Triển khai mô hình gây giảm tiểu cầu bằng hóa chất độc tế bào trên chuột cống trắng và áp dụng đánh giá tác dụng của cao toàn phần lá đu đủ (carica papaya l )

s TẾ BỘ Y TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ CHI TRIỂN KHAI MƠ HÌNH GÂY GIẢM TIỂU CẦU BẰNG HÓA CHẤT ĐỘC TẾ BÀO TRÊN CHUỘT CỐNG TRẮNG VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO TỒN PHẦN LÁ ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA L.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ CHI MÃ SINH VIÊN: 1301037 TRIỂN KHAI MƠ HÌNH GÂY GIẢM TIỂU CẦU BẰNG HÓA CHẤT ĐỘC TẾ BÀO TRÊN CHUỘT CỐNG TRẮNG VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO TỒN PHẦN LÁ ĐU ĐỦ (CARICA PAPAYA L.) KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Thùy Dương ThS Phạm Đức Vịnh Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2018 LỜI CẢM ƠN Bằng tất chân thành lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thùy Dương, ThS Phạm Đức Vịnh DS Nguyễn Tùng Sơn người thầy tận tụy, hết lòng quan tâm, hướng dẫn giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ DS Đinh Thị Kiều Giang anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực trực tiếp tham gia giúp đỡ em thời gian nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo mơn, phòng ban khác Trường đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho em thời gian học tập nghiên cứu Trong trình thực đề tài, em nhận giúp đỡ, ý kiến đóng góp từ thầy anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực Em xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Em xin cảm ơn anh chị, bạn bè nghiên cứu khoa học Bộ môn Dược lực đồng hành, hỗ trợ, động viên em suốt trình thực đề tài Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân bạn bè ln bên cạnh, ủng hộ, chia sẻ khó khăn động viên em thực khóa luận Hà Nội, tháng năm 2018 Sinh viên Đinh Thị Chi MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giảm tiểu cầu 1.2 Các mô hình gây giảm tiểu cầu động vật thí nghiệm 1.3 Đu đủ 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .21 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu .21 2.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.4 Phương pháp xử lý số liệu .28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ .29 3.1 Kết triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA chuột cống trắng 29 3.2 Kết triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu busulfan chuột cống trắng 34 3.3 Kết đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu cao đu đủ mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA 39 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 44 4.1 Về kết triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA chuột cống trắng 44 4.2 Về kết triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu busulfan chuột cống trắng 46 4.3 Về tác dụng chống giảm tiểu cầu cao đu đủ .48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .51 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2C9.G2 Kháng thể không liên hợp liên hợp với isothiocynate chống lại GPIIIa (The unconjugated or fluorescein isothiocynate (FITC)conjugated antibody against GPIIIa) ADP Adenosine triphosphat ALT Alanin transaminase AST Aspart transaminase CPA Cyclophosphamid DIC Hội chứng đông máu nội mạch rải rác HIT Giảm tiểu cầu heparin HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao IC50 Nồng độ ức chế 50% IL Interleukin ITP Xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (immune thrombocytopenia) IVIg Globulin miễn dịch đường tĩnh tĩnh mạch (intravenous immunoglobulin) EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid MWReg30 The monoclonal antibody specific for glycoprotein (GP)IIb PBS Muối đệm phosphat (phosphate-buffered saline) PDI Protein disulfid isomerase PF4 Yếu tố tiểu cầu RAMPS Huyết thỏ kháng tiểu cầu chuột (Rabbit anti-mouse platelet serum) TLC Sắc ký lớp mỏng TNF Yếu tố hoại tử khối u (tumor necrosis factor) TPO Thrombopoietin TTP Ban xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Đánh giá bệnh nhân giảm tiểu cầu [35] Hình 2.1 Quy trình chiết xuất cao đu đủ 21 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 23 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA 25 Hình 2.4 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu