Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật
Trang 1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYEN VAN LAM
NGHIEN CUU BAO CHE THUOC TIEM _
LIPOSOME DOXORUBICIN VA DANH GIA TAC DUNG TREN KHOI U DONG VAT
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2012
Trang 2
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYEN VAN LAM
NGHIEN CUU BAO CHE THUOC TIEM _
LIPOSOME DOXORUBICIN VA DANH GIA TAC DUNG TREN KHOI U DONG VAT
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
Trang 3LOD CAM On
Tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất tới: PGS TS Phạm Thị Minh Huệ
Cô đã giúp tôi có được những định hướng ban đầu ding dan trong quá
trình thực hiện đề tài, nhờ đó tơi có thể hồn thành được các mục tiêu của để
tài đê ra Trong quá trình tiến hành để tài, cô cũng thường xuyên quan tâm và ẩựưa ra các góp ý quan trọng để đề tài được hoàn thiện hơn
Xin tran trọng cảm ơn PGS.TS Vũ Mạnh Hùng-Bộ môn Dược lý, Học
viện Quân y và ThS Khánh Thị Nhỉ đã tận tỉnh giúp đỡ, chỉ bảo tôi khi tiễn hành đề tài đặc biệt là khi đánh giá tác dụng của thuốc trên động vật
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thấy cô, các anh chị kỹ
thuật viên của Bộ môn Bào chế- Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Dược ly —
Học viện Quân y, Phòng hiển vì điện tử - Viện vệ sinh dich té Trung ương đã luôn tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian nghiên cứu thực nghiệm
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bè bạn đã động viên, giúp đỡ tôi
Trang 4TT Viết tắt 1 2 10 11 12 13 14 21PC CHL DDVN DLS DOX DSPC DSPE DSPE- PEG EurP GUV HEPES HPLC
DANH MUC CAC TU VIET TAT
Từ/ cum tir day da
1,2-Diheneicosanoyl-sn -Glycero-3-Phosphocholin Cholesterol
Dược điễn Việt Nam
Dynamic Light Scattering — Tan xa anh sang động Doxorubicin
1,2-Distearoyl- sn -Glycero-3-Phosphocholin Distearoyl phosphatidyl ethanolamin
1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospho ethanolamin-N- {Methoxy (Polyethylene glycol)}
Encapsulation Efficient - Hiéu suat liposome héa
Enhanced Permeability and Retention effect - Hiệu ứng tăng
tính thắm và khả năng lưu giữ
European Pharmacopoeia (Dược điển Châu Ân)
Giant Unilamellar Vesicle — Liposome đơn lớp khống lồ
Trang 515 16 17 18 19 20 21 22 23 25 26 27 25 26 27 28 29 ITG KTTB LTSL LUV MLVs MVVs MWCO NTSL OLVs PB KTTP PDI PEG PS RES SPC SUV TCCS Inhibition Tumor Growth - Chỉ số ức chế sự phát triển khối u Kích thước trung bình Low Temperature Sensitive Liposome — Liposome nhay cam nhiệt độ thấp
Large Unilamellar Vesicle — Liposome đơn lớp lớn Multi Lamellar Vesicle — Liposome da lép
Medium Unilamellar Vesicle — Liposome don lớp trung bình Multi Vesicular Vesicle — Liposome da lép
Molecular Weight Cut Off - Giéi han khéi lrong phan tir Non Temperature Sensitive Liposome — Liposome khéng nhay cảm nhiệt độ
Oligo Lamellar Vesicle — LIposome đa lớp
Phân bồ kích thước tiểu phân
Polydispersity Index — Chỉ số đa phân tán
Polyethylen glycol Polysulfone
Reticuloendotheha System - Hệ lưới nội mô
Soy phosphatidyl choln - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành Small Unilamellar Vesicle — Liposome don lớp nhỏ
Trang 7MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮTT -222:+ttt2EE2222222 1 rr.m 4 IJ.9):8./1098:79eÁÝÁÝ 10 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỎ 'THỊ - EEEE1 c 11 ĐẶT VẤN ĐẺ 2222222.111221111111111111111221211211112127227721111111110122/22111111422.eessd 1 CHƯƠNG 1: TỎNG QUAN set 2 I0) 200i) 1n 2 II; ì 0 0.00) 8n 5 IZĂN( 1 2/8070), 18 5n 5
1.2.2 Các phương pháp bào chế Ïjp0sOfe -ttttEEEiiirrriirrid 10 1.2.3 Đưa thuốc vào ÏjÐOSOfme -ccccccccrrrrEEEEEEErrrrrrrrrrei 10 1.2.4 Đảnh gid TipOSOME ÍQO F + SĂ+Se<kiEEtEtiEkitxirkirkirrirrrerrrke 12 II: 00002009 00086 13
1.4 Sơ lược về mô hình đánh giá tác dụng chồng ung thư 21
B7Ne 1T n1 nsn.aOỤ ố 21
1.4.2 DONg VGt thurc NQNICM na 21
1.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng .ceccccccseesssrrerrrereersrkee 22
1.4.4 Các chỉ tiêu đánh gia hiệu quả điễều trị khối tú -ccccccee 22
CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
Trang 8, 9Š 4) /(0: 0ï) 0 24 2.3 Phương tiện nghiền €ỨU 5-5 s<++rekerrkerkerkrrerkerkerrerrkee 25 2.4 Phương pháp nghiên CỨUu - s5 5sSSs He EY111211117373 1x1, 26 2.4.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubiein 26 2.4.2 Phương pháp đánh giả lpOsOrn€ lqO Fd c«cc<<ccexeersresrre 29 2.4.3 Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin
¬— 32
2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin
trên chuột thực ng hÏỆƒM À + ScccrhErHgHHHHHHHHHHHHH H111 rrkee 32
2.5 Phương pháp xử lý số liệu - HH re 34 2.6 Điều kiện thí nghiệm -© 111 1 0.1 11 0.00000 140 6 34 CHƯƠNG 3: KÉT QUÁ THỰC NGHIM 222222 22222222222 35
3.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn DOX - ra 35 3.2 Nghiên cứu ảnh hướng của các thông số kĩ thuật của quá trình bào
chế đến các đặc tính của liposome doxorubicin -ccccc2ZZZZZevv 36
Trang 93.3.3 Sơ bộ đánh giá độ ổn định của thuốc tiêm liposome doxorubicin 53
3.4 Sơ bộ đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trên
khối u chuột thực nghiệm 2 2s++++°°211111111227711111111144122211142111112222222e 55
3.4.1 Đánh giá tác dụng của hỗn dịch liposome doxorubicin đối với thời gian sống trung bình của chuột nhất mang khối u dưới da 55 3.4.2 Đánh giá tác dụng của hôn dịch liposome doxorubicin đối với tỷ lệ sống sót của chuột nhất mang khối u dưới da -¿+ccccecccceczzccce 56 3.4.3 Đánh giá tác dụng của hôn dịch liposome doxorubicin đối với khối lượng khối u dưới da của chuột sau 3 ngày -c-ccccccccccccrrrrrrcce 57 3.4.4 Đánh giá tác dụng của hôn dịch liposome doxorubicin đối với thể tích khối u dưới da của chuột sau 3 ngày cccccccccccceeeccrrrrrree 58 3.4.5 Đánh giá tác dụng của hôn dịch liposome doxorubicin đối với khối lượng khối u cơ của chuột sau 3 ngày -ccccccccccccccrrrrrrrtrrrrrrrrree 59 3.4.6 Đánh giá tác dụng của hôn dich liposome doxorubicin d6i voi thé 7278:/1018/8 83./611 i 0889886 60
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN -222222c22©++ 222222411121112227722222211.112222222,Xe 62
4.1 Về quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml 62 4.2 Về đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome trên khối u chuột 70
Trang 10Bảng 1.1 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 1.4 Bảng 2.1 Bảng 3.1 Bảng 3.2 Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 Bảng 3.10 Bảng 3.11 Bảng 3.12 Bảng 3.13 Bảng 3.14 Bảng 3.15 Bảng 3.16
