Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm liposom doxorubin và đánh giá tác dụng trên khối u động vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUY N V N NGHI N C U BÀO CHẾ THU C TI LIPOSOME DOXORUBICIN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TR N H I U ĐỘNG V T U N V N THẠC S DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUY N V N NGHI N C U BÀO CHẾ THU C TI LIPOSOME DOXORUBICIN VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG TR N H I U ĐỘNG V T U N V N THẠC S DƯỢC HỌC HUY N NGH NH : M NG NGH PH M O H S : 60 73 01 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS Phạm Thị ThS.NCS HÀ NỘI 2012 inh Huệ hánh Thị Nhi LờI CảM ƠN Tụi xin gi li cm n trõn trọng tới: PGS TS Phạm Thị Minh Huệ Cô giúp tơi có định hướng ban đầu đắn trình thực đề tài, nhờ tơi hồn thành mục tiêu đề tài đề Trong trình tiến hành đề tài, cô thường xuyên quan tâm đưa góp ý quan trọng để đề tài hoàn thiện Xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Vũ Mạnh Hùng-Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y ThS Khánh Thị Nhi tận tình giúp đỡ, bảo tiến hành đề tài đặc biệt đánh giá tác dụng thuốc động vật Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Bào chế- Đại học Dược Hà Nội, Bộ mơn Dược lý – Học viện Qn y, Phòng hiển vi điện tử - Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương tạo điều kiện giúp đỡ thời gian nghiên cứu thực nghiệm Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bè bạn động viên, giúp đỡ tơi hồn thành tốt đề tài DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ 21PC 1,2-Diheneicosanoyl-sn -Glycero-3-Phosphocholin CHL Cholesterol ĐVN ược điển Việt Nam DLS Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động DOX Doxorubicin DSPC 1,2-Distearoyl- sn -Glycero-3-Phosphocholin DSPE Distearoyl phosphatidyl ethanolamin DSPE- 1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phospho ethanolamin-N- PEG {Methoxy (Polyethylene glycol)} EE Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa 10 EPR Enhanced Permeability and Retention effect - Hiệu ứng tăng tính thấm khả lưu giữ 11 EurP European Pharmacopoeia ( ược điển hâu Âu) 12 GUV Giant Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp khổng lồ 13 HEPES N-2- hydroxy ethyl piperazin-N‟-2-ethan sulfonic acid 14 HPLC High Performance Liquid cao) hromatography (Sắc ký lỏng hiệu 15 ITG Inhibition Tumor Growth - hỉ số ức chế phát triển khối u 16 KTTB Kích thước trung bình 17 LTSL Low Temperature Sensitive Liposome – Liposome nhạy cảm nhiệt độ thấp 18 LUV Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn 19 MLVs Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp 20 MUV Medium Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp trung bình 21 MVVs Multi Vesicular Vesicle – Liposome đa lớp 22 MWCO Molecular Weight Cut Off - Giới hạn khối lượng phân tử 23 NTSL Non Temperature Sensitive Liposome – Liposome không nhạy cảm nhiệt độ Oligo Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp 24 OLVs 25 PB KTTP Phân bố kích thước tiểu phân 26 PDI Polydispersity Index – hỉ số đa phân tán 27 PEG Polyethylen glycol 25 PS Polysulfone 26 RES Reticuloendothelia System - Hệ lưới nội mô 27 SPC Soy phosphatidyl cholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành 28 SUV Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ 29 TCCS Tiêu chuẩn sở 30 TKHH Tinh khiết hóa học 31 TTSL Traditional Temperature Sensitive Liposome – Liposome nhạy cảm nhiệt độ cao 32 USP United State Pharmacopoeia ( ược điển Mỹ) ỤC ỤC DANH ỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH ỤC BẢNG 10 DANH ỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 11 ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯ NG TỔNG QUAN .2 1.1 Doxorubicin .2 1.2 Đại cương liposome 1.2.1 Khái niệm phân loại 1.2.2 Các phương pháp bào chế liposome 10 1.2.3 Đưa thuốc vào liposome 10 1.2.4 Đánh giá liposome tạo 12 1.3 Liposome doxorubicin 13 1.4 Sơ lược mơ hình đánh giá tác dụng chống ung thư 21 1.4.1 Các dòng tế bào 21 1.4.2 Động vật thực nghiệm 21 1.4.3 Phương pháp đánh giá tác dụng 22 1.4.4 Các tiêu đánh giá hiệu điều trị khối u 22 CHƯ NG Đ I TƯỢNG VÀ PHƯ NG PHÁP NGHI N C U 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Nguyên vật liệu 24 2.3 Phương tiện nghiên cứu 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 26 2.4.