busulfan 26 Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu cao đu đủ mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA 27 Hình 3.1 Ảnh hưởng CPA với mức liều khác đến tỷ lệ chuột chết 29 Hình 3.2 Ảnh hưởng CPA với mức liều khác đến mức độ tăng khối lượng chuột theo thời gian .30 Hình 3.3 Ảnh hưởng CPA với mức liều khác đến số lượng tiểu cầu thời điểm khác 31 Hình 3.4 Ảnh hưởng CPA với mức liều khác đến số lượng bạch cầu thời điểm khác 32 Hình 3.5 Ảnh hưởng CPA với mức liều khác đến số lượng hồng cầu thời điểm khác 33 Hình 3.6 Ảnh hưởng CPA với mức liều khác đến thể tích trung bình tiểu cầu thời điểm khác 34 Hình 3.7 Ảnh hưởng chế độ liều busulfan đến tỷ lệ chuột chết tích lũy theo thời gian 35 Hình 3.8 Ảnh hưởng chế độ liều busulfan đến mức độ tăng khối lượng chuột theo thời gian 36 Hình 3.9 Ảnh hưởng chế độ liều busulfan đến số lượng tiểu cầu .37 Hình 3.10 Ảnh hưởng chế độ liều busulfan đến số lượng bạch cầu 38 Hình 3.11 Ảnh hưởng chế độ liều busulfan đến số lượng hồng cầu 39 Hình 3.12 Ảnh hưởng cao đu đủ đến số lượng tiểu cầu 40 Hình 3.13 Ảnh hưởng cao đu đủ đến số lượng bạch cầu 41 Hình 3.14 Ảnh hưởng cao đu đủ đến số lượng hồng cầu 42 Hình 3.15 Ảnh hưởng cao đu đủ đến thời gian đông máu thời gian chảy máu chuột 43 ĐẶT VẤN ĐỀ Giảm tiểu cầu rối loạn thường gặp, đặc trưng số lượng tiểu cầu giảm ngưỡng 150 000 tế bào/mm3 máu Rối loạn tiên phát (xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch) thứ phát nguyên nhân khác (như nhiễm virus, sử dụng hóa trị liệu, mang thai, …) với mức độ thay đổi từ nhẹ, không triệu chứng đến xuất huyết đe dọa tính mạng [35], [54] Trong khoảng thời gian dài, điều trị giảm tiểu cầu chủ yếu dựa việc loại bỏ nguyên nhân gây bệnh điều trị hỗ trợ thông qua truyền máu truyền tiểu cầu có định Gần đây, đời phát triển thuốc kích thích tiểu cầu hệ thứ hai mở hướng điều trị đầy hứa hẹn bệnh nhân mắc chứng giảm tiểu cầu nghiêm trọng xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch kháng trị thiếu máu bất sản [45] Tuy nhiên, khả tiếp cận phần lớn bệnh nhân với thuốc hạn chế giá thành thuốc cao Do đó, việc nghiên cứu thuốc điều trị giảm tiểu cầu nhằm bổ sung thay cho thuốc kích thích tiểu cầu có hướng tiếp cận tiềm có ý nghĩa thực tiễn lớn Dựa kinh nghiệm dân gian điều trị rối loạn liên quan đến giảm tiểu cầu, số nhà khoa học giới tiến hành nghiên cứu tác dụng kích thích sản sinh tiểu cầu số thuốc có nguồn gốc dược liệu thu kết khả quan với nhiều dược liệu khác đu đủ (Carica papaya), xuyên tâm liên (Andrographis Paniculata), ổi (Psidium guajava) [23], [60], [68] Trong đó, đu đủ đối tượng quan tâm nhiều tác dụng tăng sinh tiểu cầu ghi nhận quán loạt nghiên cứu in-vitro, in-vivo số thử nghiệm lâm sàng Ấn Độ [17], [23], [27], [68] Đáng ý, đu đủ loài thực vật phổ biến Việt Nam, chưa có nghiên cứu thực đánh giá chuyên biệt tác dụng kích thích tạo tiểu cầu dược liệu thu hái nước Để bước đầu đánh giá tác dụng tăng sinh tiểu cầu đu đủ đối tượng nghiên cứu tiềm khác, trước hết cần phải xây dựng mơ hình thực nghiệm có tính khả thi, tin cậy mơ chế sinh bệnh học giảm tiểu cầu người Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn mơ hình gây giảm tiểu cầu hóa trị liệu mơ hình có quy trình đơn giản, dễ thực sử dụng thành công để đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu thuốc có CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Về kết triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA chuột cống trắng Kết từ nghiên cứu trước cho thấy độc tính mức độ gây giảm tiểu cầu CPA phụ thuộc vào liều Trong nghiên cứu triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu chuột cống trắng CPA tiêm da ngày liên tiếp với mức liều 25, 50, 100 150 mg/kg cân nặng, mức liều CPA gây giảm tiểu cầu, nhiên, 100 % động vật thí nghiệm chết sử dụng mức liều 100 150 mg/kg với mức liều 50 25 mg/kg, không ghi nhận tượng tử vong động vật thí nghiệm đến thời điểm kết thúc nghiên cứu [37] Tương tự, số nghiên cứu đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu thuốc sử dụng CPA với mức liều 25 mg/kg để gây giảm tiểu cầu chuột cống với độc tính tối thiểu khơng gây chết động vật thí nghiệm [23], [60] Trái lại, số tác giả sử dụng mức liều cao CPA, bao gồm 50 mg/kg 100 mg/kg, để gây trạng thái giảm tiểu cầu rõ rệt không ghi