Điều kiện thí nghiệm

AmB bị mất hoạt tính khi tiếp xúc với ánh sáng, do đó quá trình bào chế và đánh giá cần thiết được tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng.

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 3.1. Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định lƣợng Amphotericin B trong hỗn dịch liposome bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

3.1.1. Độ đặc hiệu

- Chuẩn bị mẫu chuẩn, mẫu thử có nồng độ AmB tương đương nhau.

- Chuẩn bị mẫu trắng là mẫu có thành phần HSPC, DSPG và Chol tương tự mẫu thử và được pha loãng giống mẫu thử.

- Tiêm mẫu chuẩn, mẫu thử, mẫu trắng qua cột sắc kí, đánh giá pic sắc kí xuất hiện trên sắc kí đồ.

* Nhận xét: Xuất hiện pic cân xứng, có thời gian lưu (tR) khoảng 5,6 phút trên sắc kí đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử, không xuất hiện pic ở thời gian lưu này trên sắc kí đồ của mẫu trắng (phụ lục 4). Chứng tỏ phương pháp có độ đặc hiệu cao, dược chất AmB có thời gian lưu khoảng 5,6 phút với điều kiện sắc kí trình bày ở mục 2.3.2.1

3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

- Chuẩn bị dung dịch AmB chuẩn có nồng độ khoảng 25 µg/ml.

- Tiêm mẫu 6 lần qua cột sắc kí với điều kiện sắc kí như mô tả ở mục 2.3.2.1 theo dõi thời gian lưu (tR), diện tích pic (Spic). Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí

STT Thời gian lƣu (tR) (phút)

Diện tích pic (Spic) (mAU.s) 1 5,606 1309969 2 5,588 1309678 3 5,594 1309601 4 5,582 1296938 5 5,589 1299925 6 5,591 1301446 TB 5,912 1304593 RSD% 0,14 0,45

* Nhận xét: Điều kiện sắc kí cho kết quả có độ lặp lại cao về thời gian lưu, diện tích pic với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%, chứng tỏ hệ thống sắc kí trên đảm bảo tính thích hợp cho phép định lượng AmB.

3.1.3. Tính tuyến tính

- Pha dãy dung dịch AmB chuẩn có nồng độ lần lượt 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40 µg/ml.

- Tiến hành tiêm mẫu qua hệ thống sắc kí, thu được diện tích pic của từng nồng độ dung dịch AmB chuẩn.

- Kết quả diện tích pic của các dung dịch AmB chuẩn được thể hiện ở bảng 3.2, sự tương quan giữa nồng độ AmB và diện tích pic được thể hiện ở hình 3.1.

Bảng 3.2. Tương quan giữa nồng độ AmB và diện tích pic

STT Nồng độ AmB (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s)

1 10 535148 2 15 793702 3 20 1055328 4 25 1309969 5 30 1583122 6 35 1863179 7 40 2104649

Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ AmB và diện tích pic.

Nồng độ AmB (µg/ml) Diện

tích pic (µV.s)

* Nhận xét:

- Từ kết quả trên cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ AmB với diện tích pic.

- Phương pháp có độ tuyến tính trong khoảng từ 10 đến 40 µg/ml với hệ số tương quan tuyến tính r ≈ 1,000.

3.1.4. Độ chính xác

- Tiến hành định lượng 6 lần với một mẫu mẫu chế phẩm thử, mỗi lần định lượng tiêm mẫu 01 lần.

- Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của hệ thống sắc kí

STT Diện tích pic (mAU.s)

1 1063779 2 1078622 3 1060442 4 1050567 5 1051289 6 1052519 TB 1059536 RSD% 1,02

* Nhận xét: Phương pháp có độ chính xác cao với giá trị độ lệch chuẩn tương đối RSD < 2%.

