Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome amphotericin b bằng phương pháp tiêm ethanol

ĐẶT VẤN ĐỀ Tình trạng nhiễm nấm xâm lấn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và đau ốm lâu dài ở những bệnh nhân ung thư và suy giảm miễn dịch. Amphotericin B là kháng sinh chống nấm phổ rộng, hoạt tính mạnh, được sử dụng phổ biến trong điều trị hơn 40 năm nay. Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là hầu như không tan trong nước nên sinh khả dụng thấp, đồng thời thuốc có nhiều tác dụng không mong muốn nhất là trên thận gây khó khăn cho việc sử dụng trong lâm sàng. Vì vậy, bào chế hệ mang thuốc chứa Amphotericin B giúp giảm độc tính và tăng sinh khả dụng của thuốc là yêu cầu có ý nghĩa khoa học và tính cấp thiết. Nhiều hệ mang thuốc chứa Amphotericin B đã được nghiên cứu phát triển và ứng dụng trong lâm sàng như: phức hợp với cholesteryl sulfate (Amphotec), phức hợp lipid (Abelcel)… Trong đó, sử dụng liposome làm hệ vận chuyển thuốc cho thấy có nhiều ưu điểm nổi bật: tăng thời gian lưu thông thuốc trong tuần hoàn, khu trú tác dụng của thuốc tại cơ quan đích… Đây là một hướng nghiên cứu đầy triển vọng được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm. Hiện nay, Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B bằng phương pháp hydrat hóa film, bốc hơi pha đảo và bước đầu bào chế bằng phương pháp tiêm ethanol. Để tiếp tục góp phần nghiên cứu về liposome nói chung và liposome Amphotericin B nói riêng, đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphoterin B bằng phƣơng pháp tiêm ethanol” được tiến hành nhằm mục tiêu: 1. Bào chế liposome Amphotericin B bằng phương pháp tiêm ethanol. 2. Bước đầu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B.

VŨ THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM

ĐÔNG KHÔ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG

PHÁP TIÊM ETHANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM

ĐÔNG KHÔ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG

PHÁP TIÊM ETHANOL

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 ThS Nguyễn Văn Lâm

2 ThS Nguyễn Tuấn Quang

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Bào chế - ĐH Dược HN

2 Học viện Quân y

HÀ NỘI – 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong những dòng đầu tiên, tôi xin phép gửi lời cảm ơn sâu sắc tới:

ThS Nguyễn Văn Lâm ThS Nguyễn Tuấn Quang

Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện khóa luận này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Phạm Thị Minh Huệ cùng toàn

thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược

Hà Nội, Trung tâm Đào tạo - Nghiên cứu Dược - Học viện Quân Y đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận

Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè - những người đã giúp

đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận

Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Vũ Thị Quỳnh

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Amphotericin B 2

1.1.1 Công thức hóa học 2

1.1.2 Đặc tính lý - hóa 2

1.1.3 Tác dụng, dược lý, chỉ định, liều dùng 2

1.1.4 Tác dụng không mong muốn (thường gặp) 3

1.2 Liposome 3

1.2.1 Khái niệm 3

1.2.2 Ưu, nhược điểm của liposome 4

1.2.3 Phương pháp bào chế liposome 5

1.2.3.1 Các phương pháp bào chế liposome 5

1.2.3.2 Bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol 5

1.3 Liposome Amphoterin B 9

1.3.1 Cấu trúc liposome Amphotericin B 9

1.3.2 Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B 12

1.3.2.1 Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B trên thế giới 12

1.3.2.2 Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B tại Việt Nam 12

1.4 Đông khô liposome 13

1.4.1 Độ ổn định của liposome 13

1.4.2 Quá trình đông khô 14

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17

2.3.1 Phương pháp bào chế liposome Amphotericin B 17

2.3.2 Phương pháp đánh giá liposome Amphotericin B tạo ra 18

2.3.2.1 Phương pháp định lượng Amphotericin B trong hỗn dịch liposome Amphotericin B 18

2.3.2.2 Hiệu suất quy trình (H%) 19

2.3.2.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome Amphotericin B 19

2.3.3 Đông khô liposome 20

2.3.3.1 Quy trình đông khô liposome Amphotericin B 20

2.3.3.2 Đánh giá liposome Amphotericin B sau đông khô 20

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 20

2.3.5 Điều kiện thí nghiệm 20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 21

3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Amphotericin B trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).21 3.1.1 Độ đặc hiệu 21

3.1.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 21

3.1.3 Tính tuyến tính 22

3.1.4 Độ chính xác 23

3.1.5 Độ đúng 23

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và quy trình bào chế đến đặc tính của liposome Amphotericin B 24

3.2.1 Ảnh hưởng của yếu tố công thức đến đặc tính của liposome Amphotericin B 25

3.2.1.1 Vai trò của DSPG trong liposome Amphotericin B 25

3.2.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến đặc tính của liposome Amphotericin B 26

3.2.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB đến đặc tính của liposome Amphotericin B 29

3.2.2 Ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về quy trình bào chế đến đặc tính của liposome Amphotericin B 31

3.2.2.1 Ảnh hưởng của đường kính kim đến đặc tính của liposome Amphotericin B 31

3.2.2.2 Ảnh hưởng của thời gian khuấy trộn pha nước 33

3.3 Bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B 34

3.3.1 Ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến các đặc tính của liposome Amphotericin B trước đông khô 34

3.3.2 Ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến các đặc tính của liposome

Amphotericin B sau đông khô 34

3.3.3 Đề xuất quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B 37

3.4 Bàn luận 39

3.4.1 Về phương pháp định lượng Amphotericin B 39

3.4.2 Về phương pháp tiêm ethanol bào chế liposome Amphotericin B 39

3.4.3 Về công thức bào chế liposome Amphotericin B 40

3.4.4 Về đông khô liposome Amphotericin B 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

12 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa

(Hydrogennated soy phosphatidylcholine)