nhận tượng chuột chết [17], [49] Trong phần lớn nghiên cứu đây, số lượng tiểu cầu thường giảm từ ngày thứ – sau tiêm liều CPA trạng thái giảm tiểu cầu trì khoảng 1-2 tuần sau Do có khác biệt đáng kể kết công bố liên quan đến chế độ liều CPA, tiến hành thăm dò đáp ứng giảm tiểu cầu gây CPA với mức liều khác nhau, bao gồm 12,5 mg/kg, 25 mg/kg, 50 mg/kg 100 mg/kg, tiêm da ngày liên tiếp, nhằm lựa chọn mức liều phù hợp để áp dụng đánh giá tác dụng thuốc Kết cho thấy mức liều CPA nói gây giảm tiểu cầu rõ rệt vào ngày thứ với tỷ lệ giảm có xu hướng phụ thuộc vào liều Số lượng tiểu cầu giảm 90% dùng CPA với liều 50 100 mg/kg, khoảng 86% với liều 25 mg/kg khoảng gần 50% với mức liều 12,5 mg/kg Tuy nhiên, bên cạnh tác dụng làm giảm số lượng tiểu cầu, CPA thể độc tính đáng kể sử dụng mức liều cao (50 100 mg/kg) Trái lại, CPA dường không ảnh hưởng đáng kể đến thể trạng chuột mức liều 12,5 25 mg/kg CPA hóa trị liệu gây ức chế tủy xương không chọn lọc, song song với việc làm giảm tiểu cầu, sử dụng CPA dẫn đến giảm đáng kể tế bào máu khác bao gồm 44 hồng cầu bạch cầu Đặc biệt, số lượng bạch cầu giảm mạnh xuất sớm, từ thời điểm lấy máu ngày thứ 4, số lượng bạch cầu lô CPA 50 100 mg/kg giảm 90 % so với lô chứng Số lượng bạch cầu giảm nghiêm trọng làm tăng nguy chuột bị chết q trình thí nghiệm Vì vậy, để giảm thiểu nguy động vật tử vong nhiễm trùng liên quan đến giảm bạch cầu, nghiên cứu sử dụng trấu qua chiếu xạ, kết hợp thay trấu vệ sinh lồng thường xuyên ethanol 90%, dùng nước đun sôi để nguội cho động vật uống Ngoài ra, phải lấy máu lặp lại nhiều lần suốt nghiên cứu, để giảm ảnh hưởng đến động vật thí nghiệm, chúng tơi áp dụng quy trình lấy máu với mức độ xâm lấn tối thiểu Trong đó, máu lấy cách luồn kim vào tĩnh mạch đuôi đưa trực tiếp vào xy lanh, thay lựa chọn kỹ thuật lấy máu chảy từ vết thương khởi động q trình đơng máu theo đường ngoại sinh, làm thay đổi số lượng tiểu cầu Kỹ thuật lấy máu cách luồn kim vào tĩnh mạch hạn chế q trình đơng máu, đảm bảo lấy lượng máu ít, đủ cho xét nghiệm dễ cầm máu cho động vật đặc biệt ngày tiểu cầu giảm thấp Đồng thời, lấy lượng máu nhỏ (200 µL) đủ cho xét nghiệm, không sử dụng ống chống đơng có sẵn thị trường Nghiên cứu sử dụng bột EDTA dạng muối dễ tan nước, với khối lượng xác định, EDTA dạng bột khô không làm thay đổi thể tích dẫn đến máu bị pha lỗng, nhiên dạng bột khó chống đơng Để khắc phục nhược điểm này, sau bơm máu vào ống chống đơng, phải lắc ống 10 giây nhằm trộn chất chống đông Một điểm khác biệt nghiên cứu với kết công bố trước thời gian trì mức tiểu cầu nghiên cứu ngắn đáng kể Cụ thể, nghiên cứu này, tiểu cầu phát giảm ngày thứ nghiên cứu, sau phục hồi nhanh giá trị tương đương với lô chứng Trong phần lớn nghiên cứu khác ghi nhận trạng thái giảm tiểu cầu sau ngày thứ 11 [17], [23], [60] Điều khác biệt mức độ nhạy cảm chủng chuột khác với tác dụng ức chế tủy xương CPA tốc độ thải trừ thuốc khỏi thể Khả phục hồi nhanh số lượng tiểu cầu máu giải thích thơng qua chế feedback sau: CPA ức chế tủy xương dẫn đến giảm sản sinh tiểu cầu giảm số lượng tiểu cầu ngoại vi, thể tăng trình tổng hợp thrombopoietin, lên tới 20 lần; tác dụng ức chế CPA 45 giảm, nồng độ cao thrombopoietin máu kích thích mạnh tủy xương, dẫn đến tăng nhanh số lượng tiểu cầu [40], [64] Từ kết khảo sát ảnh hưởng CPA với mức liều khác đến thay đổi số lượng tiểu cầu theo thời gian, lựa chọn mức liều 25 mg/kg CPA cho thử nghiệm Việc lựa chọn dựa thực tế số lượng tiểu cầu người động vật thường có dao động lớn cá thể biểu bệnh học liên quan đến giảm tiểu cầu thường xuất tiểu cầu giảm đến mức độ định (ví dụ, số lượng tiểu cầu bình thường người khoảng 150ì103 - 450ì103/àl, nhiờn, cỏc triu chng ca gim tiểu cầu xuất bệnh nhân cú s lng tiu cu trờn 50 ì103/àl) Mc liu tương đồng với nhiều nghiên cứu trước sử dụng mơ hình gây giảm tiểu cầu để đánh giá tác dụng thuốc kích thích tiểu cầu, số lượng tiểu cầu bệnh lý thường trì khoảng 10 – 20% trị số bình thường Ngồi ra, kết triển khai mơ hình gợi ý thời điểm thích hợp để đánh giá mức độ giảm tiểu cầu gây CPA ngày thứ sau tiêm CPA Tùy theo chế tác dụng dược động học thuốc cần lựa chọn thời điểm đưa thuốc phù hợp Số lượng tiểu cầu đạt đỉnh sau sử dụng số thuốc kích thích tiểu cầu hệ eltrombopag romiplostim 12-16 ngày [45] Như vậy, thời