DANH MUC BANG
Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường
Phân loại liposome theo kích thước và cầu trúc .- -
Ưu nhược điểm của các phương pháp tỉnh chế liposome
Các tiêu chí đánh giả ÏIDOSOT6 cằc cà sàn cà se K se si se Nguyên vật liệu dung trong nghiÊH CỨUM ‹ <«- Diện tích pic của doxorubicin tại các nồng độ khác nhau
Phân bố kích thước hệ liposome 6 cac điều kiện siêu âm khác nhau Phân bố kích thước hệ liposome khi siêu âm thể tích nhỏ (10 ml)
Nong độ DOX còn lại theo thời gÌ4đ - cà cà sinh kien Ảnh hưởng của phương pháp đổi đệm đến hiệu suất liposome hóa
Ảnh hưởng của nhiệt độ ú DOX đến hiệu suất lịposome hóa
So sánh sự khác nhau của 2 mẫu liposome M7 và M8
Chất lượng thuốc tiém liposome doxorubicin 2 mg/ml bao ché ở các tHẺ khác HÌÏđI cà cà cà cà sọ «HH «TH kh eee cee tee cee ene aee eee en Tiêu chuán cơ sở đề xuất của thuốc tiêm liposome doxorubicin
Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin của mẻ ] trong thời gian bảO QHẲH c.c cà cà nh cee can casas ene in ke Kế ke ch ki Thời gian sống trung bình chuột mang u dưới da sau 30 ngày
Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày
Khi lượng khối u dưới da của chuột sau 30 ngày
Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày
Trang 11Hình 1.1 Hình 1.2 Hình 1.3 Hình 1.4 Hình 1.5 Hình 1.6 Hình 2.1 Hình 2.2 Hình 2.3 Hình 2.4 Hình 2.5 Hình 2.6 Hình 3.1 Hình 3.2 Hình 3.3 Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐÒ THỊ
Các cách mang dược chát của ÏjDOSOT€ .c cà cà cà
Kích thước của một số loại Ï]DOSOTH cà cà cà cà Ki HH kh kh xe,
Các loại ÏDOSOTN€ cee cee cee cee cance cee cae canes sae denne tae nee aae es
Minh họa hiệu ứng EPẨ cào cà Si THỊ KH HH He Ki HH gi ch xiên
Phương pháp đưa DOX vào liposome bằng chênh lệch amoni
Các phương pháp DOX qua màng ÏjDOSOTH€ cà Mô hình thi nghiệm đổi đệm bằng phương pháp thẩm tích
Cơ chế đổi đệm bằng lọc tiếp tuyẾn -.c cà cà cà cọc cá se sài Mô hình lọc tiếp tuyến thao tác bằng f4y các ccccetcetsetseterre Sơ đô hệ thống lọc tiếp tuyến tự động ào cà cà cá ch Sơ đô bào chế liposome doxorubicin sò vee ves ven cae ee vee So dé chia nhóm đánh giá tác dụng chống ung thư -
Mỗi tương quan giữa diện tịch pic với nông độ DOX
Ảnh chụp TEM ÏiDOSOIH€ esses cusses KỲ SH cv vớ Hàm lượng của DOX theo thời gian khi ủ DOX với liposome 6 50°C
Đồ thị so sánh hiệu suất liposome hóa MÌ và M2 ‹
Sơ đồ Bào chế các lọ chứa bột DOX đông khô
Sơ đồ bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml
Trang 12Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Hình 3.12
Tỷ lệ chuột mang u dưới da sống sót sau 30 ngày
Khả năng ức chế sự phát triển khối u dưới da Thể tích khối u dưới da của chuột sau 30 ngày Khả năng ức chế sự phát triển khối u cơ sau 30 ngày
Trang 13ĐẶT VẤN ĐÈ
Liposome là một trong những hệ mang thuốc mới đang nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới nhờ có nhiều ưu điểm về khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng đưa thuốc tới đích Ứng đụng lớn nhất của liposome hiện này là làm chất mang thuốc điều trị ung thư và đã có
một vài chế phẩm thương mại được bán trên thị trường với các dược chất như
doxorubicin (Doxil), daunorubicin (Daunoxome),
Nhằm bắt kịp các tiến bộ khoa học công nghệ trong lĩnh vược y dược trên thế
giới, trong những năm gần đây, trường đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nhiều đề
tài khoa học để đánh giá khả năng sử đụng liposome làm chất mang thuốc Trong đó
liposome doxorubicin được nghiên cứu nhiều nhất và đã thu được một số kết quả
đáng khích lệ Các kết quá nghiên cứu cho thấy chúng ta đã từng bước nắm được các kỹ thuật chế tạo liposome và cũng đã cho thấy tiềm năng của việc sử dụng liposome đoxorubicin trong điều trị ung thư
Đề tài “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin và đánh giá tác
dụng trên khối u động vật” được tiến hành đề phát triển dạng thuốc tiêm liposome
doxorubicin trên cơ sở các kết quả nghiên cứu bào chế liposome đã thu được Đề tài
được thực hiện với 2 mục tiêu:
1 Bào chế được thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ở quy mô phòng thí nghiệm và đưa ra tiêu chuẩn của thuốc tiêm liposome doxorubicin
2 Sơ bộ đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome doxorubicin trén khoi u
Trang 14CHUONG 1: TONG QUAN 1.1 Doxorubicin Công thức cấu tạo: - Công thức phân tử: - Khối lượng phân tử: 579,99
Tên khoa học: (8S,10S)-10-{(3-Amino-2,3 ,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexo
pyranosyl) oxy}-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-tri hydroxy-8-(2-hydroxy acetyl)-1-
methoxy-5,12-naphthacenedion [39]
Tính chất: Tỉnh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi Dung
dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5 Tan trong nước, methanol, acetonitr1l, tetrahydrofuran
Không tan trong cloroform, aceton, ethyl ethe, benzen [39]
Doxorubicin la chat nhay cam voi anh sáng ở nông độ thấp Tuy nhiên, ở
nồng độ điều trị thì doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh
sáng và không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ doxorubicin khỏi ánh sáng Thực tế thì đung địch doxorubicin trong NaCl 0,9% có thê ôn định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PVC ở 25°C và lâu hơn nếu bảo quản trong xylanh làm bằng polypropylen ở 4°C [39]
Dược động học
Sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến cách mô phổi,
Trang 15Khoang 40 - 50% luong doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 - 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa; 5% bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày Doxorubicin không qua được hàng rào máu não nhưng qua được nhau thai và bài tiết được qua tuyến
sữa [39]
Dược động học của liposome doxorubicin khác hắn so với doxorubicin dang
tu do Doxorubicin khi gan voi liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn Các liposome doxorubicin phân bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch máu không bình thường Dạng liposome doxorubicin không PEG hóa cũng cho thấy nồng độ đỉnh doxorubicin toàn phần trong huyết tương cao hơn so với khi sử dụng doxorubicin dạng thông thường [39]
Chỉ định
Doxorubicin có khả năng tiêu điệt nhiều loại tế bào ung thư và thường được sử dụng cùng các hóa trị liệu khác để diéu tri: u lympho dang Hodgkin va không Hodgkin, sacroma xương và mô mềm, bạch cầu cấp, u nguyên bào thần kinh, ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đạ dày, ung thư buồng trứng [39]
Liều dùng
