Hoàn thiện mô hình gây độc gan cấp bằng carbon tetraclorid trên chuột nhắt trắng và áp dụng đánh giá tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm vượng gan

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MẠC THỊ MAI MÃ SINH VIÊN: 1201368 HOÀN THIỆN MÔ HÌNH GÂY ĐỘC GAN CẤP BẰNG CARBON TETRACLORID TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CHẾ PHẨM VƯỢNG CAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2017 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MẠC THỊ MAI MÃ SINH VIÊN: 1201368 HOÀN THIỆN MÔ HÌNH GÂY ĐỘC GAN CẤP BẰNG CARBON TETRACLORID TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ GAN CỦA CHẾ PHẨM VƯỢNG CAN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Đào Thị Vui ThS Trần Hồng Linh Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Bằng tất lòng kính trọng biết ơn sâu sắc em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Đào Thị Vui, Ths Trần Hồng Linh - Bộ môn Dược lực - Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, quan tâm giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới tất thầy cô giáo Bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt Ths Ngô Thanh Hoa DS Phạm Đức Vịnh truyền thụ cho em học quý báu, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu môn Em xin chân thành cảm ơn DS Đinh Đại Độ DSTH Nguyễn Thị Thủy anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực trực tiếp tham gia giúp đỡ em thời gian nghiên cứu Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho em thời gian em học tập trường Em xin cảm ơn anh chị, bạn bè nghiên cứu khoa học Bộ môn Dược lực đồng hành, hỗ trợ, động viên để em hoàn thành khóa luận Cuối cùng, em xin bày tỏ yêu thương biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè bên cạnh, ủng hộ chỗ dựa tinh thần em gặp khó khăn học tập sống Hà Nội, tháng năm 2017 Sinh viên Mạc Thị Mai MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Mô hình gây độc gan cấp thực nghiệm .3 1.1.1 Mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid 1.1.2 Một số mô hình gây độc gan cấp tác nhân khác 1.1.3 Thuốc đối chiếu silymarin mô hình gây độc gan cấp 13 1.2 Chế phẩm Vượng Can 16 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .18 2.1.2 Động vật thí nghiệm 18 2.1.3 Hóa chất, thuốc thử 19 2.1.4 Thiết bị nghiên cứu 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Khảo sát thời điểm lấy mẫu để định lượng thông số nghiên cứu sau gây độc carbon tetraclorid 21 2.3.2 Khảo sát khả gây tổn thương gan số mức liều carbon tetraclorid chuột nhắt trắng 21 2.3.3 Khảo sát số mức liều silymarin sử dụng làm thuốc đối chiếu mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid chuột nhắt trắng 23 2.3.4 Đánh giá tác dụng bảo vệ gan chế phẩm Vượng Can mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid chuột nhắt trắng 24 2.3.5 Thông số đánh giá 25 2.4 Xử lý số liệu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ 28 3.1 Kết khảo sát thời điểm lấy mẫu để định lượng thông số nghiên cứu sau gây độc carbon tetraclorid 28 3.2 Kết khảo sát khả gây tổn thương gan số mức liều carbon tetraclorid chuột nhắt trắng 29 3.2.1 Ảnh hưởng số mức liều carbon tetraclorid đến hoạt độ AST ALT huyết .30 3.2.2 Ảnh hưởng số mức liều carbon tetraclorid đến hàm lượng MDA gan 31 3.2.3 Ảnh hưởng số mức liều carbon tetraclorid đến hình ảnh đại thể gan .32 3.2.4 Ảnh hưởng số mức liều carbon tetraclorid đến hình ảnh vi thể gan .32 3.3 Kết