13 IC50 Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử

14 KTTP Kích thước tiểu phân

15 kl/kl Khối lượng/khối lượng

16 L-AmB Liposome amphotericin B

22 TKHH Tinh khiết hóa học

23 USP Dược điển Mỹ (United State Pharmacopoeia)

24 SPC Phosphatidylcholin đậu nành

25 SUV Liposome đơn lớp nhỏ (small unilamellar vesicle)

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ AmB và

diện tích pic 22

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP (A) và PDI (B)

trước và sau khi LTT 27

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến

hiệu suất quy trình 28

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB

đến hiệu suất quy trình 30

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của đường kính kim đến

Bảng 3.5 Thành phần công thức bào chế và các đặc tính của

L-AmB thu được 25

Bảng 3.6 Thành phần công thức bào chế L-AmB khi thay đổi tỷ

Bảng 3.10 Công thức bào chế hỗn dịch L-AmB 31

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của đường kính kim đến các đặc tính của

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của thời gian khuấy trộn đến đặc tính của

Bảng 3.13 Thành phần tá dược tạo khung và đặc tính của L-AmB

trước đông khô 34 Bảng 3.14 Ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến các đặc tính của

L-AmB sau đông khô 36

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tình trạng nhiễm nấm xâm lấn là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong và đau

ốm lâu dài ở những bệnh nhân ung thư và suy giảm miễn dịch Amphotericin B là kháng sinh chống nấm phổ rộng, hoạt tính mạnh, được sử dụng phổ biến trong điều trị hơn 40 năm nay Tuy nhiên, hạn chế của dược chất này là hầu như không tan trong nước nên sinh khả dụng thấp, đồng thời thuốc có nhiều tác dụng không mong muốn nhất là trên thận gây khó khăn cho việc sử dụng trong lâm sàng Vì vậy, bào chế hệ mang thuốc chứa Amphotericin B giúp giảm độc tính và tăng sinh khả dụng của thuốc là yêu cầu có ý nghĩa khoa học và tính cấp thiết

Nhiều hệ mang thuốc chứa Amphotericin B đã được nghiên cứu phát triển và ứng dụng trong lâm sàng như: phức hợp với cholesteryl sulfate (Amphotec), phức hợp lipid (Abelcel)… Trong đó, sử dụng liposome làm hệ vận chuyển thuốc cho thấy có nhiều ưu điểm nổi bật: tăng thời gian lưu thông thuốc trong tuần hoàn, khu trú tác dụng của thuốc tại cơ quan đích… Đây là một hướng nghiên cứu đầy triển vọng được các nhà khoa học trong nước và trên thế giới quan tâm

Hiện nay, Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội đã nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B bằng phương pháp hydrat hóa film, bốc hơi pha đảo

và bước đầu bào chế bằng phương pháp tiêm ethanol Để tiếp tục góp phần nghiên

cứu về liposome nói chung và liposome Amphotericin B nói riêng, đề tài “Nghiên

cứu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphoterin B bằng phương pháp tiêm ethanol” được tiến hành nhằm mục tiêu:

1 Bào chế liposome Amphotericin B bằng phương pháp tiêm ethanol

2 Bước đầu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Amphotericin B

1.1.1 Công thức hóa học

1.1.2 Đặc tính lý - hóa

* Lý tính:

- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [3], [14], [26]

- Độ tan: thực tế không tan trong nước, tan trong dimethyl sulphoxide (30-40 mg/ml) và trong propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid (2-4 mg/ml), rất

ít tan trong methanol [14] AmB hầu như không tan trong nước (< 0,1 mg/ml ở

210C), không tan trong cồn và trong chloroform Dung dịch chế phẩm loãng nhạy cảm với ánh sáng và bị mất hoạt tính ở pH thấp [3]

* Hóa tính:

Hóa tính chính của AmB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm carboxylic tự do, do đó AmB có tính chất sau: tính lưỡng thân và lưỡng tính Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung dịch kiềm Dung dịch AmB trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm

Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57-0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với 405 nm là 0,87-0,93 [3]

1.1.3 Tác dụng, dược lý, chỉ định, liều dùng

Trên mặt lâm sàng, AmB có thể chống lại Absidia spp., Aspergillus spp.,

Basidiobolus spp., Blastomyces dermatitidis, Candida spp., Coccidioides immitis,

Công thức phân tử: C47H73NO17 Khối lượng phân tử: 924 [14]

pKa: 5,5; 10 [3]

Conidiobolus spp., Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Mucor

spp., Paracoccidioides brasiliensis, Rhizopus spp., Rhodotorula spp và Sporothrix

schenckii [29] Mức độ nhạy cảm của nấm với AmB liên quan đến nồng độ

ergosterol có trong màng tế bào nấm [4]

* Cơ chế tác dụng:

AmB gắn vào phần ergosterol - sterol của màng tế bào nấm tạo nên các kênh ion làm rò rỉ các ion K+, Na+, Ca2+ và các phân tử nhỏ từ trong tế bào nấm ra ngoài, gây chết tế bào Ái lực của AmB với ergosterol - sterol của màng tế bào nấm và cholesterol - sterol của màng tế bào động vật có vú thể hiện ở hệ số ái lực (The affinity constant - Kaff) Kaff của ergosterol và cholesterol lần lượt là: 1,7 x 106

M-1; 0,2 x 106 M-1 Vì vậy, AmB có ái lực với ergosterol cao hơn rất nhiều so với cholesterol nên nó tác dụng mạnh lên tế bào nấm [19] Tuy nhiên, AmB vẫn gắn với sterol màng tế bào của người (chủ yếu cholesterol) nên giải thích được một phần độc tính của thuốc đối với người [4]