Dạng thuốc tiêm dung dịch: Pha loãng với đung dịch glucose 5% hoặc dung dịch nước muối sinh lý 0,9% rồi truyền nhanh tĩnh mạch trong 3 phút hoặc lâu hơn
Nếu chỉ điều trị bằng doxorubicin thì liều sử dụng là 60-75 mg/m” tương đương 1,2 — 2,4 mg/kg thé trong, 3 tuần/lần Hoặc truyền 1 lần/ngày liều 20 mg/m”, truyền trong 3 ngày cách nhau 3 tuần
Nếu sử đụng cùng với thuốc chống ưng thư khác thì giảm liều xuống từ 30 - 60 mg/m’, truyén 1 lần trong 3 tuần
Trang 16Dang liposome PEG héa: Pha loang bang dung dich glucose 5% để truyền tinh mach Véi liéu duéi 90 mg pha trong 250 ml dung dich glucose 5%, liều trên 90 mg pha loang voi 500 ml dung dich glucose 5%
Truyền tĩnh mạch liều 20 mg/m” trong 30 phút, 2-3 tuần truyền 1 lần Với điều
tri ung thu vú và ung thư buống trứng, liều điều trị là 50 mg/m”, truyén trong 1 h, 1 lần trong 4 tuần Điều trị đa u tủy xương: truyền tĩnh mạch liều 30 mg/m” vào ngày thứ 4 sau khi sử dụng liệu pháp bortezoomid [39]
Dạng liposome không PEG hóa được sử dụng trong ung thư vú đi căn với liều tương tự như dạng doxorubicin tự đo Pha loãng chế phẩm bang dung dich NaCl
0,9% hoặc dung dich glucose 5% tới nồng d6 0,4-1,2 mg/ml, truyền tĩnh mạch trong
1 h cách nhau 3 tuần [39]
Doxorubicin có thể nhỏ trực tiếp vào bàng quang trong điều trị ung thư ác tính Nhỏ 50ml dung dịch doxorubicin 1 mg/ml trong 1h cách nhau 1 tuần hoặc l tháng [39] Bảng 1.1: Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường Dạng bào chế Tên chế phẩm Hãng sản xuất Korea United
Thuốc tiêm Adorucin lọ 5 ml, 25 ml, 2 mg/ml Pharma
dung dich Adriamycin lo 5 ml, 100 ml 2 mg/ml Pfizer
Doxorubicin Ebewe lo 5 ml/25 ml, 2 mg/ml Ebewe Pharma Bôt pha tiêm Adriblastina, lọ 10 mg, 50 mg Pharmacia Italia
Trang 171.2 Dai cwong vé liposome
1.2.1 Khai niém va phan loai
Liposome cé cấu tạo bao gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một
hay nhiễu lớp phospholipid kép, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn
nanomet [1] Cấu tạo của liposome được minh họa ở hình 1.1 và hình ï.3 Thành
phần chính của liposome là phospholipid, cholesterol Đây là những chất tương hợp
sinh học với cơ thể, và có thể phân giải được trong cơ thể nên có rất nhiều ưu điểm
khi sử dụng làm chất mang thuốc trong cơ thê 2 ‘ c3 2 Môi trường 5 4101171190129, a ngoai attht tee “ a4 \ 1114144411100) L fy, a4 \\Mf? ` “Oat Py a *4/ Fy „Đ > “Mf, © & "< - Sy Mi truong © ECA, trong liposom 4
Hình 1.1: Cac cach mang dugc chat cia liposome: 1- Dược chất trong khoang nước 2- Dược chất nằm giữa lớp lipid kép 3- Dược chất gắn vào đầu phân cực của
phospholipid 4- Dược chất liên kết với lớp lipid kép 5-
Dược chất liên kết với đầu không phân cực của phân tử phospholipid 6- Dược chất hấp phụ trên bê mặ lớp lipid
kép
Trong dược học, liposome được ứng dụng làm hệ mang thuốc và mô hình tế
bào nhân tạo Khi sử dụng liposome làm chất mang thuốc, được chất có thê phân bố trong khoang nước của liposome, phân bố giữa lớp phospholipid kép, tương tác và gắn với đầu không phân cực của phân tử phospholipid hoặc hấp phụ trên bề mặt của
lớp phospholidpid kép tùy thuộc vào đặc tính thân đầu nước của dược chất và tương tác hóa lí giữa dược chất với lớp phospholipid kép (hành 1.1) [33],[45] Một số được chất chỉ ôn định trong một số điều kiện nhất định, tuy nhiên môi trường ổn định
nhất cho được chất đôi khi lại không thích hợp với cơ thể đo đó làm giám khả năng
Trang 18liposome làm chất mang thuốc đo liposome có thể bao gói bên trong lớp lipid kép
môi trường tối ưu cho sự ỗn định của được chất nhưng lại được phân tán trong một
môi trường có điều kiện tương tự điều kiện sinh lý của cơ thể Vì thế có thể coi
liposome là 1 hệ mang thuốc lý tưởng
Bảng 1.2: Phân loại liposome theo kích thước và cấu trúc Loai liposome Ky | Kích thước Số lớp lipid hiệu (nm)
Liposome đơn lớp nhỏ SUV 20— 100 1 Liposome đơn lớp trung bình | MUV > 100 1 Liposome đơn lớp lớn LUV > 500 1
Liposome đơn lớp không lồ GUV | >1000 1
Liposome đa lớp nhỏ OLV | 100-1000 <5 Liposome đa lớp lớn MLVs > 500 5-25 Liposome da nhan MVVs > 1000 - ôo â Ow SUV LUV = ĐC MLVs MVVs Hình 1.2: Kích thước của một số loại liposome
Với ưu điểm trên, liposome nhanh chóng thu hút được sự quan tâm của các nhà bào chế trong nghiên cứu phát triển hệ mang thuốc mới trong cơ thê
Trang 19Xét theo cấu trúc lớp vo lại chia thành:
Liposome quy wée: 1a liposome cé cau tao 1ép vo chu yéu 1a phospholipid va cholesterol Day 1a dang liposome đầu tiên được nghiên cứu Liposome quy ước có
nhược điểm là rất dễ bị bắt và phá hủy bởi các đại thực bào trong máu và bởi hệ
thống lưới nội mô (RES - reticuloendothelial system) ở gan và lách; khả năng
hướng đích còn kém và thụ động, chủ yếu phụ thuộc vào kích thước của liposome
và khả năng đi qua khe hở thành mạch ở các mô ung thư, chưa kiểm soát được khả
năng giải phóng được chất Mặc dù vậy, nếu tế bào bị bệnh thuộc hệ thống thực bào
đơn nhân thì chính việc bị bắt giữ khi di chuyển trong hệ tuần hoàn lại là ưu điểm
của các liposome quy ước [36]
Liposome hiện đại: là các liposome đã thay đỗi câu trúc lớp vỏ nhằm khắc phục nhược điểm của liposome quy ước Các liposome hiện đại được phân loại rất khác nhau và cũng không rõ ràng giữa các nhà nghiên cứu Việc phân loại phụ thuộc nhà nghiên cứu muốn nhấn mạnh tính chất nào của liposome như khả năng tuần hoàn lâu trong cơ thể, khả năng hướng đích thụ động hay chủ động, khả năng kiểm soát giải phóng thuốc,
Liposome tuần hoàn dài (Long circulation liposome): Đề có thể tồn tại lâu
trong hệ tuần hoàn, bề mặt vỏ của các liposome thường được đưa thêm các nhóm phân tử thân nước có kích thước lớn như PEG, poly{N-(2-hydroxypropyl)} methacrylamid, poly-N-vinylpyrrolidon, polyvnyl alcol, phức hợp của L-amino acid với các polime phân hủy sinh học Nhờ đó liposome thoát khỏi sự tấn công của
đại thực bào và hệ thống lưới nội mô tại gan, lách Do khả năng tồn tại lâu trong
vòng tuần hoàn nên khả năng tập trung thuốc của liposome tại mô đích tăng Khá năng tập trung tại mô đích của các liposome loại này được gọi là hiệu ứng tăng tính
thấm và khả năng lưu (EPR — Enhanced permeability and retention effect) [36], [
41], [ 42] Các liposome hướng đích nhờ hiệu ứng này được xếp vào nhóm hướng
Trang 20Liposome mién dich (Immunoliposome): Tén goi nay chi cdc liposome được
gắn lên bề mặt các phân tử có khả năng nhận biết va liên kết với tế bào đích (các
nhóm nhận đích - target ligand) Các chất hướng đích đầu tiên được sử dụng là các khang thé IgG nén liposome này được gọi là liposome miễn dịch Hiện nay đã phát