gian thể tác dụng thuốc với chế kích tích tạo tiểu cầu thường dài, đó, để áp dụng mơ hình nghiên cứu đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu thuốc thử cần đưa thuốc trước gây giảm tiểu cầu CPA 4.2 Về kết triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu busulfan chuột cống trắng CPA hóa trị liệu sử dụng phổ biến để gây giảm tiểu cầu động vật thí nghiệm Tuy nhiên kết triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA cho thấy CPA gây giảm tiểu cầu rõ rệt thời gian trì giảm tiểu cầu chuột cống trắng nghiên cứu tương đối ngắn xác định thời điểm tiểu cầu giảm thấp rõ rệt so với nhóm chứng Điều gây khó khăn cho việc lựa chọn thời điểm đánh giá tác dụng thuốc Khác với CPA, busulfan hóa trị liệu gây ức chế tủy xương kéo dài, khả gây giảm tiểu cầu dự đốn kéo dài so với CPA [3] Vì vậy, chúng tơi tiếp tục triển 46 khai mơ hình gây giảm tiểu cầu busulfan để đánh giá mức độ thời gian gây giảm tiểu cầu động vật thí nghiệm Trong phần lớn nghiên cứu trước đây, busulfan sử dụng với chế độ liều: tiêm da busulfan liều mg/kg vào ngày 1, 5, 10, 15 tiêm màng bụng busulfan liều 10 mg/kg vào ngày 0, Kết thu từ nghiên cứu tương đồng, chế độ liều gây giảm tiểu cầu rõ rệt không gây chết động vật thí nghiệm [57], [63], [68] Do đó, nghiên cứu triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu busulfan, tiến hành khảo sát song song chế độ liều bao gồm liều 20 mg/kg chia làm lần (tiêm màng bụng ngày 0, 3) 20 mg/kg chia làm lần (tiêm da ngày 0, 5, 10, 15) Với chế độ liều 20 mg/kg chia làm lần, số lượng tiểu cầu bắt đầu giảm sâu (85%) thời điểm lấy máu ngày thứ 11, trì mức giảm tiểu cầu nghiêm trọng đến ngày 14 Kết tương đồng với nghiên cứu trước [63] Tuy nhiên, điểm khác biệt quan trọng động vật nghiên cứu bắt đầu chết từ ngày 16 tỷ lệ chết lên đến 80% kết thúc nghiên cứu Sự khác biệt điều kiện chăm sóc động vật thí nghiệm Thực tế, số nghiên cứu trước đây, sau tiêm busufan, chuột chăm sóc đặc biệt ni tủ hood Ngồi ra, mức độ nhạy cảm chủng động vật khác với độc tính hóa trị liệu Do vậy, hướng tới nghiên cứu mơ hình gây giảm tiểu cầu mức liều thấp busulfan mà độc tính q mức với động vật thí nghiệm gây giảm tiểu cầu rõ rệt, kéo dài Với chế độ liều 20 mg/kg chia làm lần tiêm vào ngày 0, 5, 10, 15, số lượng tiểu cầu giảm rõ rệt vào ngày 20 không ghi nhận chuột chết toàn nghiên cứu Tuy nhiên, tỷ lệ giảm tiểu cầu 60% so với lô chứng, mức độ giảm tiểu cầu không sâu nghiên cứu Zunjar V cộng (gần 90%) [68] Mặt khác, lấy máu làm xét nghiệm thời điểm sau tiêm busulfan (ngày thứ 20), không xác định thời điểm tiểu cầu giảm thấp hồi phục số lượng tiểu cầu Trong nghiên cứu tiếp theo, xác định thêm số thời điểm lấy máu để theo dõi diễn biến giảm tiểu cầu động vật thí nghiệm với chế độ liều 47 4.3 Về tác dụng chống giảm tiểu cầu cao đu đủ Chúng triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu thực nghiệm CPA busulfan Cả mơ hình CPA (tiêm da 25 mg/kg) busulfan (5 mg/kg lặp lại lần vào ngày 0, 5, 10, 15) có khả gây giảm tiểu cầu rõ rệt không ảnh hưởng đến thể trạng động vật thí nghiệm Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA để đánh giá tác dụng kích thích tạo tiểu cầu cao tồn phần đu đủ Trong số nghiên cứu công bố, dịch chiết đu đủ sử dụng đường uống với mức liều 400 800 mg/kg/ngày [17], [23] Tuy nhiên, nghiên cứu không đề cập rõ quy trình chiết đu đủ Ngồi ra, đu đủ thu hái Việt Nam sử dụng nghiên cứu đu đủ sử dụng nghiên cứu có khác hàm lượng alkaloid số thành phần có tác dụng kích thích tăng tiểu cầu đu đủ Do đó, chúng tơi lựa chọn mức liều cao toàn phần đu đủ 800 1600 mg/kg/ngày để đánh giá tác dụng kích thích tăng tiểu cầu đu đủ mơ hình chuột gây giảm tiểu cầu CPA Kết nghiên cứu chúng tơi cho thấy cao tồn phần đu đủ liều 1600 mg/kg có tác dụng kích thích tăng số lượng tiểu cầu, nhiên mức liều 800 mg/kg chưa thấy có tác dụng Với số nghiên cứu biết sử dụng dịch chiết đu đủ mức liều 400 800 mg/kg thể tác dụng kích thích tăng số lượng tiểu cầu mơ hình chuột gây giảm tiểu cầu [23], [49] Trên dòng tế bào máu khác, cao đu đủ khơng thấy có tác dụng kích thích tăng số lượng hồng cầu bạch cầu Trong số nghiên cứu khác ghi nhận đu đủ có hiệu làm tăng số lượng bạch cầu hồng cầu [25], [28] Liều 1600 mg/kg cao toàn phần đu đủ liều bắt đầu có tác dụng kích