Bởi hạn chế hấp thu qua đường tiêu hoá, AmB được dùng chủ yếu qua đường tiêm tĩnh mạch Liều dùng cho AmB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày Trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày Các tác dụng phụ có dấu hiệu gia tăng khi liều vượt quá 35 mg/ngày [4]

1.1.4 Tác dụng không mong muốn (thường gặp)

- Phản ứng chung: rét run và sốt, đau đầu, đau cơ hoặc khớp

- Máu: thiếu máu đẳng sắc

- Tiêu hóa: rối loạn tiêu hóa, đau bụng, đi ngoài, buồn nôn, nôn, chán ăn

- Chuyển hóa: rối loạn điện giải, giảm kali huyết, giảm magnesi huyết

- Tiết niệu: giảm chức năng thận kèm tăng creatinin và urê huyết [4], [29]

1.2 Liposome

1.2.1 Khái niệm

Liposome là một nhóm của hệ đưa thuốc tới đích, cấu tạo gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng

tâm, có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1], [2], [11], [34]

Hình 1.1 Cấu trúc liposome [19]

1.2.2 Ưu, nhược điểm của liposome

* Ưu điểm

- Liposome được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao

nhất do PL được phân giải sinh học, không độc với cơ thể… [9], [40]

- Liposome có thể mang đồng thời cả DC thân nước và thân dầu [40]

- Cấu tạo tương tự màng sinh học nên liposome dễ dàng thấm qua tế bào làm tăng sinh khả dụng của DC, có thể mang DC tới nội bào để chữa bệnh nội bào Hoặc đưa DC tới đích nhờ gắn các ligand (ví dụ các mảnh kháng thể) trên màng

liposome [2], [9], [40]

- Làm thay đổi phân bố sinh học của một số DC có độc tính cao, dùng liều thấp như: thuốc điều trị ung thư, thuốc sát khuẩn… Làm giảm phân bố thuốc tại cơ quan lành, tăng phân bố tại đích so với DC tự do, làm giảm độc tính và tác dụng

không mong muốn, tăng hiệu quả điều trị… [2], [9], [40]

- Liposome bảo vệ DC tránh tác động bất lợi của ngoại môi trong quá trình bảo quản hay trên đường vận chuyển tới vị trí tác dụng trong cơ thể: pH, enzym, tác

nhân oxy hóa…, tăng độ tan của DC ít tan hoặc kéo dài tác dụng của thuốc [2], [9]

* Nhược điểm

Mặc dù có nhiều ưu điểm nhưng hiện nay chưa có nhiều chế phẩm ứng dụng

hệ vận chuyển thuốc liposome trên thị trường do một số nhược điểm sau:

- PL không bền về mặt hóa học nên độ ổn định của liposome ngắn Liposome

dễ bị thanh thải bởi hệ thực bào, thời gian tuần hoàn khó kéo dài Tỷ lệ liposome hóa của nhiều DC còn thấp đặc biệt với DC có phân tử lượng lớn [9]

- Có nhiều thông số tác động đến kích thước, chất lượng của liposome trong quá trình sản xuất dẫn đến khó kiểm soát sự đồng nhất giữa các lô mẻ, bên cạnh đó chi phí thực hiện khá cao nên khó triển khai sản xuất lớn [9], [39]

- Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ

để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi trường [30]

1.2.3 Phương pháp bào chế liposome

1.2.3.1 Các phương pháp bào chế liposome

Có nhiều phương pháp bào chế liposome được sử dụng:

- Phương pháp hydrat hóa film (phương pháp Bangham)

- Phương pháp bốc hơi pha đảo

- Phương pháp pha loãng ether

- Phương pháp sử dụng kênh vi lỏng

- Phương pháp đông khô

Trong đó phương pháp tiêm ethanol ngày càng được sử dụng rộng rãi trong bào chế liposome do có nhiều ưu điểm nổi bật

1.2.3.2 Bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol

a) Ưu, nhược điểm của phương pháp

- Thích hợp nạp các dược chất khác nhau: các phân tử protein, cả DC thân dầu

và thân nước, vitamin DC được liposome hóa bằng phương pháp tiêm ethanol rất

đa dạng như kanamycin, enrofloxacin, cyprofloxacin, indomethacin, triamcinolone [32], beclomethason với hiệu suất liposome hóa lên đến 93% [21] DC có thể gắn theo cơ chế thụ động: DC thân nước được hòa tan vào pha nước, DC thân dầu được hòa tan trong ethanol Cũng có thể gắn theo cơ chế chủ động ví dụ doxorubicin dựa trên sự chênh lệch pH giữa hai bên màng liposome Theo cơ chế thụ động, DC thân dầu đạt hiệu suất gắn vào liposome rất cao (~ 100%), hiệu suất gắn của DC thân nước rất thấp (~ 16%) Từ đó cho thấy phương pháp tiêm ethanol phù hợp cao hơn với việc liposome hóa DC thân dầu [9], [22]

- Tránh sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại cho sức khỏe con người như methanol, chloroform Đồng thời chế phẩm chứa một lượng nhỏ ethanol trong giới hạn cho phép có thể bảo quản chế phẩm tránh sự phát triển của vi khuẩn nấm mốc [17], [22], [28]

- Phương pháp này thích hợp cho sản xuất quy mô lớn [23], [36]

* Nhược điểm

- Hạn chế độ tan của PL trong ethanol (40 mM với phosphatidylcholin) [32]

- Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất và chất lượng liposome tạo ra Liposome thu được có nồng độ thấp do bị pha loãng, hiệu suất mang DC còn thấp nhất là với những DC tan trong nước [21], [22], [28]

b) Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp tiêm ethanol

Hình 1.2 Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp tiêm ethanol

Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp tiêm ethanol đến nay vẫn chưa thực sự được hiểu rõ ràng Có thể giải thích sự hình thành liposome theo các giai đoạn sau [9], [18], [23], [25]:

- Giai đoạn 1: Các phân tử PL hòa tan trong ethanol, tồn tại ở trạng thái tự do

- Giai đoạn 2: Khi pha ethanol được tiêm nhanh vào pha nước, ethanol bị pha loãng ngay lập tức và có một phần bay hơi Kết quả, do thay đổi dung môi làm cho các phân tử PL giảm độ tan và tập hợp thành các mảng lipid kép Các phân tử PL có đầu không phân cực hướng vào nhau còn đầu phân cực hướng ra ngoài tương tác với môi trường nước

- Giai đoạn 3: Dưới điều kiện có sự phân tán năng lượng đồng nhất trong môi trường bằng khuấy trộn hoặc siêu âm, các mảng lipid kép có xu hướng giảm diện tích tiếp xúc với môi trường nước nhằm bảo toàn năng lượng tự do bề mặt, các mảng lipid kép lớn dần lên và co lại thành cấu trúc hình cầu khép kín - liposome c) Quy trình bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol

Quy trình bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol được bố trí rất đơn giản: lipid và các thành phần tạo màng được hòa tan trong ethanol với nồng độ phù hợp, được tiêm nhanh vào pha nước thích hợp kết hợp khuấy trộn hoặc siêu âm ở tốc

độ phù hợp DC được hòa tan dung dịch ethanol hoặc trong môi trường nước phụ thuộc vào độ tan của nó Do thay đổi dung môi, các SUV có kích thước khoảng 25 nm được tạo thành Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome [2], [9], [16], [21]

Hình 1.3 Sơ đồ phương pháp tiêm ethanol bào chế liposome

Hiệu suất và chất lượng liposome tạo thành phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tỷ lệ pha ethanol/pha nước; nồng độ PL trong dung dịch ethanol và trong pha nước; loại

pha nước được sử dụng (nước tinh khiết, đệm phosphat, đệm Hepes ), nhiệt độ của pha nước, đường kính bơm kim tiêm, tốc độ khuấy trộn… [17], [18]

Dựa trên nguyên lý phương pháp tiêm ethanol được mô tả bởi Batzri và Korn năm 1973 ngày càng có nhiều cải tiến để hạn chế các nhược điểm của phương pháp tiêm ethanol truyền thống, tối ưu hóa quá trình tạo liposome, nạp thuốc và thích hợp cho áp dụng quy mô lớn với chi phí thấp nhất

Gentine Philippe và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu một số dung môi thân nước thay thế cho ethanol sử dụng trong phương pháp tiêm ethanol như propanol, butanol, isopropanol, ethyl acetat… Kết quả cho thấy chỉ có isopropanol tạo liposome có kích thước nhỏ (84,8 ± 5,5 nm), PDI nhỏ (0,224 ± 0,012) và không phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khảo sát như nồng độ PL, thể tích dung môi, tốc độ bơm, tốc độ khuấy trộn Tác giả cho rằng có thể dùng isopropanol để thay thế cho

ethanol trong sản xuất liposome [18]

Gentine Philippe và cộng sự (2013) đã phát triển một phương pháp tiêm ethanol thay đổi với quy trình bào chế như sau: các thành phần lipid được hòa tan trong hỗn hợp chloroform và methanol (9:1 v/v), dung môi được bay hơi ở áp suất giảm tạo lớp film lipid khô Lớp film này được hòa tan với thể tích thích hợp ethanol tuyệt đối ở 600C, sau đó được tiêm vào pha nước ở 700C, khuấy từ tiên tục trong khoảng 10 phút Cô quay dưới áp suất giảm để loại ethanol, thu hỗn dịch liposome Với phương pháp này tỷ lệ ethanol/pha nước - ethanol có thể đạt tới 60% (v/v) mà không ảnh hưởng đến quá trình tạo liposome, với phương pháp truyền thống cần hạn chế dưới 10% Đồng thời, nồng độ hỗn dịch liposome thu được gấp

10 đến 30 lần Khi thực hiện ở tỷ lệ 33% thì yếu tố nồng độ lipid, điện tích lipid, loại pha nước sử dụng ít ảnh hưởng đến KTTP (91,3 ± 3,7 nm), PDI nhỏ (0,218 ± 0,011) và quy trình có độ lặp lại lớn [17]

Phương pháp tiêm ethanol hiện nay được cải tiến bằng cách sử dụng hệ thống kim phun (crossflow injection technique) nhằm nâng cao quy mô bào chế với sự lặp lại lớn giữa các lô mẻ Pha nước, pha ethanol được làm nóng tới 55oC Pha nước được bơm liên tục nhờ bơm nhu động từ (2) sang (3), quay trở lại (2), trong quá

trình bơm khi pha nước đi qua hệ thống kim phun, pha ethanol có hòa tan PL được bơm dưới áp lực nén của (5) qua thiết bị đầu kim phun (1) để tạo liposome Hệ thống có nhiều ưu điểm: KTTP không phụ thuộc vào đường kính kim và nồng độ lipid sử dụng cao hơn gấp 5-10 lần phương pháp truyền thống mà không ảnh hưởng đến KTTP tạo ra [41], [42]

Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống kim phun [42]

Phương pháp tiêm ethanol còn được cải tiến bằng cách dùng màng tiếp xúc: pha nước được bơm vào lòng màng tiếp xúc còn pha ethanol được nén thành các tia nhỏ qua lỗ xốp của màng, liposome được tạo ra ngay lập tức khi lipid hòa tan trong pha ethanol tiếp xúc với pha nước trong lòng màng Hỗn dịch liposome tạo thành được hứng vào bình hứng và khuấy trộn trong khoảng 15 phút (phụ lục 1) Thiết bị này tạo ra liposome nhỏ kích thước dưới 100 nm và tương đối đồng nhất,

dễ triển khai ở quy mô lớn [9], [21] Tác giả Chiraz Jaafar-Maalei đã dùng phương pháp này để bào chế liposome indomethacin (hiệu suất liposome hóa đạt 63%) và liposome beclomethason (hiệu suất liposome hóa đạt 93%) [21]