triển thêm nhiều nhóm nhận đích khác mà không phải là các kháng thể, nên các
liposome về sau đều gọi tên theo nhóm hướng đích được gắn, tuy nhiên chúng vẫn xếp vào loại liposome miễn dịch (immunoliposome) Một số nhóm hướng đích khác
được nghiên cứu là: các kháng thể đơn đòng CC53, CC531, CD19; khang thé HER-
2; kháng thể kháng receptor folat (anti-FR); kháng thể kháng receptor tranferin (anti- TfR) [36], [ 42] Các liposome nhóm này có khả năng hướng đích chủ động D E “th i be »- * 3 ẴẰSXxxi vV vớ : Né lý 2, 2 4) a + ụ ae ee + š$ SĐš ỹ ợ =O Ễ ị ¬ƯŠ =O % tr @- ` Mu dế po < Wy Rove? » { + k pr a / Ws Nà ; > | ge” _f \ o n m
Hinh 1.3: Cac loai liposome:
A Liposome quy ước: a- thuốc tan trong nước; b-thuốc tan trong dâu B Liposome mién dich: c,d- khang thé gan trén bé mat liposome C: Liposome tén tại lâu: e- các phân tử PEG
D: Liposome miễn dịch tôn tại lâu
Trang 21Liposome miễn địch tuân hoàn dài (Long-circualating Immunoliposome): Day
là loại liposome kết hợp các ưu điểm của iiposome tôn tại lâu và liposome miễn địch nhằm cải tiến hơn nữa khả năng mang thuốc tới đích của liposome Đặc điểm cấu tạo của liposome này sẽ có lớp áo polyme bảo vệ ở bên ngoài và các chất hướng đích sẽ được gắn vào đuôi các phân tử polyme bảo vệ hoặc gắn lên vỏ liposome [42] Mö thường ` * gl aK bi * 2M OH xne ha thant ‘Sp + mach #% Liposome iY F:: f * at | » Thuộc tự do — `#_` ` = i -* — 1 hè:
Mô ung thư
Hình 1.4: Minh họa hiệu ứng EPR
Các nghiên cứu hiện nay tập trung vào kiểm soát giải phóng thuốc khỏi liposome và đã chế tạo ra các liposome thông minh chỉ giải phóng thuốc khi nhận
được những kích thích đặc hiệu tại mô đích Các liposome này được gọi la liposome
cảm tmg (Stimuli — sensitive liposome hay Trigger liposome) Trong thanh phần
cấu tạo vỏ của các liposome cảm ứng có chứa một tỉ lệ nhất định các chất cảm ứng,
đó có thể là các phospholipid đặc biệt hoặc các polime có khả năng bị phân giải cau
trúc về mặt vật lý hoặc hóa học khi nhận được tín hiệu kích thích tại mô đích Tác nhân gây kích thích có thể là thuộc tính đặc trưng tại mô bị bệnh như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường mô bệnh (tác nhân nội -
internal trigger) hoặc có thê là do tác động từ bên ngoài như siêu âm và năng lượng
điện từ trường, nhiệt độ, (tác nhân ngoại - external trigger) [4], [ 10], [ 13], [23], [
25], [ 30], [ 36], [ 37], [ 38]
Trang 22vụ khác nhau cùng lúc khi liposome đi chuyến trong hệ tuần hoàn Khi đó ta sẽ có các liposome thông minh đa chức năng [36]
1.2.2 Các phương pháp bào chế liposome
Liposome được chế tạo theo nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp hydrat hóa film lipid (phương pháp Bangham), phương pháp loại chất điện hoạt, phương pháp pha loãng alcol, phương pháp bốc hơi pha đảo, phương pháp nhũ hóa, phương pháp đông khô, phương pháp sử dụng hệ thống kênh vi lỏng [45], [29] Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào:
v Thuộc tính hóa lý của được chất và của hợp chất dùng chế tạo
liposome
Đặc tính của môi trường phân tán liposome
Nong độ tác dụng của dược chất và độc tính tiềm tàng của nó
Các kỹ thuật bổ trợ trong quá trình phân phối liposome vào cơ thể
SN
NOUN
Sự phù hợp của kích thước, mức độ đa phân tán và thời gian tổn tai của liposome với vị trí sử dụng hay với mô bệnh
v Độ lặp lại giữa các lô trong sản xuất và khả năng sản xuât của quy mô lớn các liposome có độ an toàn và hiệu quả cao [33]
Tất cả các phương pháp bào chế liposome trên thường tạo ra hỗn hợp các loại liposome khác nhau với các kích thước khác nhau (trừ phương pháp sử dụng hệ thống kênh vi lỏng) Do đó liposome sau khi tạo ra thường được giảm kích thước và đồng nhất kích thước bằng các phương pháp thích hợp Có 4 biện pháp thường sử
dụng để đạt được mục đích này: Siêu âm, nén qua màng, đồng nhất hóa ở áp suất
cao, đông chảy nhiều lần Thường có sự kết hợp các phương pháp làm đồng nhất và
làm giảm kích thước tiểu phân để đạt được hiệu quả mong muốn [45] 1.2.3 Dua thuéc vao liposome
Dược chất có thể đưa vào trong liposome theo cơ chế thụ động hoặc chủ động
Theo cơ chế thụ động: Dược chất được đưa vào liposome trong quá trình bảo
chế liposome Theo đó, dược chất thân nước sẽ thêm vào pha nước, dược chất thân
Trang 23dầu sẽ thêm vào pha dung môi hữu cơ, sau đó sẽ tiến hành bào chế liposome bằng các phương pháp thích hợp Đưa được chất theo cơ chế thụ động có nhược điểm là hiệu suất gắn được chất thấp, dược chất có thể bị tách khỏi liposome trong quá trình làm giảm kích thước và làm đồng nhất kích thước Theo Xiaoming Xu [46], nếu
dược chất được chứa trong khoang nước, hiệu suất liposome hóa có thể dự đốn được bằng cơng thức: V: EE% = 7 100% _ XC4/3)nG; — d)3.(c V.Ng)/Zi40 [rˆ + ứ; — đ)?].P;/a).P;) 7 V 100%
Trong đó: EE%: hiệu suất liposome hóa; V„„: thể tích môi trường trong liposome; V: thể tích mơi trường tồn phần liposome; r„ bán kính liposome; d: độ dày màng lipid kép; P; xác xuất phân bố kích thước liposome; a: diện tích trung bình màng
lipid; c: nông độ mol lipid
Theo cơ chế chủ động: sẽ có 3 bước chính theo thứ tự sau: * Bào chế liposome bằng các phương pháp thích hợp
v Làm giảm kích thước liposome đến kích thước yêu cầu và đồng
nhất hóa về kích thước
* Đưa được chất vào liposome
Dược chất được đưa vào liposome theo cơ chế chủ động bằng cách tạo ra chênh lệch năng lượng hai bên màng liposome, sự chênh lệch này sẽ tạo động lực
để kéo được chất từ môi trường bên ngoài vào liposome Cách đơn giản nhất dé tạo
chênh lệch năng lượng là tạo ra chênh lệch nồng độ vật chất hai bên màng liposome Hiện nay hay sử dụng chênh lệch amomi, chênh lệch ion hay chênh lệch pH để tạo động lực đưa dược chất vào liposome Một số được chất đã được đưa vào liposome
với hiệu suất cao bang phương pháp này nhu: doxorubicin, mitoxantron,
cIprofloxacIn, vincristin, và các vinca alkaloid [15] Co chế đưa dược chất sẽ được
nêu chi tiệt đôi với liposome doxorubicin ở mục 1.3
Trang 24Bảng 1.3: Ưu nhược điểm của các phương pháp tỉnh chế liposome
Kỹ thuật Ưu điểm Nhược điểm
; Hiéu suat cao (>99%) ,
Tham tich | Don gian Ton thoi gian Dé thu héi mau
Ly tâm Dễ thao tác Hiệu suất thấp
Ly tâm kết | Hiệu suất cao (>90%)
hợp siêu lọc Tiết kiệm thời gian Hiệu suất cao (>99%) Dễ thu hồi mẫu
Hiệu suất cao (90-99,99%)
Tiết kiệm thời gian
Khó thu hồi mẫu
Lọc tiếp tuyến Cân tối ưu được tỉ lệ lọc
Mẫu bị pha loãng nên cần phải chỉnh ham lượng lại
bang loc tiép tuyên Sac ky loc gel
Liposome sau khi bao chế luôn chứa cả được chất tự do và được chất liposome hóa Trong một số trường hợp, được chất tự do có thể gây ra các vấn đề về ôn định