thích tiểu cầu nên tác dụng tương đối chọn lọc số lượng tiểu cầu Từ nghiên cứu triển khai mơ hình xác định thời điểm số lượng tiểu cầu giảm thấp nhất, đợt đánh giá tác dụng cao toàn phần đu đủ, bên cạnh số lượng tế bào máu, tiến hành đánh giá tác dụng đu đủ thời gian đông máu chảy máu Trên thời gian chảy máu, không ghi nhận khác biệt đáng kể chuột điều trị cao tồn phần đu đủ lơ chứng bệnh Tuy nhiên, nhận thấy thời gian chảy máu mơ hình CPA khơng có mối tương quan 48 với số lượng tiểu cầu thời gian chảy máu lô chứng bệnh bị rút ngắn số lượng tiểu cầu lô giảm mạnh so với lô chứng Điều thời gian chảy máu thông số không đặc hiệu Thông số không phản ánh số lượng tiểu cầu mà chức tiểu cầu, độ bền thành mạch, yếu tố đơng máu huyết động Trong CPA hóa chất gây độc tế bào không chọn lọc, tác động đến nhiều quan gan, thận, …và gây ảnh hưởng gián tiếp đến thời gian chảy máu Mặc dù thời gian đông máu thông số đặc hiệu để đánh giá số lượng chức tiểu cầu, nhiên kết từ nghiên cứu trước cho thấy sử dụng CPA làm kéo dài đáng kể thời gian đông máu điều có mối tương quan với tác dụng gây giảm số lượng tiểu cầu [49] Cả mức liều cao đu đủ 800 1600 mg/kg nghiên cứu chúng tơi có tác dụng làm giảm rõ rệt thời gian đông máu so với lô chứng bệnh Một hạn chế nghiên cứu chúng tơi khơng tìm tác nhân thích hợp làm thuốc đối chứng cho mơ hình Hầu hết nghiên cứu đánh giá tác dụng tăng tiểu cầu đu đủ không sử dụng chứng dương [23], [49] Có nghiên cứu sử dụng chứng dương hydrocortison, nhiên nhận thấy corticoid chủ yếu sử dụng điều trị giảm tiểu cầu chế miễn dịch [17] Trong CPA gây giảm tiểu cầu ức chế tủy xương số tác giả cho đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu kích thích tạo tiểu cầu ngăn chặn phá hủy tiểu cầu Do vậy, nghiên cứu này, tiến hành khảo sát ảnh hưởng chế độ liều thiết lập mà không sử dụng thuốc đối chứng Như vậy, cao tồn phần đu đủ liều 1600 mg/kg có tác dụng chống giảm tiểu cầu rút ngắn thời gian đơng máu mơ hình chuột gây giảm tiểu cầu CPA Lá đu đủ chứa nhiều thành phần hóa học saponin, tanin, glycosid tim alkaloid Các alkaloid diện bao gồm carpain, pseudocarpain dehydrocarpain I II Những thành phần tác động lên tủy xương, ngăn chặn phá hủy tăng cường khả sản xuất tiểu cầu Hơn nữa, ngăn chặn phá hủy tiểu cầu máu làm tăng tuổi thọ tiểu cầu máu ngoại vi [17], [23], [49] Năm 2016, Zunjar V cộng đánh giá khả chống giảm tiểu cầu carpain phân đoạn chiết alkaloid từ đu đủ mơ hình động vật gây giảm tiểu cầu busulfan Phân đoạn chiết alkaloid thô chứa carpain, pseudocarpain-I, 49 pseudocarpain-II cholin cho thấy có hiệu việc trì số lượng tiểu cầu phần chiết nước khơng thấy có tác dụng Nhằm xác định thành phần có hoạt tính nhóm alkaloid, phân đoạn tiếp tục chiết ether dầu mỏ ethyl acetat, đồng thời phân lập carpain từ alkaloid đu đủ đánh giá hoạt tính Kết cho thấy, carpain, phân đoạn ether dầu mỏ ethyl acetat có khả chống giảm tiểu cầu mạnh Nghiên cứu cho thấy có tương quan hàm lượng carpain phân đoạn chiết đu đủ với hoạt tính chống giảm tiểu cầu [68] Như vậy, nghiên cứu định hướng cho việc xác định thành phần có hoạt tính đu đủ thu hái Việt Nam, nên xác định chế tác dụng để ứng dụng điều trị số bệnh khác Tóm lại, có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu đu đủ, nghiên cứu chứng minh đủ đủ thu hái Việt Nam có tác dụng kích thích tăng số lượng tiểu cầu Với nguồn dược liệu phong phú, nghiên cứu mở hướng tiếp cận đầy tiềm điều trị bệnh có liên quan đến giảm số lượng tiểu cầu Việt Nam như: sốt xuất huyết, xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch, … 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu chuột cống trắng tiêm da CPA ngày liên tiếp với mức liều 12,5 25 mg/kg tiêm da busulfan với tổng liều 20 mg/kg chia làm lần vào ngày 0, 5, 10 15 - Trên mơ hình gây giảm tiểu cầu CPA, số lượng tiểu cầu giảm rõ rệt vào ngày thứ với tỷ lệ giảm mức liều 12,5 25 mg/kg CPA tương ứng 47% 86% so với lô chứng, đồng thời không quan sát thấy thay đổi đáng kể thể trạng động vật thí nghiệm CPA mức liều cao (50 100 mg/kg) không lựa chọn tỷ lệ gây tử vong cao (50% 100%) - Trên mô hình gây giảm tiểu cầu busulfan với tổng liều 20 mg/kg tiêm da vào ngày 0, 5, 10, 15, số lượng tiểu cầu giảm đáng kể vào ngày thứ 20, mức độ giảm 60% so với lô chứng, đồng thời không ghi