2.3.2.1. Phương pháp định lượng Amphotericin B trong hỗn dịch liposome Amphotericin B Amphotericin B
Dựa trên tài liệu tham khảo [20], xác định hàm lượng AmB trong hỗn dịch liposome bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) như sau:
Điều kiện sắc ký
- Cột sắc kí: Cột Phenomenex-Gemini 5uC18-110A, kích thước cột 250×4,60 mm, đường kính hạt nhồi 5 µm.
- Pha động: Hỗn hợp acetonitril và đệm natri acetat 10 mM (pH 4) theo chương trình gradient dung môi pha động (v/v) (bảng 2.2).
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. Detector PDA, bước sóng 407 nm.
Bảng 2.2. Chương trình gradient dung môi pha động
Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút) % đệm natri acetat % acetonitril 0,00 1,00 70,0 30,0 4,00 1,00 40,0 60,0 8,00 1,00 20,0 80,0 9,00 1,00 60,0 40,0
* Mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 10 mg AmB chuẩn, hòa tan trong bình định mức 100 ml bằng methanol vừa đủ, thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ khoảng 100 µg/ml. Pha loãng với methanol thu được dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp, lọc qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí.
* Mẫu thử: Hút chính xác 0,5 ml mẫu thử, hòa tan bằng hỗn hợp methanol:chloroform tỷ lệ 3:1 (v/v) trong bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích vừa đủ. Pha loãng dung dịch trên bằng methanol thu được dung dịch thử có nồng độ thích hợp, lọc qua màng 0,45 µm trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc kí.
* Hàm lượng AmB trong chế phẩm được xác định bằng công thức:
Ct =
Trong đó:
Ct: nồng độ AmB trong hỗn dịch liposome (mg/ml). St: diện tích pic mẫu thử (mAU.s)
Sc: diện tích pic mẫu chuẩn (mAU.s)
Cc: Nồng độ AmB trong mẫu chuẩn (mg/ml). k: hệ số pha loãng.