1.3 Liposome Amphoterin B

1.3.1 Cấu trúc liposome Amphotericin B

Thành phần của liposome Amphotericin B:

1 Hệ thống kim phun 2,3 Pha nước

4 Pha ethanol

5 Thiết bị nén khí nito

6 Bơm nhu động

Hình 1.5 Cấu trúc liposome Amphotericin B [12]

DSPG (khối lượng phân tử: 801,06) ngoài vai trò tham gia tạo thành lớp lipid kép, còn đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình thành của L-AmB: DSPG ở dạng muối Natri khi được hòa tan trong môi trường pH trung tính không proton, muối này phân ly, nhóm phosphat mang điện tích âm hay phân tử DSPG tích điện

âm Khi acid hóa môi trường ở pH 1-3, DSPG nhận một proton và tạo thành một phân tử trung hòa về điện tích AmB thêm vào dung dịch acid hóa trên, proton của nhóm phosphate sẽ được chuyển cho nhóm amin của AmB Kết quả là các phân tử AmB tích điện dương Đồng thời, nhóm phosphate của PL mang điện tích âm do từ

bỏ một proton Do đó sự tích điện trái dấu, các phân tử thu hút nhau, tạo thành phức giữa AmB và DSPG [33] Liên kết của AmB với lớp lipid kép còn được tăng cường bởi tương tác kỵ nước giữa chuỗi hydrocarbon béo của PL và chuỗi polyen của

DC mang Nếu không Chol thì lớp PL của liposome dễ tương tác với protein huyết tương như albumin, transferrin, macroglobulin dẫn tới giảm độ ổn định của liposome [9]

Trong thành phần của liposome chứa PL có nhiệt độ chuyển pha cao, Chol giúp tiểu phân giảm được sự phá hủy của lipoprotein tỉ trọng cao (HDL) HDL sẽ loại bỏ PL ra khỏi tiểu phân liposome, hậu quả làm phá vỡ cấu trúc màng lipid và rò

rỉ DC mang trong qua trình lưu thông của liposome trong tuần hoàn [19] Ngoài ra, trong L-AmB, Chol có ái lực tốt với AmB nên tạo liên kết với AmB góp phần đưa

DC vào pha dầu của cấu trúc liposome, giúp ổn định cấu trúc này, hạn chế rò rỉ DC

và giúp liposome vận chuyển AmB tới đích tác dụng Chỉ khi nào tiếp xúc với sterol của tế bào nấm - ergosterol thì AmB trong liposome mới được giải phóng do có ái lực cao hơn với sterol này [33], [35]

Vì những lý do trên mà đề tài đã lựa chọn dạng bào chế liposome để nghiên

cứu hệ vận chuyển thuốc AmB

1.3.2 Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B

1.3.2.1 Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B trên thế giới

Deepak Singodia và cộng sự (2012) nghiên cứu bào chế L-AmB sử dụng Phosphatidylglycerol, Chol và DMPC (F - 1a) hoặc SPC (F - 2a) bằng phương pháp tiêm ethanol như sau: AmB hòa tan trong DMA được acid hóa bằng dung dịch HCl 0,1%, trộn lẫn với dung dịch lipid hòa tan trong ethanol rồi tiêm nhanh vào một thể tích lớn dung dịch dextrose 5% để thu được L-AmB Kết quả cho thấy các liposome bào chế bằng phương pháp này có KTTP khoảng 100 nm, thế zeta -43,3 ± 2,8 mV

và hiệu suất mang thuốc trên 95% đối với tất cả các mẫu, khả năng giải phóng dược

chất in vitro trong 24 giờ và giá trị IC50 của 2 công thức hầu như không có sự khác

biệt so với chế phẩm AmBisome [36]

Malika Skiba-Lahiani và cộng sự (2015) đã nghiên cứu bào chế L-AmB có thành phần DSPC, Chol và ceramid (CER) bằng phương pháp tiêm dung môi dùng cho đường uống như sau: lipid và AmB hòa tan trong methanol sau đó được tiêm với tốc độ 1 ml/phút vào pha nước là dung dịch NaCl 0.9% ở 250C Methanol được loại đi bằng đồng nhất hóa tốc độ cao (ultra-turrax) ở 24000 vòng/phút trong 10 phút Kết quả cho thấy thêm thành phần CER không ảnh hưởng đến KTTP (200 ± 4 nm) và khả năng mang thuốc (75 ± 2%) so với công thức không sử dụng Đồng thời, ưu điểm khi sử dụng CER giúp cho KTTP liposome ổn định và giảm khả năng giải phóng thuốc trong đường tiêu hóa dưới tác dụng của muối mật và các enzym phân giải lipid, tiểu phân được hấp thu vào máu và cho tác dụng Vì vậy, công thức L-AmB chứa CER thích hợp dùng cho đường uống [37]

1.3.2.2 Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B tại Việt Nam

Tại bộ môn Bào chế Đại học Dược Hà Nội, đã thực hiện các nghiên cứu bào

chế L-AmB bằng nhiều phương pháp khác nhau

Ths Đào Thị Thùy Dung (2013) đã nghiên cứu bào chế L-AmB bằng 2 phương pháp bốc hơi pha đảo và hydrat hóa film đồng thời đánh giá được các yếu

tố thuộc về công thức, quy trình bào chế, môi trường phân tán và nồng độ lipid ảnh

hưởng đến các đặc tính của liposome Với phương pháp bốc hơi pha đảo đã lựa chọn được công thức có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid là 3%; tỷ lệ SPC:Chol là 5:5; môi trường phân tán là đệm phosphate pH 7,4; có hiệu suất liposome hóa là 89,5%; KTTP 288 nm; PDI 0,262 Còn với phương pháp hydrat hóa film đã lựa chọn được công thức có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lipid là 3%; tỷ

lệ SPC:chol là 6:4; môi trường hydrat hóa là glucose 5%; hiệu suất liposome hóa đạt 98,18%; liposome có KTTP 160,8 nm và PDI 0,288 [5]