nhận bất thường thể trạng động vật thí nghiệm Ngồi ra, tiêm màng bụng busulfan vào ngày 0, với liều 10 mg/kg gây giảm tiểu cầu rõ rệt kéo dài nhiên tỷ lệ động vật chết lên đến 80% Đã đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu cao tồn phần đu đủ mơ hình động vật gây giảm tiểu cầu CPA liều 25 mg/kg Trên mơ hình này, cao tồn phần đu đủ với mức liều 1600 mg/kg đường uống thể tác dụng làm tăng chọn lọc số lượng tiểu cầu rút ngắn thời gian đông máu động vật thí nghiệm vào ngày thứ nghiên cứu Tuy nhiên, tác dụng chưa thể rõ rệt mức liều thấp (800 mg/kg) KIẾN NGHỊ Hồn thiện mơ hình gây giảm tiểu cầu busulfan chuột cống trắng Xác định thành phần có hoạt tính nghiên cứu chế làm tăng tiểu cầu đu đủ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Đỗ Huy Bích , Đặng Quang Chung (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, tr 824-827 Nguyễn Tấn Bỉnh, Phạm Qúy Trọng cộng (2015), Bài giảng huyết học lâm sàng, Nhà xuất Y học, tr 173-181 Bộ Y tế (2015), Dược thư Quốc gia Việt Nam Bộ Y tế (2015), Hướng dẫn chẩn đoán điều trị số bệnh lý huyết học, Nhà xuất Y học, tr 134-139 Bộ Y tế (2011), "Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị sốt xuất huyết dengue" Hồ Thị Hà (2014), Nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất chiết tách từ đu đủ (Carica papaya Linn), Luận án tiến sĩ công nghệ sinh học Trần Thanh Hà, Trịnh Thị Điệp (2012), "Hai cycloartane triterpen lần phân lập từ đu đủ (Carica papaya L.)", Tạp chí hóa học, 50(4A), tr 166-169 Joseph B Martin, Stephen L Hauser, et al (2005), Các nguyên lý y học nội khoa Harrison, Nhà xuất Y học, tr 633-641 Nguyễn Quốc Khang, Hà Thị Thanh Bình (1999), "Góp phần nghiên cứu số hoạt tính sinh học flavonoid đu đủ (Carica papaya L.)", Tạp chí dược học số 4, 6, tr 15-17 10 Phạm Kim Mãn, Nguyễn Minh Khai cộng (2001), "Nghiên cứu thuốc PANACRIN ức chế u dùng điều trị ung thư", Tạp chí dược liệu, (2, 3), tr 58-62 11 Hà Thị Bích Ngọc, Trần Thị Huyền Nga cộng (2007), "Điều tra hợp chất carotenoit số thực vật Việt Nam ", Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ., 23, tr 130-134 12 Đỗ Thị Thảo (2006), Nghiên cứu xác định khả phòng chống ung thư chất hóa học số thuốc Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học 13 Trần Thế Tục, Đoàn Thế Lư (2004), Cây đu đủ kỹ thuật trồng, Nhà xuất lao động - xã hội 14 Nguyễn Tường Vân, Đặng Hồng Vân cộng (1983), "Chiết xuất xác định carpaine alkaloid đu đủ", Tạp chí dược học số TIẾNG ANH 15 Afzan A., Abdullah N R., et al (2012), "Repeated dose 28-days oral toxicity study of Carica papaya L leaf extract in Sprague Dawley rats", Molecules, 17(4), pp 4326-42 16 Ahmad N., Fazal H., et al (2011), "Dengue fever treatment with Carica papaya leaves extracts", Asian pacific journal tropical biomedicine, 1(4), pp 330-333 17 Akhter T., Khan M I., et al (2014), "Comparative evaluation of platelet augmentation activity of Carica papaya leaf juice and hydrocortisone in thrombocytopenic rats", Bangladesh Journal of Physiology and Pharmacology, 30(2), pp 32-40 18 Alan D Michelson (2006), Platelets, pp 587-610 19 Aursnes I (1973), "Appearance of Red Cells in Peripheral Lymph during Radiation‐Induced Thrombocytopenia", Acta Physiologica, 88, pp 392–400 20 Ayoola G A., Coker H A., et al (2008), "Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Some Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern Nigeria ", Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 7(3), pp 1019-1024 21 Baskaran C., Velu S., et al (2012 ), "The efficacy of Carica papaya leaf extract on some bacterial and a fungal strain by well diffusion method", Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2, pp S658-S662 22 Blajchman M A., Senyi A F., et al (1979), "Shortening of the bleeding time in rabbits by hydrocortisone caused by inhibition of prostacyclin generation by the vessel wall", J Clin Invest, 63(5), pp 1026-35 23 Bordoloi P., Devi D., et al (2016), "A comparative study of the platelet augmentation potential of leaf extracts of Psidium guajava with Carica papaya in thrombocytopenic rats", Scholars Journal of Applied Medical Sciences, 4(8A), pp 2774-2782 24 Dejana E., Villa S., et al (1982), "Bleeding time in rats: a comparison of different experimental conditions", Thromb