của chế phẩm hoặc được chất tự do có thể giảm hiệu quả điều trị, khi đó cần thiết phải tinh chế để loại bỏ dược chất tự do Có 5 kỹ thuật có thể sử đụng cho mục đích
nay 14 tham tich (dialysis), ly tâm, ly tâm kết hợp siêu loc (ultra-centrifugation), lọc tham tich ( diafiltration) hay loc tiép tuyén (tangential flow filtration / cross flow filtration), sắc ký lọc gel Ưu nhược điểm của mỗi phương pháp tinh chế được trình bay trong bang 1.3 [45]
1.2.4 Danh gia liposome tao ra
Bang 1.4 liệt kê các tiêu chí đánh giá và phương pháp đánh giá chất lượng của liposome [6], [ 34] Ngoài các chỉ tiêu được đưa ra ở bảng 1.4, liposome vẫn phải đáp ứng các chỉ tiêu chất lượng khác tùy thuộc vào việc liposome được sử đụng cho dạng bào chế nào Ví dụ, với thuốc tiêm liposome thì ngoài phải đáp ứng các chỉ tiêu nêu ở bảng 1.4 thì còn phải đáp ứng thêm các chỉ tiêu về an toàn sinh học như độ vô khuân, nội độc tô vị khuân
Trang 25Bang 1.4: Cac tiéu chi danh gia liposome Tiêu chí đánh giá Phương pháp đánh giá hoặc thiết bị đánh giá Hàm lượng phospholipid HPLC Thành phần lipid TLC, HPLC Hàm lượng cholesterol HPLC tán bọc Hàm lượng dược chất Phương — lượng phù pH Máy đo pH
Độ thâm thấu Máy đo độ thâm thấu
Dung môi tồn dư
Hình dạng và cấu trúc bề mặt Chụp TEM, SEM
Kích thước và phân bố kích thước DLS; chụp TEM, SEM
Điện tích bề mặt Phương pháp điện di Chỉ tiêu Thế Zeta Phương pháp điện di vậtlý | Số lớp lipid Pˆ`NMR Khá năng giải phóng được chất Sử dụng tế bào khuếch tán hoặc phương pháp thâm tích Khả năng gắn được chất Thâm tích; ly tâm; sắc ký lọc gel 1.3 Liposome doxorubicin
Liposome doxorubicin 1a ché pham liposome đầu tiên được nghiên cứu thành
céng va da xuất hiện các chế phẩm thương mại trên thị trường với các đặc tính
mong muốn như hiệu suất gắn thuốc cao, khả năng tuần hoàn lâu trong cơ thể Đây cũng là mô hình liposome đầu tiên ứng dụng thành công phương pháp tạo chênh
lệch vật chất 2 bên màng (chênh lệch amomi) để tạo động lực đưa dược chất vào trong khoang nước của liposome với hiệu suất rất cao (90-99%) [15] Kỹ thuật chế
Trang 26tạo ra liposome quy ước và đưa doxorubicin vào liposome hiện nay đã là những vân đê khoa học rât cơ bản trên thê giới, cho nên hâu hệt các nghiên cứu hiện nay khi
nghiên cứu cải thiện và phát hiện thêm các đặc tính mới của liposome đêu lựa chọn
doxorubicin làm mô hình đê nghiên cứu
Liposome doxorubicin thường được bào chế qua các bước sau: chế tạo liposome bằng phương pháp hydrat hóa film lipid, sau đó giảm kích thước liposome bằng phương pháp nén hỗn dịch liposome qua màng polycarbonat 100 nm Cuối cùng là đưa DOX vào trong liposome bằng một trong các phương pháp đưới đây
[15]:
Tạo chênh lêch ion H+ trực tiếp:
e - Môi trường bên trong liposome có pH 3 - 4 trong khi mơi trường bên ngồi có pH từ 7 - 7,5 Khi hòa tan DOX vào hỗn dịch liposome, sẽ xuất hiện
can bang giữa dạng ion hóa (DOXNH;”) và dạng không ion hóa (DOXNH;)
của DOX, dạng DOXNH; thấm được qua màng lipid nên sẽ đi vào liposome, khi vào bên trong liposome nó sẽ kết hợp với HỶ và tạo ra dạng ion hóa không thể khuếch tán ngược ra ngoài liposome được Trong khi đó, ở bên ngoài liposome, theo nguyên lý chuyên dịch cân bằng, để bù đắp lại lượng DOXNH; bị mất do vao trong liposome thi DOXNH;* lai tiép tục bị phân ly ra DOXNH;
mới để thiết lập lại cân bằng DOXNH; mới lại tiếp tục đi vào liposome Quá
trình này sẽ tiếp tục cho đến khi đạt được cân bằng pH ở hai bên màng
liposome
e Môi trường bên trong liposome thường dùng: 300mM citrat pH 3,5 - 4, 300 mM MnSO, pH 3,5 - 4 [15], [ 30], [ 32]
e Mơi trường bên ngồi thường dùng: 10 -20 mM HEPES pH 7 - 8
e Động lực của quá trình vận chuyển là chênh lệch nồng độ H” hai bên
màng liposome Theo các nghiên cứu, sự chênh lệch pH phải ít nhất là 3 đơn vi
Tạo chênh lệch pH gián tiếp qua chênh lệch NHÀ:
Trang 27e Liposome có mơi trường ngồi là dung dịch đệm pH 7,5 ( Ví dụ đệm HEPES), môi trường bên trong là 300 mM amoni sulfat Hệ liposome ban đầu có các cân bằng: Ở bên trong liposome, NHZ điện ly ra NH; và H”, NHạ có khả năng thấm tốt qua màng lipid kép nên sẽ khuếch tán ra bên ngoài liposome do chênh lệch nồng độ amoniac hai bên màng Ở ngoài màng lại có cân bằng: NH; kết hợp voi H* tao ra NH? Khi phéi hop liposome với DOX, dạng khéng ion héa sé khuéch tan vao trong liposome va két hgp voi H* tao ra dang ion héa, dang nay khong tham ra ngoai duge ma con két hop voi ion S027 va
bị kết tủa lai trong liposome Do bi két tủa lại nên chênh lệch nồng độ DOX 2
bên màng lại được tạo ra, kết quả là cứ mỗi phân tử NH; đi ra ngoài sẽ tạo động lực cho 1 phân tử DOX đi vào trong tế bào Quá trình cứ tiếp tục cho đến khi tất cả các quá trình đạt tới trạng thái cân bằng
Môi trường trong Ïiposom Mơi trường ngồi liposom pH<5 pH 7,4 (NH,.),SO, ` 2NH, Ce: 2NH, + 2H* => 2NH, + SO, 2DOX-NH.' + 2CI v | wwe + |
\ (ĐOX-NH,),S0,®“—— 2DOX-NH, “— 2DOX-NH, +2H
Ket tia lại
Hình 1.5: Phương pháp đưa DOX vào liposome bằng chênh lệch amoni Tạo chênh lệch ion H gián tiếp qua tạo chênh lệch ion:
e Phương pháp này sử dụng ionophore là một protein được tổng hợp từ vi
sinh vật, có vai trò vận chuyển ion qua màng sinh học
e Liposome có môi trường bên trong màng là dung dịch 1on kim loại hóa trị I hoặc II (MgSO¿, MnSO,); trên màng liposome có gan ionophore phi hợp với ion kim loại được dùng; môi trường bên ngồi khơng có các ion kim loại trên và có chứa các chất tạo phức với ion trong màng (Ví dụ EDTA)
lonophore (ví dụ A23187) vận chuyển ion Mg”* ra ngoai mang theo chénh
Trang 28lệch nồng độ, tại đây Mg?” bị giữ lại do tạo phức với EDTA Để đảm bảo cân
bằng điện tích hai bên màng, hai ion H” được vận chuyên vào trong màng qua
1onophore làm cho môi trường trong màng được acid hóa, tạo chênh lệch pH
qua màng Sau khi tạo được chênh lệch pH hai bên màng thì tiến hành phối
hợp DOX vào hỗn dịch, khi đó DOX sẽ khuếch tán qua màng để đảm bảo cân
bằng pH hai bên màng theo cơ chế như đã mô tả trên ie Mẹ?” Q (7423187 | J EDTA q DH =>-D+ + A B Hinh 1.6: Cac phuong phap DOX qua mang liposome: Bang chénh léch ion(A) va chénh léch pH (B)
Để tăng hiệu suất liposome hóa, cần phải tăng tỉ lệ dạng DOXNH; ở bên ngoài liposome và phải giảm khả năng phân ly của DOXNH¿” ở trong liposome tránh hiện
tượng khuếch tán ngược trở lại Muốn tăng tỉ lệ dạng DOXNH;,, môi trường bên
ngoài cần có pH > 7 nhưng không nên quá kiềm vì DOX không bền ở môi trường pH cao (tốt nhất pH < 8); ngồi ra, mơi trường bên ngồi liposome khơng nên có