Phạm Thúy Ngọc (2014) đã bước đầu nghiên cứu bào chế liposome AmB bằng phương pháp tiêm ethanol và xác định được một số yếu tố thuộc về quy trình bào chế: tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước 8%, nhiệt độ pha nước khi phối hợp

600C, tốc độ khuấy trộn 3900 vòng/phút Tác giả đã lựa chọn công thức bào chế cho 10ml hỗn dịch: AmB 50 mg, HSPC 213 mg, Chol 52 mg đạt hiệu suất quy trình khoảng 65,59%, KTTP 177,8-204,3 nm, PDI 0,2-0,15 Đồng thời đánh giá L-AmB

về hình thái cấu trúc: hình ảnh chụp TEM cho thấy số lớp liposome ít hơn 3 [10]

Mai Thị Thùy Linh (2014) tiến hành nghiên cứu bào chế L-AmB sử dụng tá dược DSPG và HSPC bằng phương pháp hydrat hóa màng film, xây dựng công thức bào chế và bước đầu tiến hành đông khô L-AmB Tác giả đã lựa chọn công thức bào chế: tỷ lệ 9% mol dược chất/tổng lượng lipid, tỷ lệ 40% mol Chol/tổng lượng lipid, tỷ lệ HSPC/DSPG= 2/0,8, dung dịch hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 kết hợp với tá dược đông khô là mannitol cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI < 0,2) và hiệu suất liposome hóa cao (khoảng gần 90%) Sử dụng mannitol là tá dược tạo khung cho bánh đông khô khi phân tán lại liposome cho hỗn dịch màu vàng nhạt, không có tiểu phân kích thước lớn có thể quan sát được bằng mắt thường, không lắng cặn, KTTP nhỏ (205 nm), hỗn dịch đồng nhất ( PDI 0,157)

và hiệu suất liposome hóa khá cao (75,24%) [7]

1.4 Đông khô liposome

1.4.1 Độ ổn định của liposome

Liposome là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt hóa học, vật lý, sinh học

Sự thay đổi đặc tính lý hóa có thể xảy ra ngay trong quá trình bào chế cũng như

trong quá trình bảo quản Liposme được gắn thêm các phân tử PEG trên bề mặt có thể hạn chế sự kết tụ tiểu phân tuy nhiên hiệu quả không cao [38] Để khắc phục vấn đề này có nhiều phương pháp được áp dụng như đông lạnh, phun sấy… trong

đó kỹ thuật đông khô ngày càng được sử dụng phổ biển để tăng độ ổn định cho liposome [15] Một mặt, quá trình này giúp loại nước khỏi hỗn dịch liposome làm giảm quá trình thủy phân PL, mặt khác nó làm chậm quá trình biến đổi vật lý và hóa học của dạng bào chế do sản phẩm ở trạng thái rắn bền vững hơn [15], [38] Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng quá trình đông khô không ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của thuốc [30]

1.4.2 Quá trình đông khô

Quá trình đông khô gồm ba giai đoạn: đông lạnh, làm khô sơ cấp và làm khô

thứ cấp [8]:

* Giai đoạn đông lạnh:

Giai đoạn này phần lớn nước được tách ra khỏi dược chất và tá dược và đóng băng thành đá, hệ tách thành nhiều pha

* Giai đoạn làm khô sơ cấp:

Nước ở trạng thái đá sẽ thăng hoa trực tiếp sang dạng hơi ở điều kiện áp suất của buồng đông khô dưới áp suất hơi của nước đá Kết quả của quá trình này thể hiện ở độ dày của lớp băng giảm xuống còn độ dày của sản phẩm khô tăng lên do nước bay hơi tạo nhiều lỗ xốp trong sản phẩm

* Giai đoạn làm khô thứ cấp:

Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, lượng nước hấp phụ trong khối bột sẽ được loại ra khỏi sản phẩm

Yêu cầu sản phẩm sau đông khô phải có các đặc tính: ở dạng bánh thuốc, ổn định trong thời gian dài, thời gian hoà tan lại ngắn, duy trì được những đặc tính gốc của dạng ban đầu (tính chất của dung dịch, cấu trúc của protein hay kích thước tiểu phân của hỗn dịch) [8]

Cả quá trình ĐK và quá trình phân tán trở lại để tạo hỗn dịch liposome đều gây những tác động có thể ảnh hưởng cấu trúc và tính nguyên vẹn của lớp màng kép

của liposome Quá trình ĐK sẽ phá vỡ liên kết hydro hình thành giữa phân tử nước

và đầu phân cực của phân tử PL làm phá vỡ cấu trúc liposome, tạo thành các mảnh lipid kép Khi được phân tán lại trong môi trường nước, các mảnh lipid kép này sẽ kết tập với nhau tạo tiểu phân có kích thước tăng lên đáng kể, đồng thời gây rò rỉ