Haemost, 48(1), pp 108-11 25 Dharmarathna S L., Wickramasinghe S., et al (2013), "Does Carica papaya leaf-extract increase the platelet count? An experimental study in a murine model", Asian Pac J Trop Biomed, 3(9), pp 720-724 26 Erkurt M A., Kaya E., et al (2012), "Thrombocytopenia in Adults: Review Article", 1, pp 44-53 27 Gadhwal A K., Ankit B S., et al (2016), "Effect of Carica papaya leaf extract capsule on platelet count in patients of dengue fever with thrombocytopenia", Journal of The Association of Physicians of India, 64(6), pp 22-26 28 Gammulle A., Ratnasooriya W D., et al (2012), "Thrombocytosis and Antiinflammatory Properties, and Toxicological Evaluation of Carica papaya Mature Leaf Concentrate in a Murine Model", International Journal of Medicinal Plants Research, 1(2), pp 21-30 29 Godara H., Hirbe A., et al (2013), The Washington manual of medical therapeutics, pp 725-733 30 Guruprasad NB, Rajesh Dasaraju, et al (2015), "Effect of Carica papaya leaf extract on hydroxyurea induced hematological and biochemical parameters in wistar albino rats", International Journal of Therapeutic Applications, 26, pp 1-5 31 Hampilos K E., Corn J., et al (2015), "Effect of Carica papaya leaf extract on platelet count in chronic immune thrombocytopenic purpura: A case series", pp 32 Hong N I E., Kong-yan L I., et al (2009), "Establishment of a Mouse Thrombocytopenia Model Induced by Cyclophosphamide", Zoological Research, 30(6), pp 645-652 33 Hottz E., Tolley N D., et al (2011), "Platelets in dengue infection", Drug Discovery Today: Disease Mechanisms, 8(1-2), pp e33-e38 34 Huang K J., Li S Y., et al (2000), "Manifestation of thrombocytopenia in dengue-2-virus-infected mice", J Gen Virol, 81(Pt 9), pp 2177-82 35 Kasper D., Fauci A., et al (2015), Harrison's Principles of Internal Medicine, pp 725-730 36 Krishna K.L., Paridhavi M., et al (2008), "Review on nutritional, medicinal and pharmacological properties of papaya (Carica papaya Linn.)", Natural Product Radiance, 7(4), pp 364-373 37 Kristiana H., Nailufar F., et al (2013), "A Model of Rat Thrombocytopenia Induced by Cyclophosphamide", Journal Farmasi Indonesia, 6(3), pp 177-183 38 Kumar M S., Geetha M , et al (2018), "Evaluation of efficacy of Carica papaya leaf extracts to increase platelet count in hydroxyurea induced thrombocytopenia in Albino rats", International Journal of Basic & Clinical Pharmacology, 7(1), pp 173-178 39 Kuter D J., Beeler D L., et al (1994), "The purification of megapoietin: a physiological regulator of megakaryocyte growth and platelet production", Proceedings of the National Academy of Sciences, 91(23), pp 11104-11108 40 Kuter D J., Rosenberg R D (1995), "The reciprocal relationship of thrombopoietin (c-Mpl ligand) to changes in the platelet mass during busulfaninduced thrombocytopenia in the rabbit", Blood, 85(10), pp 2720-30 41 McDonald T P., Clift R (1976), "Mechanism of Thrombocytopenia Induced in Mice by Anti-Platelet Serum", Haemostasis, 5(1), pp 38-50 42 Milind P., Gurditta G (2011), "Basketful benefits of papaya", International research journal of pharmacy, 2(7), pp 6-12 43 Nguyen T T., Shaw P N., et al (2013), "Anticancer activity of Carica papaya: a review", Mol Nutr Food Res, 57(1), pp 153-64 44 Njoku V O., Obi C (2009), "Phytochemical constituents of some selected medicinal plants", African Journal of Pure and Applied Chemistry, 3(11), pp 228-233 45 Nurden A T., Viallard J F., et al (2009), "New-generation drugs that stimulate platelet production in chronic immune thrombocytopenic purpura", Lancet, 373(9674), pp 1562-9 46 Okamura Y., Takeoka S., et al (2005), "Hemostatic effects of fibrinogen gamma-chain dodecapeptide-conjugated polymerized albumin particles in vitro and in vivo", Transfusion, 45(7), pp 1221-8 47 Otsuki N., Dang N H., et al (2010), "Aqueous extract of Carica papaya leaves exhibits anti-tumor activity and immunomodulatory effects", J Ethnopharmacol, 127(3), pp 760-7 48 Owoyele B V., Adebukola O M., et al (2008), "Anti-inflammatory activities of ethanolic extract of Carica papaya leaves", Inflammopharmacology, 16(4), pp 168-73 49 Patil S., Shetty S., et al (2013), "Evaluation of Platelet Augmentation Activity of Carica papaya Leaf Aqueous Extract in