mặt các chất có khả năng kết tủa hoặc tạo phức khó điện ly với dạng DOXNH;” làm
giảm quá trình điện ly cia DOXNH;* Để ngăn hiện tượng khuếch tán ngược
DOXNH; ở bên trong liposome ra bên ngồi, mơi trường bên trong nên có mặt các ion chất có khả năng kết tủa hoặc tạo phức khó điện ly với dạng DOXNH;* để khóa
được chất lại đồng thời tạo ra chênh lệch DOXNH; 2 bên màng tạo động lực cho quá trình khuếch tán DOXNH; từ ngoài vào trong
Vì vậy, thường môi trường bên trong liposome hay chứa các amon đa hóa trị như SO£~, citrat, phosphat, Mơi trường bên ngồi phải không được chứa các ion
Trang 29này Do quá trình bào chế liposome, thường các ion này luôn có mặt với lượng lớn ở bên ngoài liposome nên trước khi tiến hành liposome hóa DOX, thường phải có quá trình loại bỏ các ion trên
Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin trên thế giới hiện nay:
Amey Bandekar và cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế và so sánh tác dụng
chống ung thư của liposome giải phóng thuốc trong tế bào (liposome nhạy cảm pH) với liposome giải phóng thuốc qua khe tế bào (liposome tuần hoàn đài - PEG liposome) và của liposome hướng đích với liposome không hướng đích trên khối u dưới da chuột (được tạo ra bằng cách cấy tế bào ung thư vú BT474) Liposome
nhạy cảm pH có cấu tạo lớp vỏ gồm DSPA, 21PC, CHL (tỉ lệ mol 6,8:2,3:0,9),
ngoài ra còn phối hợp thêm 13% mol DSPE-PEG để kéo đài thời gian tuần hoàn Liposome tuần hoàn đài sử dụng DSPC và CHL (tỉ lệ mol 7:3) làm thành phần chính tạo lên vỏ liposome và phối hợp thêm 4,9% mol DSPE-PEG Liposome được
bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film lipid, sau đó làm giảm kích thước bằng
cách nén qua mang polycarbonat 100 nm ở 80°C DOX được liposome hóa bằng phương pháp chênh lệch amoni Liposome doxorubicin được gắn kháng thé HER2/neu bằng cách ủ hỗn hợp liposome và kháng thể theo tỉ lệ 1:30 trong 30 ph Các liposome tạo ra có mật độ kháng thể từ 25 - 30 kháng thể/liposome, hiệu suất liposome hóa của liposome nhạy cảm pH và liposome tuần hoàn dài tương ứng là
29,41 + 1,15% và 40,34 + 1,46% Sự có mặt kháng thể trên bề mặt không ảnh
hưởng đến kích thước và hiệu suất gắn DOX của liposome Kết quả đánh giá khả năng ức chế sự phát triển khối u cho thấy liposome có gắn HER2/neu có khả năng
làm giảm thể tích khối u (liposome nhạy cảm pH gắn HER2/neu giảm 35%,
liposome tuần hoàn lâu gắn HER2/neu giảm 19% thể tích khối u) trong khi liposome không gắn HER2/neu có khả năng kìm hãm sự phát triển của khối u Sự tăng thể tích khối u của nhóm điều trị bằng liposome nhạy cảm pH, liposome tuần hoàn lâu và nhóm chứng lần lượt là 41%, 34% và 100% [5]
Trang 30Lisa M Kaminskas và cộng sự (2012) đã nghiên cứu so sánh dược động học, hoạt tính chống ung thư và độc tính của Caelyx (liposome doxorubicin PEG hóa) — L-DOX so véi dung dich doxorubicin - DOX va dendrime doxorubicin duge PEG hóa — D-DOX trén chudt duc 5 - 6 tudn tudi (dugc tigm 6x10° tế bao ung thư biểu mô Walker và để phát triển cho đến khi tạo được khối u kích thước 1 cmỶ ) Về
dược động học, sau khi tiêm DOX, nồng độ doxorubicin trong huyết tương giảm mạnh và ở đưới giới hạn định lượng đưới sau I h chimg td doxorubicin phan bé nhanh và rộng vào các mô (Clr = 760 + 163 mL/h) Trong khi đó D-DOX va L- DOX cho thấy nồng độ doxorubicin toàn phần trong huyết tương giảm rất chậm và hệ số thanh thái thấp hơn khoảng 1000 lần so với tiêm DOX Mức doxorubicin tự do ở 2 chế phẩm nano trên cũng rất thấp chứng tỏ trong vòng tuần hoàn, doxorubicin vẫn được gắn vào trong hệ nano Tuy nhiên kết quả đánh giá khả năng
làm giảm khối u lại không khác nhau giữa cá 3 chế phẩm, cả 3 chế phẩm đều làm
giảm 68-78% kích thước của khối u [20]
Antonella Accardo và cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dung cua liposome doxorubicin quy ước (DSPC-DOX) voi liposome doxorubicin gắn nhóm peptid có đặc tính hướng đích tới các thụ thể Bombesin tại các tế bảo ung thu (DSPC-MonY-BN-DOX) Liposome được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đáo với lớp màng lipid gồm DSPC hoặc DSPC và MonY-BN (tông hợp từ chuỗi acid amin 7 - 14 của peptid Bobesin) (tỷ lệ mol 1:0,03) Làm giảm kích thước liposome bằng cách nén qua màng polycarbonat 100 nm Kết quả thu được các liposome có kích thước 145 — 165 nm và chỉ số đa phân tán < 0,20; DOX được đưa vào liposome bằng cách tạo chênh lệch pH (bên trong liposome là đệm citrat pH4) hoặc chênh lệch amoni Trước khi phối hợp DOX thì sử đụng kĩ thuật siêu ly tâm dé thay mơi trường bên ngồi liposome bằng đệm HEPES pH 7,4 Hiệu suất gắn doxorubicin với phương pháp tạo chênh lệch pH là 95,0 + 2,7% cao hơn phương
pháp chênh lệch amomi sulfat (58,0 + 1,9%) Kích thước của liposorme sau khi gắn
DOX và trước khi gắn DOX không bị thay đổi nhiều Kết quả đánh giá hoạt tính
chống ung thư trên dòng tế bào PC-3 xenograft cấy trên chuột cho thấy DSPC-
Trang 31Mor.Y-BN-DOX ức chế hơn 60% sự phát triển của tế bào so với DSPC-DOX chỉ ức
chế được 30% sự phát triển của tế bào ung thư [3]
Kim Jong-Oh và cộng sự (2009) đã bào chế và đánh giá dạng bào chế
liposome doxorubicin trong thành phần có chứa các polyme mang điện tích (polyamon) như polyethylen oxid -b- polymethacrilic acid (PEO-b-PMA) mang
điện tích Tính chất ion của tiêu phân cho phép đạt được nồng độ doxorubicin bên
trong tiểu phân khá cao (50%) Các tiểu phân chứa các polyme mang điện chứa doxorubicin này biểu thị tính chất giải phóng thuốc nhạy cảm với pH: sự nhận proton của các các phân tử mang điện ở môi trường acid dẫn đến tăng giải phóng doxorubicin Đặc biệt, bằng cách thay đổi các thành phần của các phân tử mang điện sẽ làm thay đổi hiệu quả chứa thuốc và đặc tính giải phóng thuốc Do đó, nhóm nghiên cứu tin rằng các phân tử mang điện polyme với hạt nhân polyanion có nhiều triển vọng là các chất mang siêu phân tử cho phép kiểm soát sự phân bố sinh học và
dược động học của thuốc để cải thiện kết quả trị liệu [21]
Evjen Tove J và cộng sự (2010) đã nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin bằng phương pháp cất quay có sử dụng một số biện pháp kỹ thuật cải tiến Các tá được lipid st dung 1a distearoyl phosphatidylethanolamin (DSPE), distearoyl phosphatidylcholin (DSPC), cholesterol (CHL) Các lipid được hòa tan trong hỗn hợp dung môi cloroform : methanol tỷ lệ 9 : 1 ở 60°C, đem cất quay 6 h được film lipid Hydrat hóa film lipid bang dung dich ammoni sulphat trong 2 h H6n dich thu được đem lọc ép nhiều lần qua màng polycarbonat với kích thước lỗ giảm dan (800