3.1.5. Độ đúng

- Tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng để thu được dung dịch mẫu tự tạo có nồng độ khoảng 15, 20, 25 µg/ml, mỗi nồng độ tiến hành trên 3 mẫu riêng biệt. Tiến hành định lượng lại lượkng chuẩn trong các mẫu trên, từ đó tính toán được % thu hồi của mỗi nồng độ và của 9 mẫu tự tạo.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng của hệ thống sắc kí. STT Nồng độ AmB ban đầu (µg/ml) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ AmB

thu hồi (µg/ml) % thu hồi

1 15 676541 14,99 99,95

2 15 679798 15,07 100,43

3 15 678665 15,04 100,27

Diện tích pic chuẩn 676848 TB 100,22

RSD% 0,24

1 20 911535 19,80 98,99

2 20 924120 20,07 100,37

3 20 922721 20,04 100,21

Diện tích pic chuẩn 920755 TB 99,86

RSD% 0,75

1 25 1184609 24,68 98,74

2 25 1201927 25,04 100,19

3 25 1195221 24,91 99,63

Diện tích pic chuẩn 1199666 TB 99,52

RSD% 0,73

TB% của 9 kết quả (n=9) 99,87

RSD% của 9 kết quả (n=9) 0,29

* Nhận xét: Phương pháp có độ thu hồi từ 98-102% với RSD < 2% tại mỗi nồng độ và RSD < 2% cho cả 9 mẫu tự tạo. Do đó, phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.

* Kết luận: Phương pháp định lượng AmB trong liposome bằng HPLC đạt các yêu cầu về độ đặc hiệu, tính thích hợp, tính tuyến tính, độ đúng và độ chính xác. Do vậy có thể ứng dụng phương pháp này để định lượng AmB trong chế phẩm liposome AmB.

3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố thuộc về công thức và quy trình bào chế đến đặc tính của liposome Amphotericin B trình bào chế đến đặc tính của liposome Amphotericin B

3.2.1. Ảnh hưởng của yếu tố công thức đến đặc tính của liposome Amphotericin B B

3.2.1.1. Vai trò của DSPG trong liposome Amphotericin B

So sánh hai công thức bào chế L-AmB có và không sử dụng tá dược DSPG theo phương pháp tiêm ethanol trong nghiên cứu trước đó [10] để thấy vai trò của DSPG trong L-AmB.

Thành phần công thức bào chế, KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất quy trình được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5. Thành phần công thức bào chế và các đặc tính của L-AmB thu được

Không sử dụng DSPG [10] Có sử dụng DSPG Thành phần công thức bào chế AmB: 54,1 µmol HSPC: 271,8 µmol Chol: 134,7 µmol AmB: 54,1 µmol HSPC: 271,8 µmol Chol: 134,7 µmol DSPG: 104,9 µmol Zaverage (d.nm) 190,87±13,25 96,69±7,56 PDI 0,140±0,0274 0,226±0,0166

Hiệu suất quy

trình (H%) 65,59±1,55 82,34±0,65

* Nhận xét:

Công thức sử dụng DSPG đạt KTTP tương đối nhỏ (< 100 nm) và tương đối đồng nhất (PDI < 0,3), đồng thời hiệu suất quy trình là khá cao (> 80%) so sánh với công thức không sử dụng DSPG (KTTP ≈ 200 nm, PDI 0,140 và hiệu suất quy trình ≈ 66%).

Nguyên nhân có thể giải thích: khi không có DSPG, vị trí của AmB trong liposome có thể nằm trong lớp màng kép hoặc/và bám màng được lưu giữ bởi ái lực với Chol nhưng do cấu trúc khá lớn và cồng kềnh nên AmB chiếm không gian lớn, sự sắp xếp của AmB trên màng liposome không có sự định hướng rõ ràng, kết quả làm KTTP lớn [27]. Ngược lại, có DSPG phân tử AmB có sự định hướng rõ ràng trong lớp màng kép. Phân tử AmB có tính lưỡng thân: đầu phân cực (chứa nhóm