Rats", Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 1(5), pp 57-60 50 Romasi E., Karina J K., et al (2011), "Antibacterial activity of papaya leaf extracts against pathogenic bacteria", Makara Journal of Technology, 5(2), pp 173-177 51 Rumiyati, Sismindari dan Ariyani (2006), "Effect of protein fraction of Carica papaya L leaves on the expressions of p53 and Bcl-2 in breast cancer cells line", Majalah Farmasi Indonesia, 17(4), pp 170-176 52 Saraf M., Kavimandan B (2017), "Animal Trials of Carica Papaya Leaf Extracts for Increasing Platelet Count", Indian Journal of Public Health, 8(4), pp 783-787 53 Semple J W (2010), "Animal models of immune thrombocytopenia (ITP)", Ann Hematol, 89 Suppl 1, pp 37-44 54 Smock K J., Perkins S L (2014), "Thrombocytopenia: an update", International Journal of Laboratory Hematology, 36(3), pp 269-278 55 Song S., Crow A R., et al (2003), "Monoclonal IgG can ameliorate immune thrombocytopenia in a murine model of ITP: an alternative to IVIG", Blood, 101(9), pp 3708-13 56 Srikanth G., Babu S M., et al (2010), "Studies on in-vitro antioxidant activities of Carica papaya aqueous leaf extract", Research Journal of Pharmaceutical Biological and Chemical Sciences, 1, pp 59-65 57 Taguchi K., Ujihira H., et al (2013), "Pharmacokinetic study of adenosine diphosphate-encapsulated liposomes coated with fibrinogen gamma-chain dodecapeptide as a synthetic platelet substitute in an anticancer drug-induced thrombocytopenia rat model", J Pharm Sci, 102(10), pp 3852-9 58 Tahir N., Zaheer Z., et al (2014), "Prevention of fall in platelet count by Carica papaya leaf juice in carboplatin induced thrombocytopaenia in mice", Biomedica, 30(1), pp 21-25 59 Tripathi K D (2013), Essentials of Medical Pharmacology, Jaypee brothers medical publishers (p) ltd, pp 860 60 Venkataraman N., Pamukuntla S., et al (2015), "Platelet Augmentation Activity of Andrographis Paniculata Extract and Andrographolide against Cyclophosphamide Induced Thrombocytopenia in Rats", Pharmacy & Pharmacology International Journal, 2(4), pp 61 Woo S., Krzyzanski W., et al (2008), "Pharmacodynamic model for chemotherapy-induced anemia in rats", Cancer Chemother Pharmacol, 62(1), pp 123-33 62 Woods M C., Gamble F N., et al (1953), "Control of the postirradiation hemorrhagic state by platelet transfusions", Blood, 8(6), pp 545-53 63 Yamashita K M., Nogueira T O., et al (2011), "Involvement of circulating platelets on the hyperalgesic response evoked by carrageenan and Bothrops jararaca snake venom", J Thromb Haemost, 9(10), pp 2057-66 64 Yang C., Li Y C., et al (1999), "The physiological response of thrombopoietin (c-Mpl ligand) to thrombocytopenia in the rat", Br J Haematol, 105(2), pp 47885 65 Yunita F , Hanani E., et al (2012), "The effect of Carica papaya L leaves extract capsules on platelets count and hematocrit level in dengue fever patient", Int J Med Aromat Plants, 2(4), pp 573-578 66 Yusha’u M., Onuorah F C., et al (2009), "In-vitro sensitivity pattern of some urinary tract isolates to Carica papaya extracts", Bayero Journal of Pure and Applied Sciences, 2, pp 75-78 67 Zhang Q., Peng H J., et al (2003), "[Establishment of a mouse model of cyclophosphamide-induced thrombocytopenia and determination of platelet function in this model]", Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao, 23(12), pp 1277-9, 1282 68 Zunjar V., Dash R P., et al (2016), "Antithrombocytopenic activity of carpaine and alkaloidal extract of Carica papaya Linn leaves in busulfan induced thrombocytopenic Wistar rats", Journal of Ethnopharmacology, 181, pp 20-25 ... gây giảm tiểu cầu cyclophosphamid busulfan chuột cống trắng Đánh giá tác dụng cao tồn phần đu đủ mơ hình gây giảm tiểu cầu triển khai CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giảm tiểu cầu Định nghĩa Giảm tiểu cầu. .. Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ CHI MÃ SINH VIÊN: 1301037 TRIỂN KHAI MƠ HÌNH GÂY GIẢM TIỂU CẦU BẰNG HÓA CHẤT ĐỘC TẾ BÀO TRÊN CHUỘT CỐNG TRẮNG VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CAO TOÀN... độ giảm tiểu cầu nhạy cảm với độc tính hóa trị liệu Do đó, chúng tơi thực đề tài Triển khai mơ hình gây giảm tiểu cầu hóa chất độc tế bào chuột cống trắng với mục tiêu: Triển khai mô hình gây