khảo sát số mức liều silymarin sử dụng làm thuốc đối chiếu mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid chuột nhắt trắng .34 3.3.1 Ảnh hưởng silymarin đến hoạt độ AST ALT huyết chuột gây tổn thương gan carbon tetraclorid 34 3.3.2 Ảnh hưởng silymarin đến hàm lượng MDA gan chuột gây tổn thương gan carbon tetraclorid .35 3.3.3 Ảnh hưởng silymarin đến hình ảnh đại thể gan chuột gây tổn thương gan carbon tetraclorid 36 3.3.4 Ảnh hưởng silymarin đến hình ảnh vi thể gan chuột gây tổn thương gan carbon tetraclorid 37 3.4 Kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan chế phẩm Vượng Can mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid chuột nhắt trắng 38 3.4.1 Ảnh hưởng chế phẩm Vượng Can đến hoạt độ AST ALT huyết chuột gây tổn thương gan carbon tetraclorid .38 3.4.2 Ảnh hưởng chế phẩm Vượng Can đến hàm lượng MDA gan chuột gây tổn thương gan carbon tetraclorid 39 3.4.3 Ảnh hưởng chế phẩm Vượng Can đến hình ảnh đại thể gan chuột gây tổn thương gan carbon tetraclorid 40 3.4.4 Ảnh hưởng chế phẩm Vượng Can đến hình ảnh vi thể gan chuột gây tổn thương gan carbon tetraclorid 41 CHƯƠNG BÀN LUẬN .43 4.1 Về kết khảo sát số điều kiện thực mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid chuột nhắt trắng .43 4.1.1 Về kết khảo sát thời điểm lấy mẫu để định lượng thông số nghiên cứu sau gây độc carbon tetraclorid 44 4.1.2 Về kết khảo sát khả gây tổn thương gan số mức liều carbon tetraclorid chuột nhắt trắng 44 4.1.3 Về kết khảo sát số mức liều silymarin sử dụng làm thuốc đối chiếu mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid chuột nhắt trắng 47 4.2 Về kết đánh giá tác dụng bảo vệ gan chế phẩm Vượng Can mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid chuột nhắt trắng 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ALT Alanin amino transferase AST Aspartat amino transferase ALP Alkalin phosphatase (phosphatase kiềm) ARN Acid ribonucleic CAT Catalase CCl4 Carbon tetraclorid CCl3* Gốc tự tricloromethyl CCl3OO* Gốc tự tricloromethylperoxy D-GalN D-galactosamin GSH Glutathion GPx Glutathione peroxidase LPS Lipopolysaccharid LDH Lactat dehydrogenase MDA Malondialdehyd NaCMC Natri carboxymethyl cellulose NO Nitric oxyd ROS Reactive oxygen species (gốc oxy hoạt động) SOD Superoxid dismutase TNF Tumor necrosis factor (yếu tố hoại tử khối u) TGF Transforming growth factor (yếu tố tăng trưởng chuyển dạng) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số điều kiện tiến hành mô hình gây độc gan cấp CCl4 .7 Bảng 1.2 Ảnh hưởng CCl4 lên số thông số phản ánh chức gan Bảng 1.3 Chế độ liều thuốc đối chiếu silymarin mô hình gây độc gan cấp 15 Bảng 3.1 Ảnh hưởng số mức liều CCl4 đến hoạt độ enzym AST ALT huyết chuột thí nghiệm .30 Bảng 3.2 Ảnh hưởng số mức liều CCl4 đến hàm lượng MDA gan chuột thí nghiệm 31 Bảng 3.3 Ảnh hưởng silymarin đến hoạt độ AST ALT huyết chuột gây tổn thương gan CCl4 34 Bảng 3.4 Ảnh hưởng silymarin đến hàm lượng MDA gan chuột gây tổn thương gan CCl4 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cơ chế gây tổn thương gan carbon tetrachorid Hình 1.2 Cơ chế gây tổn thương gan paracetamol 10 Hình 1.3 Cơ chế bảo vệ gan silymarin 15 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 20 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm khảo sát thời điểm lấy mẫu để định lượng thông số nghiên cứu sau gây độc CCl4 .21 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm khảo