposome sau lọc tiếp tuyến phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký: cột Cosmosil 5C18-MS-II, kích thước cột 250 × 4,6 nm; đường kính hạt nhồi µm Pha động: hỗn hợp acetonitril (ACN) natri EDTA 0,02M (pH 5,0) với tỷ lệ 40:60 (v/v) Tốc độ dòng 0,8 ml/phút Thể tích tiêm mẫu 20 µl Detector UV bước sóng 405 nm Hiệu suất liposome hóa (H%) tính theo cơng thức: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết qu¶ khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nƣớc tới đặc tính liposome Bào chế mẫu liposome theo quy trình điều kiện lựa chọn Cố định nhiệt độ phối hợp pha 60oC tốc độ khuấy trộn 3.900 vòng/phút để khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước tới đặc tính liposome Các mẫu bào chế với tỷ lệ thể tích ethanol/nước 4/100, 6/100, 8/100, 10/100, 15/100 20/100 (v/v) tương ứng Bảng 1: Đặc tính mẫu liposome theo tỷ lệ thể tích ethanol/nước MÉu ThÓ tÝch pha ethanol (ml) ThÓ tÝch pha n-íc (ml) Zaverage (d.nm) PDI HiƯu st liposome hãa (%) M4 100 235,1 0,120 69,21 M6 100 227,7 0,174 68,94 M8 100 204,3 0,120 73,53 M10 10 100 157,8 0,222 67,98 M15 15 100 194,2 0,278 Không đánh giá M20 20 100 176,0 0,208 Không đánh giá (a) (b) Hình 1: Phân bố thể tích cơng thức có tỷ lệ thể tích ethanol/nước 10/100 (a) 10/100 (b) TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Kết cho thấy: mẫu khảo sát 3.900 vòng/phút để khảo sát ảnh hưởng tạo liposome với kích thước nhỏ nhiệt độ phối hợp tới đặc tính liposome (Zaverage < 300 nm) tương đối đồng Các mẫu bào chế nhiệt độ: 30, 45, (PDI < 0,3) Tuy nhiên, đánh giá phân 60 750C bố KTTP hình 1, có khác biệt rõ ràng cơng thức có tỷ lệ thể tích ethanol nước từ 10/100 trở lên cơng thức có tỷ lệ Bảng 2: Đặc tính mẫu liposome bào chế nhiệt độ phối hợp khác thể tích pha ethanol/pha nước 10/100 ethanol/nước từ 10/100 trở lên có KTTP lớn HiƯu st NhiƯt ®é Theo hình (a) cơng thức với tỷ lệ thể tích MÉu Zaverage phèi hỵp o (d.nm) PDI ( C) (> 1.000 nm) chiếm đa số thể tích, tiểu lyposome hãa (%) phân có kích thước nhỏ chiếm thể tích khơng M8-30 30 363,4 0,283 54,89 đáng kể ë hình 1b, công thức với tỷ lệ M8-45 45 230,3 0,142 71,02 M8-60 60 204,3 0,120 73,53 M8-75 75 239,3 0,216 67,47 thể tích pha ethanol/pha nước 10/100, tiểu phân kích thước nhỏ chiếm đa số, khơng xuất tiểu phân kích thước lớn (>1.000 nm) Có khác KTTP phân bố Về hiệu suất liposome hóa: tiến hành KTTP mẫu liposome bào chế nhiệt định lượng tính hiệu suất liposome hóa độ khác Mẫu M8-60 cho KTTP nhỏ công thức có tỷ lệ thể tích pha độ đồng cao (Zaverage ethanol/pha nước từ 10/100 trở xuống Kết 204,3 nm, PDI = 0,12) Trong đó, cho thấy mẫu liposome có hiệu mẫu liposome bào chế nhiệt độ 30oC suất liposome hóa cao (> 67%) Trong đó, 75oC cho liposome có KTTP số PDI cơng thức M8 cho hiệu suất liposome hóa lớn Mặc dù khác biệt số cao (73,53%) công thức M10 cho mẫu không nhiều, kết hiệu suất thấp (67,98%) chứng minh nhiệt độ chuyển dạng Tc Kết hợp với tài liệu tham khảo [2, 5], lựa phospholipid HSPC (khoảng 53oC) có liên chọn tỷ lệ thể tích ethanol/nước 8/100 thu quan đến đặc tính liposome Ở nhiệt độ mẫu có hiệu suất liposome hóa cao thấp (dưới nhiệt độ Tc), phospholipid có cấu để tiếp tục nghiên cứu trúc gel bền vững, linh hoạt nên làm Nghiên cứu ảnh hƣởng nhiệt độ phối hợp gi÷a pha tới đặc tính liposome giảm khả tạo tái tạo liposome Vì vậy, tăng nhiệt độ, mẫu M8-30, M8-45 có xu hướng giảm KTTP tăng độ đồng Khi so sánh mẫu M8-75 với mẫu M8- Bào chế mẫu liposome theo quy trình 60 (ở nhiệt độ T c), KTTP tăng lên điều kiện lựa chọn Cố định tỷ lệ thể tích độ đồng có xu hướng giảm xuống ethanol/nước 8/100 tốc độ khuấy trộn 10 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 Điều phù hợp với tài liệu tham Có khác biệt rõ ràng KTTP độ khảo [6]: nên bào chế liposome nhiệt độ đồng công thức bào chế cao T c phospholipid, với tốc độ khuấy trộn khác Công thức không nên bào chế liposome nhiệt độ không kết hợp lực phân tán (M8-0) cho tiểu cao, đó, lớp màng phospholipid q lỏng phân có kích thước lớn khơng đồng lẻo, khó tạo liposome (Zaverage = 985,1 nm, PDI = 0,465) Cơng Hiệu suất liposome hóa cho thấy: thức M8-39, M8-69 M8-99 cho nhiệt độ gần kề với nhiệt độ chuyển dạng liposome có kích thước tương đối nhỏ phospholipid, liposome độ đồng cao