DC mang Để hạn chế hiện tượng này, người ta thường cho vào công thức đông khô các loại đường như glucose, lactose, sucrose, trehalose… Chúng có 2 vai trò chính: vừa là tá dược tạo khung cho bánh đông khô vừa có tác dụng bảo vệ cấu trúc liposome (lyoprotectant) do tạo liên kết hydro với phospholipid thay thế nước, hạn chế sự tá động của tinh thể đá lên lớp màng kép trong quá trình đông lạnh, đồng thời bao bọc liposome ngăn cách chúng tương tác với nhau khi ở trạng thái rắn Tỷ

lệ đường/lipid có thể là 5; 8 hay 10 tùy thuộc vào nồng độ lipid trong công thức đông khô [38] Quá nhiều các đường này có thể sẽ làm chậm hay gây nứt lọ trong quá trình đông khô và làm chậm thời gian phân tán lại tạo hỗn dịch liposome [6], [8] Ngoài ra, trong công thức ĐK thường sử dụng thêm một lượng nhỏ mannitol hay glycerol giúp duy trì sự đồng nhất của hỗn dịch sau ĐK [38]

Brigitte Stark và cộng sự (2010) tiến hành đánh giá khả năng bảo vệ của các loại đường lên tính toàn vẹn của tiểu phân liposome - PEG hóa sau đông khô Kết quả cho thấy, nếu không sử dụng tá dược bảo vệ thì KTTP tăng lên đáng kể, ngược lại KTTP thay đổi không có ý nghĩa trước và sau đông khô khi sử dụng đường với

tỷ lệ mol đường/lipid là 5 Bên cạnh đó, sử dụng đường đôi trehalose và lactose đạt PDI nhỏ (< 0,15) so sánh với đường đơn glucose (PDI ≈ 0,3), điều này cho thấy sử dụng đường đôi có hiệu quả bảo vệ tốt hơn đường đơn [38]

Vinayagam Kannan và cộng sự (2014) đã đánh giá sự rò rỉ DC paclitaxel khỏi liposome - PEG hóa sau đông khô khi có và không sử dụng tá dược bảo vệ sucrose Kết quả cho thấy, khi không sử dụng sucrose, hiệu suất liposome hóa giảm

5 lần, ngược lại sử dụng sucrose ở tỷ lệ mol đường/lipid = 5 sự rò rỉ DC là không có

ý nghĩa, đồng thời KTTP thay đổi không đáng kể (tăng từ 87,5±2,5 nm lên 119,2 ± 2,2 nm và PDI đạt 0,250 ± 0,011) Mẫu đông khô ổn định trong 3 tháng khi được bảo quản ở 50C [24]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Liposome Amphotericin B

Thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B

- Nguyên liệu:

Bảng 2.1 Nguyên liệu

1 Acid acetic băng Merck - Đức NSX

2 Acid hydrochloric Trung Quốc NSX

3 Acetonitril dùng cho HPLC Merck - Đức NSX

4 Amphotericin B chuẩn Dr.Ehrenstorfer - Đức NSX

5 Amphotericin B Trung Quốc USP

6 Cholesterol Sigma-Aldrich NSX

7 Dinatrisuccinat hexahydrat Trung Quốc TKHH

8 Distearoyl phosphatidylglycerol Lipoid- Mỹ NSX

9 Đường sucrose Fisher – Anh BP

10 Ethanol tuyệt đối Trung Quốc TKHH

11 Hydrogenated soybean

phosphatidylcholine Lipoid– Mỹ NSX

12 Methanol dùng cho HPLC Merck - Đức NSX

13 Mannitol Trung Quốc TKHH

14 N,N-dimethylacetamid Trung Quốc NSX

15 Natri acetate trihydrat Trung Quốc NSX

16 Nước tinh khiết Việt Nam DĐVN

- Phương tiện nghiên cứu:

+ Bơm tiêm 10 ml/cc, 5 ml/cc với các đầu kim 20G×31/2”, 22G×31/2”, 25G×31/2”, 27G×31/2” (Vinahankook – Việt Nam)

+ Máy đồng nhất hoá CAT Unidrive X1000 (Ingenieurbüro CAT – Đức) + Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh) + Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Water e-2695 Mỹ

+ Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros Filter Moducles, màng polysulfone, kích thước lỗ l0 kD, diện tích lọc 20 cm2

( Mỹ)

+ Kính hiển vi điển tử truyền qua (TEM) JEOL 1010 (Nhật Bản)

+ Bể điều nhiệt (hãng Buchi- Đức) Bể siêu âm Wise clean (Hàn Quốc)

+ Máy đông khô Labocono Freezone Triad 740030.

+ Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab và các dụng cụ khác

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AmB trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức và quy trình bào chế đến đặc tính của L-AmB được bào chế theo phương pháp tiêm ethanol

- Đánh giá ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến đặc tính của L-AmB trước và sau đông khô, đề xuất quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô L-AmB

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế liposome Amphotericin B

Quy trình bào chế L-AmB theo phương pháp tiêm ethanol:

Dựa vào tài liệu tham khảo [10], [36] đưa ra quy trình bào chế L-AmB với các bước tiến hành như sau:

- Chuẩn bị pha nước: cân, hoà tan tá dược tạo khung thích hợp và dinatrisuccinat trong nước tinh khiết tạo tạo pha nước có nồng độ đệm dinatrisuccinat 10 mM, pH 5-6 (điều chỉnh pH bằng dùn dịch HCl 2,5 N)

- Chuẩn bị pha ethanol:

 Cân và phân tán AmB trong 1,5 ml DMA, acid hóa bằng dung dịch HCl 2,5

N lắc cho AmB tan hoàn toàn (1)

 Cân và phân tán DSPG trong 3 ml ethanol, tiến hành siêu âm ở 60-650

C tạo hỗn dịch mịn (2)

 Cân, hòa tan HSPC và Chol trong 3,5 ml ethanol ở 60-650C (3)

- Phối hợp (1) và (2) ở 60-650C duy trì pH 1-3 bằng HCl 2,5 N, lắc đến khi thu được dung dịch đồng nhất Thêm (3) vào dung dịch đã thu được, bổ sung ethanol vừa đủ thể tích 8 ml và duy trì nhiệt độ ở 60-650C