sát khả gây tổn thương gan số mức liều CCl4 chuột nhắt trắng .22 Hình 2.4 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm khảo sát số mức liều silymarin sử dụng làm thuốc đối chiếu mô hình gây độc gan cấp carbon tetraclorid 24 Hình 2.5 Sơ đồ thiết kế thí nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ gan chế phẩm Vượng Can 25 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hoạt độ AST ALT huyết chuột gây độc CCl4 thời điểm 24 48 sau gây độc 28 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn hàm lượng MDA gan chuột gây độc CCl4 thời điểm 24 48 sau gây độc 29 Hình 3.3 Hình ảnh minh họa đại thể gan lô chuột thí nghiệm 32 Hình 3.4 Hình ảnh minh họa tổn thương vi thể gan lô chuột thí nghiệm 33 Hình 3.5 Hình ảnh đại thể gan đặc trưng lô chuột thí nghiệm 36 Hình 3.6 Hình ảnh minh họa ảnh hưởng silymarin đến vi thể gan chuột gây tổn thương gan CCl4 37 Hình 3.7 Ảnh hưởng chế phẩm Vượng Can đến hoạt độ AST ALT 38 Hình 3.8 Ảnh hưởng chế phẩm Vượng Can đến hàm lượng MDA gan chuột gây tổn thương gan CCl4 .39 Hình 3.9 Ảnh hưởng chế phẩm Vượng Can đến hình ảnh đại thể gan .41 Hình 3.10 Hình ảnh minh họa ảnh hưởng chế phẩm Vượng Can vi thể gan chuột gây độc CCl4 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh gan nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới [33] Đây bệnh lý đặc trưng tổn thương gan mức độ tế bào, mô, cấu trúc, chức Có nhiều nguyên nhân gây tổn thương gan tác nhân sinh học (vi khuẩn, virus, ký sinh trùng), bệnh tự miễn (viêm gan miễn dịch, xơ gan ứ mật tiên phát), hóa chất (ethanol, carbon tetraclorid (CCl4) ) thuốc (paracetamol liều cao, thioacetamid…) [46],[56],[79] Trong xã hội nay, lối sống không lành mạnh với việc sử dụng nhiều thuốc lạm dụng rượu bia khiến tỷ lệ mắc bệnh gan ngày gia tăng Mặc dù y học đại đạt bước tiến lớn, phương pháp điều trị lựa chọn thuốc điều trị bệnh gan nhiều hạn chế Bên cạnh đó, số thuốc có nguồn gốc hóa dược dùng điều trị bệnh gan có khả gây tổn thương gan [46] Điều đặt nhu cầu tìm kiếm thuốc có hiệu an toàn dự phòng điều trị bệnh gan Nghiên cứu phát triển thuốc đặc biệt thuốc có nguồn gốc dược liệu điều trị bệnh gan hướng tiếp cận có tiềm thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học giới [56],[93] Ở Việt Nam, việc sử dụng thuốc chế phẩm có nguồn gốc dược liệu điều trị theo kinh nghiệm bệnh gan ghi nhận từ lâu Tuy nhiên, để áp dụng rộng rãi chế phẩm có nguồn gốc dược liệu dự phòng điều trị bệnh lý này, cần có nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng để đánh giá tác dụng, hiệu độ an toàn thuốc, chế phẩm Thử nghiệm đánh giá tác dụng bảo vệ gan mô hình gây độc gan cấp thử nghiệm quan trọng trình nghiên cứu thuốc bảo vệ gan [13] Trong mô hình gây độc gan cấp công bố, mô hình gây độc gan CCl4 mô hình sử dụng phổ biến [39] Hiệu gây tổn thương gan CCl4 phụ thuộc vào đường dùng, liều dùng, thời gian dùng, thời điểm lấy mẫu, chủng động vật thường có dao động lớn nghiên cứu khác [7],[12],[33],[54],[86] Bên cạnh đó, thuốc đối chiếu yếu tố quan Ở thí nghiệm này, tác dụng bảo vệ gan chế phẩm Vượng Can đánh giá mô hình gây độc gan cấp 0,5 ml/kg CCl4 (i.p) sử dụng chứng dương silymarin 100 mg/kg Chế phẩm thử với mức liều 1130 mg/kg 2260 mg/kg Hai mức liều quy đổi từ liều thường dùng người liều gấp đôi liều thường dùng người Kết cho thấy chế phẩm Vượng Can với mức liều thử 1130 mg/kg 2260 mg/kg làm giảm rõ rệt hoạt độ AST huyết (tương ứng 27,7% (p