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 26 2.4.2 Phương pháp đánh giá liposome tạo 29 2.4.3 Phương pháp đánh giá chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin 32 2.4.4 Phương pháp đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome doxorubicin chuột thực nghiệm 32 2.5 Phương pháp l số liệu 34 2.6 Điều kiện thí nghiệm 34 CHƯ NG ẾT QUẢ THỰC NGHIỆ 35 3.1 ết ây dựng đường chuẩn DOX 35 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng thơng số kĩ thuật q trình bào chế đến đặc tính liposome orubicin 36 3.2.1 Quá trình chế tạo liposome chưa mang dược chất 36 3.2.2 Quá trình làm giảm đồng kích thước liposome 36 3.2.3 Q trình đưa doxorubicin vào liposome 40 3.3 Bào chế thuốc tiêm liposome orubicin 46 3.3.1 Lựa chọn quy trình bào chế 46 3.3.2 Đề xuất tiêu chuẩn thuốc tiêm liposome doxorubicin 52 3.3.3 Sơ đánh giá độ ổn định thuốc tiêm liposome doxorubicin 53 3.4 Sơ đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome orubicin khối u chuột thực nghiệm 55 3.4.1 Đánh giá tác dụng hỗn dịch liposome doxorubicin thời gian sống trung bình chuột nhắt mang khối u da 55 3.4.2 Đánh giá tác dụng hỗn dịch liposome doxorubicin tỷ lệ sống sót chuột nhắt mang khối u da 56 3.4.3 Đánh giá tác dụng hỗn dịch liposome doxorubicin khối lượng khối u da chuột sau 30 ngày 57 3.4.4 Đánh giá tác dụng hỗn dịch liposome doxorubicin thể tích khối u da chuột sau 30 ngày 58 3.4.5 Đánh giá tác dụng hỗn dịch liposome doxorubicin khối lượng khối u chuột sau 30 ngày 59 3.4.6 Đánh giá tác dụng hỗn dịch liposome doxorubicin thể tích khối u sau 30 ngày 60 CHƯ NG BÀN U N 62 4.1 Về quy trình bào chế thuốc tiêm liposome orubicin mg/ml 62 4.2 Về đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome khối u chuột 70 ẾT U N VÀ ĐỀ XUẤT 73 DANH ỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chế phẩm doxorubicin thị trường……………………… Bảng 1.2 Phân loại liposome theo kích thước cấu trúc…………………… Bảng 1.3 Ưu nhược điểm phương pháp tinh chế liposome………… 12 Bảng 1.4 Các tiêu chí đánh giá liposome………………………………………… 13 Bảng 2.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu……………………………… 24 Bảng 3.1 Diện tích pic doxorubicin nồng độ khác nhau………… 35 Bảng 3.2 Phân bố kích thước hệ liposome điều kiện siêu âm khác 37 Bảng 3.3 Phân bố kích thước hệ liposome siêu âm thể tích nhỏ (10 ml)… 38 Bảng 3.4 Nồng độ DOX lại theo thời gian 41 Bảng 3.5 Ảnh hưởng phương pháp đổi đệm đến hiệu suất liposome hóa 43 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ ủ DOX đến hiệu suất liposome hóa 45 Bảng 3.7 So sánh khác mẫu liposome M7 M8 47 Bảng 3.8 Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin mg/ml bào chế mẻ khác nhau…………………………………………………………….… 52 Bảng 3.9 Tiêu chuẩn sở đề xuất thuốc tiêm liposome doxorubicin…… 53 Bảng 3.10 Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin mẻ thời gian bảo quản…………………………………………………………… 54 Bảng 3.11 Thời gian sống trung bình chuột mang u da sau 30 ngày …… 55 Bảng 3.12 Tỷ lệ chuột mang u da sống sót sau 30 ngày ……… ………… 56 Bảng 3.13 Khối lượng khối u da chuột sau 30 ngày……… ………… 57 Bảng 3.14 Thể tích khối u da chuột sau 30 ngày……… ……………… 58 Bảng 3.15 Khối lượng khối u trung bình chuột sau 30 ngày …………… 59 Bảng 3.16 Thể tích khối u chuột sau 30 ngày……………………………… 60 Phụ lục Đồ thị phân bố kích thước liposome siêu âm thiết bị Wiseclean Phụ lục Đồ thị phân bố kích thước liposome siêu âm thiết bị Labsonic với thể tích siêu âm 10ml Phụ lục Đồ thị phân bố kích thước liposome siêu âm thiết bị Labsonic với thể tích siêu âm 10ml sau gắn doxorubicin Phụ lục Phân bố kích thước tiểu phân chế phẩm Lipo-DOX Phụ lục 6: Sắc ký đồ doxorubicin chuẩn 100µg/ml Phụ lục 7: Sắc ký đồ định lượng doxorubicin toàn phần liposome doxorubicin Phụ lục 8: Tiêu chuẩn sở thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml Phụ lục 9: Phiếu kiểm nghiệm thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml ... trị ung thư Đề tài Nghiên c u bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin đánh giá tác dụng khối u động vật tiến hành để phát triển dạng thuốc tiêm liposome doxorubicin sở kết nghiên c u bào chế liposome... liposome thu Đề tài thực với mục ti u: Bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml quy mơ phòng thí nghiệm đưa ti u chuẩn thuốc tiêm liposome doxorubicin Sơ đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome... trình bào chế thuốc tiêm liposome orubicin mg/ml 62 4.2 Về đánh giá tác dụng thuốc tiêm liposome khối u chuột 70 ẾT U N VÀ ĐỀ XUẤT 73 DANH ỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chế phẩm doxorubicin