Trong đó, cơng thức đạt kết tốt KTTP, độ đồng mà M8-39 tạo liposome có KTTP nhỏ đạt hiệu suất cao nhiệt độ khác độ đồng cao Đồng thời, hiệu suất Từ kết trên, lựa chọn nhiệt độ phối hợp pha 60oC bào chế liposome để tiếp tục nghiên cứu liposome hóa công thức M8-39 cao so sánh với cơng thức M8-69 M8-99 Do đó, lựa chọn tốc độ khuấy trộn pha 3.900 vòng/phút để tiến hành Kết khảo sát ảnh hƣởng tốc khuấy trộn tới đặc tính liposome Bào chế mẫu liposome theo quy trình điều kiện lựa chọn Cố định tỷ lệ thể tích ethanol/nước 8/100 nhiệt độ phối hợp pha 600C để khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy trộn phối hợp tới đặc tính liposome Mẫu bào chế với tốc độ khuấy trộn 0, 3.900, 6.900 9.900 vòng/phút bào chế liposome AmB Kết đánh giá đặc tính mẫu liposome AmB lựa chọn Tiến hành bào chế mẫu liposome AmB theo công thức quy trình bào chế phần phương pháp nghiên cứu với thông số lựa chọn: tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước 8/100, nhiệt độ phối hợp pha 600C tốc độ khuấy trộn 3.900 vòng/phút Bảng 3: Đặc tính mẫu liposome bào chế với tốc độ khuấy trộn khác Bảng 4: Đặc tính mẫu liposome AmB HiƯu st TèC ®é MÉu Zaverage khuÊy trén (d.nm) PDI (v/ph) M8-0 Khơng khuấy trộn MÉu liposome 693,1 0,509 l-ỵng lIposome AmB (mg) hãa (%) 204,3 0,120 32,19 73,53 đánh giá M8-2 177,8 0,128 33,67 73,98 189,1 0,159 32,53 72,10 190,4 ± 0,136 ± 32,80 ± 73,20 ± 13,3 0,02 0,78 0,98 204,3 0,120 73,53 M8-3 M8-69 6.900 220,2 0,242 73,11 X + SD 11 PDI HiƯu st M8-1 Khơng 3.900 9.900 (d.nm) Hµm hãa (%) M8-39 M8-99 Zaverage 289,3 0,312 69,10 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 8-2014 hợp 600C, tốc độ khuấy trộn 3.900 vòng/phút cho quy trình bào chế liposome AmB phương pháp tiêm ethanol Quy trình bào chế tiến hành với thời gian ngắn, dễ thực hiện, cho kết liposome AmB có KTTP tương đối nhỏ, phân bố đồng hiệu suất liposome hóa cao (> 70%) Đây kết ban đầu làm tiền đề để tiến hành nghiên cứu nhằm bào chế liposome AmB theo phương pháp tiêm ethanol có hiệu suất liposome hố cao hn quy mô sản xuất TI LIU THAM KHẢO Võ Xuân Minh, Phạm Thị Minh Huệ Kỹ thuật nano liposome ứng dụng dược phẩm, mỹ phẩm NXB Y học 2013, tr.50-55 Anastasia S Domazou, Pier Luigi Luisi Size distribution of spontaneously formed liposomes by the alcohol injection method Journal of Liposome Research 2002, 12 (3), pp.205-220 Hình 2: Cấu trúc tiểu phân liposome AmB phương pháp chụp TEM Với quy trình bào chế thông số lựa chọn, liposome AmB bào chế có KTTP tương đối nhỏ (khoảng 190,4 nm), độ đồng cao (PDI khoảng 0,136), hiệu suất liposome hóa khoảng 73,20% Hình ảnh chụp TEM cho thấy liposome AmB có hình cầu, kích thước nhỏ, cấu trúc đa khoang, đa lớp số khoang số lớp không nhiều (< khoang/lớp liposome) KẾT LUẬN Nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng lựa chọn tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước 8/100, nhiệt độ phối 12 Deepak Singodia, Ashwni Verma et al Investigations on feasibility of in situ development of amphotericin B liposomes for industrial applications Journal of Liposome Research 2012, 22 (1), pp.8-17 Lasic, DD Handbook of biological physics, chapter 10, applications of liposome Elsevier Science B.V California 1995 Miquel Pons, Merc Foradada; Joan Estelrich Liposomes obtained by the ethanol injection method International Journal of Pharmaceutics 1993, 95, pp.51-56 Oselys Rodriguez Justo, Angela Maria Moraes Analysis of process parameters on the characteristics of liposomes prepared by ethanol injection with a view to process scale-up: Effect of temperature and batch volume Chemical Engineering Research and Design 2011, 89, pp.785-792 ... nghĩa B i b o này, chúng tơi trình b y số kết nghiên cứu b ớc đầu b o chế liposome AmB phương pháp tiêm ethanol NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu thiết b - Nguyên liệu: AmB, hydrogenated... đặc tính liposome Mẫu b o chế với tốc độ khuấy trộn 0, 3.900, 6.900 9.900 vòng/phút b o chế liposome AmB Kết đánh giá đặc tính mẫu liposome AmB lựa chọn Tiến hành b o chế mẫu liposome AmB theo... quy trình b o chế liposome AmB phương pháp tiêm ethanol Quy trình b o chế tiến hành với thời gian ngắn, dễ thực hiện, cho kết liposome AmB có KTTP tương đối nhỏ, phân b đồng hiệu suất liposome