nm, 400 nm, 200 nm, 100 nm, 80 nm) Thém dung dich doxorubcin hydroclorid
được pha trong đung dịch ammoni sulphat, khuấy, ủ Sử dụng sóng siêu âm với tấn số thích hợp trong 6 phút Kết quá thu được liposome có kích thước tiểu phân
khoảng 84 + 1 nm [13]
Wafa T Al-Jamal và cộng sự (2012) nghiên cứu được động học và phân bố
của doxorubicin trên chuột C57BLó6 (được gây u hắc tố (melanoma) bằng tế bào B16F10) khi điều trị bằng 3 loại liposome doxorubicin: liposome nhạy cám nhiệt độ
thấp - LTSL (DPPC:MSPC:DSPE-PEG›soo = 86:10:4), liposome nhạy cảm nhiệt độ
Trang 32cao - TISL (DPPC:HSPC:CHL:DSPE-PEG›goo = 50:25:15:3) và liposome quy ước
- NTSL (HSPC:CHL:DSPE-PEG999 = 70:50:3) Liposome dugc bào chế bằng
phương pháp hydrat hóa film lipid, giảm kích thước bằng cách nén qua màng polycarbonat 800, 200, 100, 80nm và sử dụng phương pháp chênh lệch amoni gắn
DOX vào liposome (môi trường trong liposome là 240 mM amoni sulfat, môi
trường ngoài là đệm 20 mM HEPES pH 7,4) Cả 3 loại liposome bào chế ra có kích
thước từ 90 - 120 nm, PDI đưới 0,1, bề mặt tích điện âm (-9 + -15 mV) và hiệu suất
liposome hóa trên 90% Đánh giá giải phóng In vỉ/ro trong môi trường chứa 50%
huyết tương chuột CD-1 cho thấy, ở 37°C, LTSL giải phóng 30% DOX trong 30 ph
và giải phóng 100% DOX sau 2 h; TISL giải phóng 103% DOX sau 30 ph và giải
phóng 60% DOX sau 24 h; NTSL không giải phóng DOX ở 37°C O 42°C, LTSL
giải phóng 100% DOX sau 1 ph, TTSL giải phóng 70% DOX ở 5 ph đầu và 100% DOX sau 15 ph, NTSL không giải phóng thuốc sau 24 h Sử dụng phương pháp đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ ”H-CHE ( H-cholesteryl hexa decyl ethe) và '“C- DOX (C- doxorubicin) để đánh giá phân bố của các liposome cho thấy LTSL ổn định trong gan hơn so với NTSL và TTSL nhưng lại dễ bị bắt bởi lách hơn Tác động nhiệt lên lên mô ung thư của chuột không làm thay đổi đặc điểm tuần hoàn và khá năng phân bố thuốc tại mô bình thường của các liposome nhưng lại rất nhanh ảnh hưởng đến mô ung thư Cụ thể là khi gây nhiệt tại mô ung thư, nồng độ DOX
tại mô ung thư trong 1 h đầu đã tăng từ 1,5 - 3 lần so với bình thường [4]
Benjakul Ruthairat và cộng sự (2011) đã nghiên cứu bào chế liposome doxorubicin bằng phương pháp đông khô dưới áp suất thấp ở nhiệt độ thường Các tác giả đã sử dụng các tá dược chất mang trơ dễ bay hơi là clorobutanol hemihydrat (CBN) Các tá dược lipid là phosphatidylcholin, cholesterol Các tá được đường tạo khung là mamnitol và sucrose Các tá dược lipid được hòa tan trong dung môi tert- butanol, các đường mammtol, sucrose hòa tan trong pha nước Doxorubicin hydroclorid được hòa tan trong pha nước Phối hợp các dung dịch, thêm tá được đễ
bay hơi là CBN Đem đông khô ở nhiệt độ phòng (25 - 30°C) dưới áp suất thấp (1,5
Trang 33- 2,0 mBar) trong 8h thu được bột đông khô Khi hydrat hóa lại bột đông khô thu
được liposome có kích thước khoảng 400 — 1000 mm [7]
Đào Thanh Tùng (2011) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá các đặc tính của liposome doxorubicin Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm SPC và cholesterol, dược chất được đưa vào liposome bằng hai phương pháp thụ động và chủ động chênh lệch pH qua màng, sau đó sử dụng siêu âm để làm giảm kích thước Kết quả đã khảo sát được công thức tỷ
lệ mol lipid SPC : CHL (7 : 3), tỷ lệ mol dược chất : lipid (5 : 1) và xây đựng quy
trình bào chế liposome doxorubicin với kích thước < 300 nm, hiệu suất liposome hóa > 80%, hàm lượng được chất trong hệ phân tán liposome ~ 1 mg/ml [2] 1.4 Sơ lược về mô hình đánh giá tác dụng chống ung thư
1.4.1 Các dòng tế bào
- Ủng thư tuyến thugng than (adrenocortical) : NCIh295 [16] - Ung thu phổi: Lewis lung carcinoma, Colo-699-N, H460 [8], [ 31]
- _ Ung thư buồng trứng: Ovacar-3 [31]
- Unguyên bào thần kinh: GI-LELN, Kelly [L7], [ 31]
- Ung thu vi: BT474, BT483, SKBR3, NCI/ADR-RES, 4T1, MCF-7, MCF-7- ADR [5], [ 8], [ 12], [ 17], [ 22]
- - Ung thư ruột gia: C-26, HCT-116 [8], [ 12]
- Ung thư vòm họng có vảy nhỏ: SAS [8]
- Ung thu té bao gan: Mahlavu, W256, QGY [19]
- Ung thu tuyén tuy: Panc-1, MIA, Paca-2, DSL6A [40], [8]
- Ung thu tuyén tién liét: PC-3, PU145 [3], [8], [ 12], [17]
- Ung thu hac t6 (melanoma): B16F10 [4]
1.4.2 Động vật thực nghiệm
Dong vat thi nghiém ding dé danh gid tac dung cua liposome doxorubicin rat da dạng Chủ yếu trén cdc ching chudt nhu: C57BL6 ,BALB/c, C3H/HeJ, NCR
homozygous nude, Swiss, Fischer 344, SCID nude, NMRI, C57BL6, Sprague—
Dawley, BDF-1, SLC Wistar/ST [3], [ 4], [ 8], [ 10], [ 11], [ 16], [32], [19]
Trang 34Các chuột có thê bị cắt bỏ tuyến ức, dẫn đến giảm số lượng tế bào miễn dịch
Iympho T, làm giảm khả năng đào thải khối u và các mảnh ghép [16], [ 20] 1.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng
Trước hết, chọn dòng tế bảo và động vật thực nghiệm Động vật thực nghiệm là chuột thường chọn những con từ 6 - 8 tuần tuổi, nặng từ 20 — 26 g với chuột nhất
và 250 — 300 g với chuột cống Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường, nhiệt
độ, thời gian thích hợp Sau đó đem cây truyền vào cơ thể động vật thực nghiệm VỊ
trí cấy tế bào rất khác nhau tùy vào loại tế bào ung thư: hông bên phải và hông bên
trái, lưng, màng bụng, phổi, gan bàn chân, đưới da vùng cổ, dưới da đùi, thùy trái
gan Sự cấy truyền u vào cơ thê chuột nhất có thể tiến hành bằng cách ghép khối u,
có thể tiêm hỗn dịch của tế bào u của các loại u khác nhau từ cơ thể chuột đã mang
u sẵn Các khối u rắn (solid tumor) có thể được cấy truyền theo đường đưới da hoặc
tiêm vào bắp, cơ của động vật Các khối u báng (ascites tumors) có thể được tiêm vào 6 bụng Số lượng tế bào đem cay khoang 10°— 10’ /động vật
Sau đó chuột được chia thành các nhóm để tiến hành điều trị bằng các công
thức khác nhau Liều doxorubicin tiêm vào chuột rất khác nhau tùy vào từng thí
nghiém: 1,5 mg/kg [5], 2 mg/kg [12], [ 20], 5 mg/kg [32],8 mg/kg [8], 10 mg/kg [3],
[ 16], [ 17], 15 mg/kg [26] Thời điểm bắt đầu tiến hành rất khác nhau tùy theo từng
thí nghiệm Có thể điều trị ngay sau khi cấy truyền tế bào thành công, cũng có thê để khối u phát triển một cách chắc chắn Thường để các tế bào phát triển từ 1 — 2
tuần, cũng có khi tới 4 tuần hoặc đến khi thể tích u đạt đến một mức nào đó (khoảng
100 — 400 mm’)
1.4.4 Các chỉ tiêu đánh giá hiệu quả điều trị khối u
Thể tích khối u: Có nhiều công thức tính khác nhau tùy theo từng nghiên cứu:
V=a.b.c.0,5
a,b,c la chiêu dài, chiếu rộng và chiếu cao khối u [4]
V=a.bˆ 0,5 hoặc V=a.b.—
a và b là chiều dài và chiễu rộng khối w [8], [ 11], [ 12]
Trang 35V = 4/3 nab?