NH3+ tạo phức với nhóm phosphate - đầu phân cực của DSPG) hướng vào nhân nước của liposome hoặc hướng ra môi trường nước bên ngoài, còn phần thân dầu hướng vào bên trong lớp màng kép tương tác với phần thân dầu của DSPG, AmB chiếm vị trí không gian ít hơn, các mảng lipid kép tạo ra nhỏ hơn nên KTTP đạt được nhỏ hơn khi được bào chế theo phương pháp tiêm ethanol. Đồng thời, DSPG tạo phức với AmB nên tăng hiệu quả mang thuốc và lưu giữ AmB trong liposome, vì vậy làm tăng hiệu suất quy trình bào chế.

* Kết luận: DSPG trong liposome AmB có vai trò là làm giảm KTTP một cách đáng kể đồng thời tăng cao hiệu suất quy trình bào chế. Vì vậy, lựa chọn tá dược DSPG trong bào chế L-AmB để đạt KTTP nhỏ và hiệu suất quy trình cao hơn.

3.2.1.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến đặc tính của liposome Amphotericin B. a) Bố trí thí nghiệm: a) Bố trí thí nghiệm:

- Dựa trên tài liệu tham khảo [12], tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Chol đến đặc tính của L-AmB bằng cách cố định tỷ lệ các thành phần HSPC: DSPG:AmB = 2:0,8:0,4 và lần lượt thay đổi tỷ lệ % mol Chol so với tổng lượng lipid.

- Các thành phần công thức được mô tả ở bảng 3.6.

- Tiến hành bào chế các mẫu theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.1.

Bảng 3.6. Thành phần công thức bào chế L-AmB khi thay đổi tỷ lệ Chol/lipid

Công thức %mol Chol/Lipid HSPC (µmol) DSPG (µmol) AmB (µmol) Chol (µmol) M16 16 271,8 104,9 54,1 71,8 M20 20 271,8 104,9 54,1 94,52 M26 26 271,8 104,9 54,1 134,7 M36 36 271,8 104,9 54,1 217,6 M40 40 271,8 104,9 54,1 251,3 M46 46 271,8 104,9 54,1 321,2

Tất cả các công thức đều sử dụng pha nước có nồng độ sucrose 9%, kim 27G, tốc độ khuấy 3900 vòng/phút, thời gian khuấy trộn 10 phút.

KTTP, hiệu suất quy trình.

- Về cảm quan: Sản phẩm sau LTT là hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, đồng nhất, không có kết tủa AmB tự do, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát bằng mắt thường. Bảo quản sau 1 ngày ở 2-80C không thấy hiện tượng lắng cặn.

- Về hình thái: Quan sát hình ảnh chụp TEM cho thấy, các tiểu phân có hình cầu, phân bố KTTP tương đối đồng nhất (phụ lục 7).

- Kết quả đo KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất quy trình được trình bày ở bảng 3.7, hình 3.2 và hình 3.3.

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến đặc tính của L-AmB

Công thức

Trƣớc LTT Sau LTT Hiệu suất quy

trình (H%)

Zaveage (d.nm) PDI Zaverage (d.nm) PDI

M16 79,82±9,17 0,233±0,0115 78,32±4,87 0,239±0,0064 74,39±1,66 M20 80,71±7,29 0,242±0,0089 88,31±2,02 0,224±0,0215 80,57±1,87 M26 95,98±9,32 0,250±0,0143 96,69±7,56 0,226±0,0165 82,34±0,65 M36 84,94±3,96 0,228±0,0071 88,79±3,07 0,201±0,0179 86,61±2,89 M40 96,48±0,26 0,299±0,0313 98,34±1,97 0,234±0,0168 82,55±2,59 M46 75,38±0,94 0,202±0,0229 81,32±0,55 0,177±0,0060 80,34±0,52

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP (A) và PDI (B) trước và sau khi LTT

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến hiệu suất quy trình * Nhận xét:

- Về KTTP, phân bố KTTP: Kết quả cho thấy cùng tỷ lệ các thành phần công thức bào chế, khi thay đổi các tỷ lệ %mol Chol/lipid thì:

+ Các mẫu liposome thu được có KTTP tương đối nhỏ (< 100 nm), khác nhau không đáng kể và tương đối đồng nhất (PDI < 0,3). Kết quả này cũng thu được trong các bài nghiên cứu trên thế giới về phương pháp tiêm ethanol khi tỷ lệ Chol/lipid sử dụng dưới 50% [22], [31], [36]. Như vậy, với phương pháp tiêm ethanol khi tỷ lệ Chol/Lipid < 50% không ảnh hưởng đến KTTP liposome.

+ So sánh KTTP trước và sau khi LTT thì KTTP thay đổi không đáng kể. Tuy nhiên chỉ số PDI lại giảm nhiều, cho thấy hệ đồng nhất hơn. Nguyên nhân có thể do quá trình LTT làm giảm lượng ethanol, đồng thời nồng độ hỗn dịch tăng lên, các tiểu phân gần nhau hơn, xảy ra sự tái cấu trúc của tiểu phân vì vậy các tiểu phân đồng đều về kích thước hơn.

- Về hiệu suất quy trình: Đạt được khá cao (> 70%) cho các mẫu liposome. Trong đó cao nhất với tỷ lệ 36% Chol/lipid (86,61 ± 2,89%). Khi giảm hay tăng tỷ lệ Chol quá nhiều thì hiệu suất quy trình giảm. Nguyên nhân có thể là: Chol có ái lực nhất định với AmB để lưu giữ AmB trên màng liposome nên khi nồng độ Chol giảm thì hiệu suất quy trình giảm. Ngược lại, khi nồng độ Chol tăng cao hơn, Chol sẽ cạnh tranh vị trí của AmB trên lớp màng kép làm cho AmB bị đẩy ra khỏi màng kéo theo hiệu suất quy trình giảm. Kết quả này cũng thu được như trong bài nghiên

Hiệu suất quy trình (%) Mẫu liposome

cứu của Deepak Singodia và cộng sự (2012) [36].

* Kết luận: Qua khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến các đặc tính của liposome, cho thấy mẫu có tỷ lệ 36% Chol/lipid có hiệu suất quy trình là cao nhất (86,61 ± 2,89%), đồng thời KTPP khá nhỏ (88,79 ± 3,07 nm) và tương đối đồng nhất (PDI 0,201 ± 0,0179). Do vậy, lựa chọn tỷ lệ Chol/lipid là 36% để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.1.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB đến đặc tính của liposome Amphotericin B B

a) Bố trí thí nghiệm:

- Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG đến đặc tính của L-AmB bằng cách cố định tỷ lệ các thành phần HSPC:AmB = 2:0,4, tỷ lệ Chol/lipid là 36% và lần lượt thay đổi tỷ lệ mol của DSPG so với AmB.

- Các thành phần công thức được mô tả ở bảng 3.8.

- Tiến hành bào chế các mẫu theo phương pháp mô tả ở mục 2.3.1.

Bảng 3.8. Thành phần công thức bào chế L-AmB khi thay đổi tỷ lệ DSPG/AmB

Công thức Tỷ lệ mol DSPG/AmB HSPC (µmol) AmB (µmol) Chol (µmol) DSPG (µmol) M1,0/1 1,0/1 271,8 54,1 183,4 54,1 M1,5/1 1,5/1 271,8 54,1 198,7 81,2 M2,0/1 2,0/1 271,8 54,1 217,3 104,9 M2,5/1 2,5/1 271,8 54,1 229,1 135,3

Tất cả các công thức đều sử dụng pha nước có nồng độ sucrose 9%, kim 27G, tốc độ khuấy 3900 vòng/phút, thời gian khuấy trộn 10 phút.

b) Đánh giá một số đặc tính của L-AmB: hình thức, KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất quy trình.