- Phối hợp hai pha: tiêm nhanh 8 ml pha ethanol vào 100 ml pha nước ở

60-650C thông qua một kim tiêm trong điều kiện đồng nhất hóa ở tốc độ 3900 vòng/phút và trong thời gian thích hợp

- Tiến hành giai đoạn lọc tiếp tuyến (LTT):

 LTT-cô đặc: cô đặc hỗn dịch thu được về 10 ml

 LTT-lọc rửa: loại AmB tự do bằng cách lọc rửa với 100 ml pha nước

- Bảo quản: đóng lọ, nút kín và bảo quản 2-80C tránh ánh sáng

2.3.2 Phương pháp đánh giá liposome Amphotericin B tạo ra

2.3.2.1 Phương pháp định lượng Amphotericin B trong hỗn dịch liposome Amphotericin B

Dựa trên tài liệu tham khảo [20], xác định hàm lượng AmB trong hỗn dịch

liposome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) như sau:

- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl Detector PDA, bước sóng 407 nm

Bảng 2.2 Chương trình gradient dung môi pha động

Thời gian

(phút)

Tốc độ dòng (ml/phút)

% đệm natri acetat

* Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg AmB chuẩn, hòa tan trong bình

định mức 100 ml bằng methanol vừa đủ, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 100 µg/ml Pha loãng với methanol thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp, lọc qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí

* Mẫu thử: Hút chính xác 0,5 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp

methanol:chloroform tỷ lệ 3:1 (v/v) trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích vừa đủ Pha loãng dung dịch trên bằng methanol thu được dung dịch thử có nồng độ thích hợp, lọc qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí

* Hàm lượng AmB trong chế phẩm được xác định bằng công thức:

Ct =

Trong đó:

Ct: nồng độ AmB trong hỗn dịch liposome (mg/ml)

St: diện tích pic mẫu thử (mAU.s)

Sc: diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s)

Cc: Nồng độ AmB trong mẫu chuẩn (mg/ml)

k: hệ số pha loãng

2.3.2.2 Hiệu suất quy trình (H%)

Hiệu suất quy trình (H%) được tính theo công thức:

H%=

Trong đó:

mt: khối lượng AmB trong hỗn dịch liposome (mg)

mc: khối lượng AmB cân ban đầu (mg)

2.3.2.3 Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome Amphotericin B

- Hình thức: L-AmB sau khi LTT phải là hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, đồng

nhất, không có kết tủa AmB tự do, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát bằng mắt thường

- Hình thái liposome: Sử dụng phương pháp chụp hiển vi điện tử truyền qua

(TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản xác định hình thái của liposome

- KTTP và phân bố KTTP: sử dụng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS)

với thiết bị Zetasizer ZS90 Mẫu thử được pha loãng 50-100 lần với nước cất rồi đem đo KTTP Đánh giá kết quả thông qua đồ thị phân bố kích thước theo thể tích, kích thước tiểu phân trung bình Zaverage (d.nm), chỉ số đa phân tán (PDI)

2.3.3 Đông khô liposome

2.3.3.1 Quy trình đông khô liposome Amphotericin B

Quá trình đông khô được thực hiện như sau:

 Hút chính xác 2 ml hỗn dịch L-AmB cho vào lọ thủy tinh thể tích 5 ml, đậy nắp hờ

 Đông khô theo quy trình:

 Giai đoạn đông lạnh: giảm nhiệt độ xuống -500

C và duy trì trong 8 giờ

 Giai đoạn làm khô sơ cấp: tăng nhiệt độ từ -500C lên -350C với tốc độ gia nhiệt là 0,250C/phút và duy trình trong 20 giờ

 Giai đoạn làm khô thứ cấp: tăng nhiệt độ từ -350C đến 250

C với tốc độ gia nhiệt 0,250C/phút và duy trình trong 8 giờ

2.3.3.2 Đánh giá liposome Amphotericin B sau đông khô

- Bánh đông khô: dạng khối xốp, màu vàng nhạt, đồng đều, không phân lớp

- Thời gian pha lại: khi thêm lượng nước cất tương ứng trước đông khô thì

quá trình pha lại tạo hỗn dịch L-AmB diễn ra nhanh trong khoảng 15 giây

- Hỗn dịch sau pha lại: hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, đồng nhất, không có kết

tủa AmB tự do, không có các tiểu phân kích thước lớn quan sát được bằng mắt thường

- KTTP, phân bố KTTP

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Mỗi thí nghiệm làm 3 lần và lấy kết quả trung bình Các số liệu được xử lý thống kê để xác định giá trị trung bình, độ lệch chuẩn SD, ở mức tin cậy p = 0,95

- Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excel

2.3.5 Điều kiện thí nghiệm

AmB bị mất hoạt tính khi tiếp xúc với ánh sáng, do đó quá trình bào chế và đánh giá cần thiết được tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN3.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng Amphotericin B trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

3.1.1 Độ đặc hiệu

- Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ AmB tương đương nhau

- Chuẩn bị mẫu trắng là mẫu có thành phần HSPC, DSPG và Chol tương tự mẫu thử và được pha loãng giống mẫu thử

- Tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng qua cột sắc kí, đánh giá pic sắc kí xuất hiện trên sắc kí đồ

* Nhận xét: Xuất hiện pic cân xứng, có thời gian lưu (tR) khoảng 5,6 phút trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử, không xuất hiện pic ở thời gian lưu này trên sắc kí đồ của mẫu trắng (phụ lục 4) Chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao, dược chất AmB có thời gian lưu khoảng 5,6 phút với điều kiện sắc kí trình bày ở

mục 2.3.2.1

3.1.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

- Chuẩn bị dung dịch AmB chuẩn có nồng độ khoảng 25 µg/ml

- Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc kí với điều kiện sắc kí như mô tả ở mục 2.3.2.1 theo dõi thời gian lưu (tR), diện tích pic (Spic) Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí

STT Thời gian lưu (t R )