a và b là đường kinh lớn nhất và đường kính nhỏ nhất của khốiu [5]
Tï lệ ức chế khối u - ITG ( Inhibition of Tumor Growth):
mG = “—™ 100 W,
W., W, : Khoi luong trung binh khối u nhóm chưng và nhóm điêu trị [19] Ngoài ra còn có thể đánh giá thêm thời gian sống sót của chuột, sự thay đôi khối lượng cơ thể chuột, sự thay đổi về đặc điểm được động học của thuốc
Trang 36CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Liposome doxorubicin
- Thuéc tiém liposome doxorubicin
2.2 Nguyén vat liéu
Bảng 2.1]: Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu A oan A Ấ Tiêu Tên nguyên liệu Nguon goc 2 chuan Doxorubicin hydroclorid My USP , LGC Standards - Doxorubicin hydroclorid chuan EurPh Đức Cholesterol Trung quốc TKHH ; ; Avanti polar Phosphatidyl cholin dau nanh TCCS lipids-My
Cloroform Trung Quốc TCCS
Acid citric Trung Quéc TKHH
Natri hydroxyd Merck- Đức TKHH
Natri clorid Viét nam DDVN
Kali dihydrophosphat Trung Quéc TKHH
Dinatri hydrophosphat Trung Quốc TKHH
Acid phosphoric Merck- Duc TKHH
Nước cất pha tiêm Việt nam DĐVN
Trang 37Dùng cho Methanol Merck- Đức HPLC Dùng cho Acetonitril Merck- Đức HPLC Natri lauryl sulfat Trung Quốc BP
- = Chuột nhất trắng đồng Swiss, BAL C57/6, giống đực, khỏe mạnh, đủ tiêu
chuẩn thí nghiệm, trọng lượng trung bình 20,0 + 1,0 g do Viện vệ sinh dịch tế Trung ương cung cấp Chuột được nuôi bằng thức ăn tổng hợp, uống nước sạch,
tự đo (ad libitum), nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm được lý chuyên dụng
- Dong té bao ung thu Sarcoma TG180, đo phòng thí nghiệm thực nghiệm
trên chuột bạch của Bộ môn mô phôi — tế bào, khoa Sinh học, đại học Khoa học
tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội cung cấp
- - Thuốc đối chiếu: Hỗn dịch tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml Lipo-DOX của hãng TTYBiopharm, Đài Loan ( EE >90%, KTTB: 60-120nm Số lô: SVN 1122; hạn dùng: 28-07-2013) Dung dịch tiêm doxorubicin 2 mg/ml “Ebewe” cua
nhà sản xuất Ebewe, Áo (Số lô: 12154206; hạn đùng: 01 - 2013)
2.3 Phương tiện nghiên cứu
- _ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 1200 infinity của hãng Agilent - May ly tém lanh Universal 320R
- Máy đo kích thước tiéu phan va do thé zeta ZETASIZER ZS90
- _ Thiết bị siêu âm cầm tay Labsonic
- _ Bể siêu âm Wiseclean WUC
- Máy cất quay ROTAVAPOR R-210 của BUCHI
- Túi thâm tích Spectrumlab/Por 4,MWCO: 12-14 kD (Spectrum Labs- Mỹ) - - Thiết bị loc tiép tuyén MicroKros® Filter Modules, mang polysulfone, kich
thước lỗ lọc 10 kD; 50 kD, điện tích lọc 20 cm’; 28 cm? (Spectrum Labs- M¥)
Trang 38- - Máy đông khô Triad của hãng Labconco
- _ Máy đo thể tích khối u Plethysmometer-7 140 của UGO BASIL (aly)
2.4 Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Phương pháp bào ché liposome doxorubicin
Dựa theo các kết quả của các nghiên cứu về liposome DOX đã đạt được [2], liposome doxorubicin được bào chế qua các giai đoạn sau:
2.4.1.1 Chế tạo liposome chưa mang dược chất
Tao lop film lipid: hoa tan soy phosphatidyl cholin, cholesterol trong cloroform rồi bốc hơi hết dung môi trên thiết bị cất quay với các thông số: tốc độ
quay 50 vòng/phút, nhiệt độ 40°C Thời gian bốc hơi dung môi là 12 h
Hydrat hóa: hòa tan acid citric trong nước, điều chỉnh pH bằng dung dich NaOH 2M tới pH4, lọc qua màng lọc 0,2 um Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/ph và
tăng nhiệt độ lên 50°C, mở van của thiết bị cất quay để hút hết dung dịch đệm citrat vào Sau 2 h hydrat hóa sẽ thu được hỗn dịch liposome có màu trắng, đục
2.4.1.2 Làm giám kích thước tiêu phân
Cho vào lọ thủy tính hỗn dịch liposome ở trên, nhúng đầu siêu âm của thiết bị Labsonic ngập 1/3 hỗn dịch, siêu âm với các thông số: tần số 30 kHz, biên độ
100% Làm mát bằng nước lạnh để đảm báo nhiệt độ siêu âm không vượt quá 60°C
Sau khi siêu âm, lọc hỗn dịch qua màng 0,45 um rồi 0,2 uum để loại các tiểu phân to
2.4.1.3 Tiến hành đổi hệ đệm
Sử dụng 2 phương pháp đôi hệ đệm là thâm tích và lọc tiếp tuyến
Phương pháp thẩm tích: Hỗn địch liposome được cho vào trong màng thâm tích và được đặt trong bình chứa đệm Hepes pH 7,4 (tỷ lệ thể tích hệ phân tán liposome: đệm Hepes là 1:100) Bình chứa được để ở 2-8°C trong 24 giờ và được thay đệm Hepes tại các thời điểm 0 giờ, 5 giờ và 19 giờ Đệm citrat sẽ khuếch tán ra bên ngồi mơi trường đồng thời HEPES sẽ từ mơi trường ngồi túi đi vào trong cho tới khi đạt cân bằng nồng độ các chất tan giữa hai bên màng Kết quả là sau khi
Trang 39thâm tích, sẽ thu được hỗn địch liposome có môi trường bên trong là đệm citrat pH
4, mơi trường bên ngồi là đệm HEPES pH 7,4 (hinh 2.1)
Túi thầm tích
— Liposom
Ban dau ; Sau khi tham tich xong
@ HEPES © Citrat
Hình 2.1: Mô hình thí nghiệm đổi đệm bằng phương pháp thẩm tích Phương pháp lọc tiếp tuyến: Hệ thống lọc tiếp tuyến có thê thao tác băng tay
(hình 2.3) hoặc được thao tác tự động nhờ bơm nhu động (hình 2.4) Liposom cat pr Et: rome Hh ` g6tn8 s6 ng nu ban n0bnnsa ược pha -: hồn, :
ttn oa OO Là KP „ a ©, gS: : Hon dich liposome
Se :O:.€ @° l ° trong dung dịch đệm as Oo’ : đệm Hepes pH 7.4 ni _ of rm ng i ota Thang lọc Dung dịch đệm citrat pH 4 @ HEPES @ Citrat
Hình 2.2: Cơ chế đổi đệm bằng lọc tiếp tuyển
Với thao tác bằng tay: đệm Hepes pH 7,4 được bơm đồng thể tích với hệ phân
tán liposome trong đệm citrat pH 4 qua màng lọc của lọc tiếp tuyến, tại đây
liposome được giữ lại, phần dung dịch đệm bị loại ra ngoài Bơm tới khi hệ phân tán trở về thể tích ban đầu sẽ loại được một phần đệm citrat Lặp đi lặp lại quy trình
cho tới khi hệ phân tán có pH 7,2-7,4
Trang 40địch lọc Liposom | jin” 1y San pham Hepes
Hình 2.3: Mô hình lọc tiếp tuyên thao tác băng tay
Với thao tác tự động: bơm tuần hoàn hỗn dịch liposome qua cột lọc, nước sẽ
kéo các chất tan thấm qua màng lọc theo chiều vuông góc so với dòng chảy,
liposome không đi qua màng được sẽ liên tục được chạy qua cột Do nước bị loại
bớt nên sẽ làm giảm áp suất trong bình chứa nên sẽ tạo lực hút đệm HEPES sang để
bù vào lượng nước bị loại mất Kết qua là cứ bao nhiêu mÌ dung dịch cũ bị loại qua
màng lọc thì sẽ được bù vào bằng bấy nhiêu dung dịch đệm HEPES Theo hướng
dẫn của nhà sản xuất thì với thể tích đung dịch đổi gấp 8 14n thé tich liposome thi sẽ
loại được hoàn toàn môi trường cũ Khi pH dịch lọc đạt 7,4 thì ngừng bổ sung đệm
HEPES nhưng vẫn chạy bơm đến khi thể tích hỗn dịch liposome trong bình chứa
mẫu bằng 70% so với ban đầu thì ngừng hút liposome và tiếp tục bơm hút dung
dịch đệm HEPES qua cột để thu hồi các liposome còn bám ở màng lọc về Khi thể
tích bình chứa mẫu đạt được thể tích ban đầu thì đừng bơm để kết thúc
Bom ne @ iets @ cre O Lpowme — 3) var
Hình 2.4: Sơ đô hệ thong loc tiếp tuyến tự động