- Về cảm quan: Sản phẩm sau LTT là hỗn dịch đục, màu vàng nhạt, đồng nhất, không có kết tủa AmB tự do, không có các tiểu phân có kích thước lớn có thể quan sát bằng mắt thường. Bảo quản sau 1 ngày ở 2-80C không thấy hiện tượng lắng cặn.

và hình 3.3.

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB lên các đặc tính của L-AmB

Công thức

Trƣớc LTT Sau LTT Hiệu suất

quy trình (H%) Zaverage (d.nm) PDI Zaverage (d.nm) PDI M1,0/1 92,90±4,34 0,237±0,0126 100,55±2,61 0,201±0,0090 70,51±0,67 M1,5/1 84,40±11,24 0,247±0,0136 94,72±10,94 0,203±0,0028 83,68±0,71 M2,0/1 84,94±3,96 0,228±0,0071 88,79±3,07 0,201±0,0179 86,61±2,89 M2,5/1 92,53±4,34 0,225±0,0137 94,67±3,94 0,203±0,0131 80,97±1,66

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB đến hiệu suất quy trình. * Nhận xét:

- Về KTTP, phân bố KTTP: Kết quả cho thấy cùng tỷ lệ các thành phần công thức bào chế, khi thay đổi tỷ lệ mol DSPG/AmB thì: các mẫu liposome thu được có KTTP tương đối nhỏ (≤ 100 nm), khác nhau về KTTP không đáng kể và tương đối đồng nhất (PDI < 0,3). KTTP thay đổi không có ý nghĩa trước và sau khi LTT, thu được PDI nhỏ hơn sau khi LTT. Kết quả này cũng thu được trong nghiên cứu của Deepak Singodia cùng cộng sự (2012) [36]. Như vậy tỷ lệ DSPG/AmB không ảnh hưởng đến KTTP khi bào chế theo phương pháp tiêm ethanol.

- Về hiệu suất quy trình: Thu được là khá cao (>70%) cho các công thức liposome, trong đó đạt được cao nhất với tỷ lệ 2,0/1 (86,61 ± 2,89%). Nguyên nhân có thể là do với tỷ lệ 2,0/1 hay 2 phân tử DSPG kết hợp với 1 phân tử AmB: 1 phân

Hiệu suất quy trình (%) Mẫu liposome

tử DSPG sẽ tạo phức với phân tử AmB còn 1 phân tử DSPG chứa các nhóm OH tạo liên kết hydro với các nhóm OH của phân tử AmB góp phần cố định AmB trên màng. Kết quả là giúp lưu giữ AmB chặt chẽ trong màng hơn làm giảm giải phóng sớm AmB ra khỏi màng sau quá trình bào chế.

* Kết luận: Qua khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB đến các đặc tính của liposome, cho thấy mẫu có tỷ 2,0/1 DSPG/AmB có hiệu suất quy trình là cao nhất (86,61 ± 2,89%), đồng thời KTPP khá nhỏ (88,79 ± 3,07 nm) và tương đối đồng nhất (PDI 0,201 ± 0,0179). Do vậy, lựa chọn tỷ lệ DSPG/AmB là 2,0/1 để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo.

Như vậy, thông qua các kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yêu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome, bước đầu đưa ra công thức bào chế hỗn dịch L-AmB như sau để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo:

Bảng 3.10. Công thức bào chế hỗn dịch L-AmB

Thành phần Số mol (µmol) Khối lƣợng (mg)

Amphotericin B 54,1 50

HSPC 271,8 213

DSPG 104,9 84

Cholesterol 217,3 84

Tỷ lệ mol các thành phần công thức

Chol/lipid = 36% DSPG/AmB = 2,0/1 HSPC/AmB = 2:0,4

3.2.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về quy trình bào chế đến đặc tính của

liposome Amphotericin B.

3.2.2.1. Ảnh hưởng của đường kính kim đến đặc tính của liposome Amphotericin B a) Thiết kế thí nghiêm: a) Thiết kế thí nghiêm: