Triển khai mô hình gây lo âu thực nghiệm bằng cắt buồng trứng hoặc gây stress cô lập và áp dụng đánh giá tác dụng của l tetrahydropalmatin

Các nghiên cứu đánh giá tác dụng giải lo âu hiện nay đều dựa trên các mô hình động vật bình thường được cho phơi nhiễm cấp tính với các tác nhân gây sợ hãi như độ cao, ánh sáng, sốc điện

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ VĂN QUÂN

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY LO ÂU THỰC NGHIỆM BẰNG CẮT BUỒNG TRỨNG HOẶC GÂY STRESS CÔ LẬP

VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG

CỦA L-TETRAHYDROPALMATIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐỖ VĂN QUÂN

TRIỂN KHAI MÔ HÌNH GÂY LO ÂU THỰC NGHIỆM BẰNG CẮT BUỒNG TRỨNG HOẶC GÂY STRESS CÔ LẬP

VÀ ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG

CỦA L-TETRAHYDROPALMATIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới

ThS Nguyễn Thu Hằng, DS Phạm Đức Vịnh, TS Nguyễn Hoàng Anh là những

người thầy, người cô đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật,

TS Nguyễn Trần Linh, Bộ môn Bào chế, trường Đại học Dược Hà Nội đã có những

góp ý và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Đinh Đại Độ, kỹ thuật viên tại bộ môn Dược lực

trường ĐH Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và trực tiếp thực hiện nhiều công việc xuyên suốt trong quá trình tiến hành đề tài

Nhân đây em cũng xin gửi lời cảm ơn tới:

Các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược lực đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ để em có thể hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất

Các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các phòng ban, các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường

Em cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới những người thân trong gia đình, những người bạn đã luôn kịp thời động viên, ủng hộ em trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong thời gian thực hiện khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Đỗ Văn Quân

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Lo âu và rối loạn lo âu 3

1.1.1 Khái niệm lo âu và rối loạn lo âu 3

1.1.2 Phân loại rối loạn lo âu 4

1.1.3 Sinh hóa thần kinh trong rối loạn lo âu 4

1.1.4 Điều trị rối loạn lo âu 6

1.2 Các test đánh giá lo âu và giải lo âu 8

1.2.1 Các test có điều kiện 8

1.2.2 Các test không có điều kiện 10

1.3 Các mô hình gây lo âu 11

1.3.1 Mô hình gây lo âu bằng phương pháp di truyền 12

1.3.3 Mô hình gây lo âu bằng phương pháp thay đổi môi trường sống và phương pháp sử dụng tác nhân hóa học 15

1.4 l-tetrahydropalmatin 16

1.4.1.Tác dụng giải lo âu 16

1.4.2.Các tác dụng dược lý hướng thần kinh và tâm thần khác 18

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Đối tượng 20

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 20

2.1.3 Động vật thí nghiệm 20

2.1.4 Chuẩn bị thuốc thử 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 21

2.2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 21

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 21

2.2.4 Liều lượng sử dụng trong nghiên cứu 22

2.2.5 Thiết kế nghiên cứu 22

2.2.5.1 Mô hình cắt buồng trứng 22

2.2.5.2 Mô hình nuôi cô lập 23

2.2.5.2 Áp dụng mô hình gây lo âu phù hợp và đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP trên mô hình đã chọn 24

2.2.6 Các test đánh giá lo âu, giải lo âu trong nghiên cứu 25

2.2.6.1 Test chữ thập nâng cao (EPM) 25

2.2.6.2 Test môi trường mở (OFT) 26

2.3 Xử lý số liệu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1 Đánh giá khả năng gây lo âu thực nghiệm trên mô hình cắt buồng trứng 29

3.1.1 Đánh giá mức độ gây lo âu theo thời gian sử dụng test EPM 29

3.1.2 Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng tới hoạt động tự nhiên và khám phá của chuột 32

3.2 Đánh giá khả năng gây lo âu thực nghiệm trên mô hình nuôi cô lập 33

3.2.1 Đánh giá khả năng gây lo âu sử dụng test EPM 33

3.2.2 Ảnh hưởng của mô hình nuôi cô lập tới hoạt động tự nhiên và khám phá của chuột 35

3.3 Áp dụng mô hình gây lo âu phù hợp để đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP 36 3.3.1 Đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP trên chuột đã được gây lo âu 36 3.3.3 Ảnh hưởng của l-THP tới hoạt động tự nhiên và khám phá ở chuột đã được gây lo âu 39 3.4 Bàn luận 41

3.4.1 Kết quả gây lo âu trên 2 mô hình: mô hình cắt buồng trứng và mô hình nuôi cô lập 41

3.4.2 Tác dụng của l-THP trên mô hình gây lo âu thực nghiệm 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

5-HT 5-hydroxytryptamin (serotonin)

APA Hiệp hội tâm thần Hoa Kỳ (American Psychiatric

Association)

CREB Protein liên kết từng phần đáp ứng với AMP vòng

(Cyclic-AMP response element-binding protein) CRF Yếu tố giải phóng corticotropin (corticotropin-releasing

factor)

CS Kích thích có điều kiện (conditioned stimulus)

DSM-IV-TR Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th

Edition, Text Revision EPM Test chữ thập nâng cao (Elevated plus maze)

ERK Protein chuyển gốc phosphat điều hòa tín hiệu ngoại bào

(Extracellular signal-regulated kinase) ETM Test chữ T nâng cao (Elevated T maze)

EZM Test chữ O nâng cao (Elevated Zero maze)

FPS Test tăng phản xạ giật mình do sợ hãi (fear-potentiated

startle) GABA Gamma amino butyric acid

GAD Rối loạn lo âu lan tỏa (Generalized anxiety disorder)

HPA Trục dưới đồi-tuyến yên-tuyến thượng thận

(hypothalamic-pituitary-adrenal ICD-10 International Classification of Diseases, Tenth Revision

LDB Test 2 ngăn sáng tối (light/dark box)

mCPP m-chlorophenylpiperazin

OFT Test môi trường mở (Open field test)

PD Rối loạn hoảng sợ (panic disorder)

PTZ Pentylenetetrazol

SSRI Ức chế tái thu hồi chọn lọc serotonin (Serotonin selective

reuptake inhibitors) TCAs Thuốc chống trầm cảm 3 vòng (Tricyclic antidepressants)THP Tetrahydropalmatin

US Kích thích không có điều kiện (unconditioned stimulus) WHO Tổ chức Y tế thế giới (World health organization)

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng trên các chỉ tiêu

3.2 Ảnh hưởng của mô hình nuôi cô lập trên các chỉ tiêu đánh

3.3 Ảnh hưởng của l-THP ở mô hình nuôi cô lập trên các chỉ

tiêu đánh giá của test môi trường mở (OFT) 39

3.1 Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng trên thời gian lưu

3.2 Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng trên số lần đi vào

3.3 Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng trên tổng số lần đi

3.4 Ảnh hưởng của nuôi cô lập đến thời gian lưu lại tay hở 33

3.5 Ảnh hưởng của nuôi cô lập đến số lần đi vào tay hở và tổng

3.6 Tác dụng của diazepam (DZP) và l-THP trên thời gian lưu

lại tay hở ở chuột gây lo âu bằng nuôi cô lập 37

3.7

Tác dụng của diazepam (DZP) và l-THP trên số lần đi vào

tay hở và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín ở chuột gây

lo âu bằng nuôi cô lập

38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn lo âu (anxiety disorder) là một bệnh lý nghiêm trọng, ảnh hưởng tới tâm sinh lý cũng như hành vi của người bệnh Bệnh có tỷ lệ mắc cao và có xu hướng ngày càng gia tăng [30] Các phương pháp điều trị chủ yếu hiện nay là phối hợp các liệu pháp tâm lý cùng các thuốc giải lo âu Hạn chế lớn nhất của các nhóm thuốc này

là khả năng lệ thuộc thuốc, hội chứng cai thuốc và các tác dụng không mong muốn khác Điều này đặt ra nhu cầu tìm kiếm các thuốc giải lo âu mới, có tác dụng tương đương, đồng thời hạn chế các tác dụng không mong muốn của các nhóm thuốc trên [66] Nhiều mô hình thực nghiệm trên động vật đã được xây dựng, thẩm định và áp dụng trong việc đánh giá tác dụng giải lo âu của nhiều thuốc, đặc biệt là các thuốc có nguồn gốc dược liệu

Các nghiên cứu đánh giá tác dụng giải lo âu hiện nay đều dựa trên các mô hình động vật bình thường được cho phơi nhiễm cấp tính với các tác nhân gây sợ hãi như

độ cao, ánh sáng, sốc điện Nhưng rối loạn lo âu là một bệnh lý có cơ chế phức tạp

và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố Do đó, để xác định chính xác cơ chế của các thuốc giải lo âu mới và thu hẹp khoảng cách giữa kết quả nghiên cứu so với thực tế, cần xây dựng các mô hình động vật thực nghiệm có thể mô phỏng các đặc điểm sinh bệnh học của rối loạn lo âu Có nhiều mô hình được xây dựng dựa trên việc mô phỏng các nguyên nhân gây ra rối loạn lo âu, trong đó, hai mô hình được sử dụng phổ biến

là mô hình cắt buồng trứng và mô hình nuôi cô lập Hai mô hình này có khả năng mô phỏng hai loại rối loạn lo âu thường gặp trong thực tế cuộc sống của con người: rối loạn lo âu thời kỳ tiền mãn kinh và rối loạn lo âu do stress Với mô hình cắt buồng trứng, một số tác giả trên thế giới sử dụng để đánh giá tác dụng giải lo của thuốc trên động vật thí nghiệm Tuy nhiên, thời gian và khả năng gây lo âu thực nghiệm của mô hình này còn nhiều mâu thuẫn giữa kết quả các nghiên cứu [23], [24], [31], [38] Tại Việt Nam, chưa có tác giả nào tiếp cận mô hình này theo hướng nghiên cứu rối loạn

lo âu Trong khi đó mô hình nuôi cô lập đã được nhiều tác giả sử dụng nhằm đánh giá các vấn đề khác nhau như stress, trầm cảm Năm 2013, Khổng Trọng Quân và cộng sự đã sử dụng mô hình này để đánh giá tác dụng của hai dược liệu thuộc chi

Stephania Tuy nhiên, việc chỉ sử dụng một test EPM như trong nghiên cứu không

cho phép đánh giá được nhiều khía cạnh khác nhau của một mô hình gây lo âu [7]

Vì vậy, cần thiết phải phối hợp nhiều test khác nhau trong cùng một mô hình nhằm xác định chính xác hơn các vấn đề liên quan tới lo âu, cũng như khắc phục nhược điểm của các test đơn độc

Những năm gần đây, nhóm nghiên cứu của chúng tôi tiến hành đánh giá tác

dụng giải lo âu của cao chiết dược liệu thuộc chi Stephania Lour nói chung và

l-tetrahydropalmatin (l-THP) nói riêng Kết quả nghiên cứu của Lê Doãn Trí và cộng

sự cho thấy l-THP một hoạt chất tiềm năng trong điều trị các rối loạn lo âu [8], khẳng định lại kết quả đã thu được từ một số nghiên cứu được công bố trên thế giới [47], [78] Tuy nhiên, tất cả các nghiên cứu này mới dừng tại việc đánh giá tác dụng giải

lo âu của thuốc trên đối tượng chuột bình thường

Xuất phát từ thực tế trên, nhằm phát triển các mô hình dược lý nghiên cứu tác dụng giải lo âu của thuốc đồng thời tạo cơ sở cho việc phát triển và ứng dụng l-THP trong điều trị các rối loạn lo âu, đề tài được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Triển khai được mô hình gây lo âu thực nghiệm bằng phương pháp cắt buồng trứng (mô hình cắt buồng trứng) hoặc phương pháp nuôi cô lập (mô hình nuôi

cô lập)

2 Áp dụng mô hình gây lo âu thực nghiệm phù hợp để đánh giá tác dụng giải lo

âu của l-tetrahydropalmatin (l-THP)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Lo âu và rối loạn lo âu

1.1.1 Khái niệm lo âu và rối loạn lo âu

Lo âu (anxiety) là trạng thái cảm xúc thường được gây ra bởi sự nhận thức về một mối nguy hiểm có thực hoặc do cảm nhận, đe dọa đến sự an toàn của mỗi cá nhân Nó cho phép mỗi người chuẩn bị trước hoặc phản ứng với các thay đổi của môi trường Mỗi người đều phải trải qua sự lo lắng và sợ hãi nhất định khi phải đối mặt với những tình huống căng thẳng Đây là phản ứng thích nghi và chỉ xuất hiện thoáng qua trong tự nhiên Tuy nhiên, tình trạng lo âu quá mức có thể dẫn tới cảm giác khó chịu, gây suy nhược tâm lý (lo lắng hoặc nhạy cảm với các mối đe dọa) và kích thích sinh lý (khó thở, nhịp tim nhanh) Bệnh nhân trải qua những triệu chứng lo âu nghiêm trọng, kéo dài và bị ám ảnh bởi những nỗi sợ hãi vô lý, gây ảnh hưởng đến cuộc sống bình thường hằng ngày được coi là mắc chứng rối loạn lo âu [30]

Rối loạn lo âu (anxiety disorders) là một trong các rối loạn tâm thần thường gặp nhất trong thực hành lâm sàng [30] Lo âu thường đi kèm với nhiều rối loạn khác như mất ngủ, rối loạn ăn uống, rối loạn hành vi, đặc biệt là rối loạn trầm cảm Khoảng 3/4 bệnh nhân trầm cảm có lo âu kèm theo và trên 1/2 bệnh nhân lo âu có biểu hiện trầm cảm rõ rệt [9], [17] Các nhân viên y tế thường nhầm lẫn rối loạn lo âu và các bệnh thể chất, dẫn tới chỉ một phần số bệnh nhân được điều trị thích hợp Bệnh nhân rối loạn lo âu có tỷ lệ mắc các bệnh tim mạch, tiêu hóa hay các rối loạn hô hấp cao hơn

so với những người bình thường [30]

Để điều trị rối loạn lo âu một cách thích hợp, cần tiến hành một chẩn đoán đáng tin cậy Muốn làm được điều này, phải hiểu rõ sự khác biệt giữa các triệu chứng lo

âu thoáng qua (lo âu thông thường) và rối loạn lo âu (lo âu bệnh lý) dựa trên khả năng kiểm soát lo âu, thời gian kéo dài, cường độ lo âu cũng như các triệu chứng kèm theo

Lo âu thông thường là một phản ứng tự nhiên khi gặp một tình huống căng thẳng Các triệu chứng có thể nặng nhưng chỉ xuất hiện nhất thời và thường kéo dài không quá 2 - 3 tuần Trong một số trường hợp, trạng thái lo âu mất đi khi các tình huống căng thẳng được giải quyết, hoặc có thể điều trị hiệu quả bằng cách trấn an cũng như

các liệu pháp tâm lý đơn giản Tuy nhiên khi cần thiết có thể sử dụng các thuốc giải

lo âu như các benzodiazepin ngắn ngày cùng các thuốc điều trị triệu chứng Đối với

lo âu bệnh lý, lo âu thường không có nguyên nhân rõ rệt với các triệu chứng nặng, kéo dài dai dẳng gây khó chịu, ảnh hưởng đến hoạt động hàng ngày Bệnh nhân có thể có những ý nghĩ hoặc hành vi quá mức, vô lý (như né tránh, hành vi cưỡng chế…); đồng thời bệnh nhân cần phải được điều trị theo nguyên nhân gây bệnh sau khi đã được khám toàn diện về cơ năng và tâm thần [9]

1.1.2 Phân loại rối loạn lo âu

Rối loạn lo âu có thể được chia thành nhiều loại khác nhau dựa vào các biểu hiện lâm sàng, các nghiên cứu về dịch tễ, di truyền và sinh học cũng như sự đáp ứng với các phương pháp điều trị chuyên biệt Theo hệ thống phân loại bệnh tật quốc tế ICD – 10 của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 1992) và DSM-IV-TR của Hiệp Hội tâm thần Hoa Kỳ (APA, 2000), rối loạn lo âu được chia thành các loại như sau [12], [17]:

 Rối loạn lo âu lan tỏa (generalized anxiety disorder, GAD)

 Rối loạn hoảng sợ (panic disorder, PD) bao gồm có hoặc không có ám ảnh sợ khoảng trống (agoraphorbia)

 Rối loạn ám ảnh – cưỡng bức (obsessive-compulsive disorder)

 Rối loạn ám ảnh sợ khoảng trống không có tiền sử rối loạn hoảng sợ

 Rối loạn ám ảnh xã hội (social phorbia)

 Rối loạn stress sau sang chấn (post-traumatic stress disorder)

 Rối loạn stress cấp (acute stress disorder)

1.1.3 Sinh hóa thần kinh trong rối loạn lo âu

Kết quả từ các nghiên cứu sinh hóa và hình ảnh thần kinh cho thấy cơ chế gây

lo âu bệnh lý cũng như lo âu thông thường có liên quan đến nhiều khu vực não bộ và

sự bất thường một số hệ thống dẫn truyền thần kinh như noradrenalin (norepinephrine

- NE), acid γ-aminobutyric (GABA), serotonin (5-HT), yếu tố giải phóng corticotrophin (corticotropin-releasing factor, CRF) và cholecystokinin [30] Một số giả thuyết chính về cơ chế bệnh sinh của lo âu liên quan đến các chất trung gian thần kinh [17]:

 Kiểu noradrenalin: lo âu, tăng nhạy cảm và phản ứng quá mức với các tác nhân kích thích dẫn đến điều hòa xuống (down regulation) receptor 2 adrenergic trung ương

 Kiểu benzodiazepin: triệu chứng lo âu có thể do giảm hoạt động hệ GABAA, chất dẫn truyền ức chế của thần kinh trung ương

 Kiểu serotonin: các triệu chứng của rối loạn hoảng sợ liên quan đến sự thiếu hụt serotonin dẫn tới giảm hoạt động của con đường dẫn truyền serotonin Trong rối loạn lo âu lan tỏa (generalized anxiety disorder, GAD), hiệu quả điều trị của các benzodiazepin và buspiron đã hướng các nghiên cứu sinh học vào các hệ thống dẫn truyền thần kinh GABA và serotonin Các benzodiazepin (chất chủ vận receptor benzodiazepin) có tác dụng làm giảm lo âu trong khi flumazenil (chất đối kháng) lại làm tăng lo âu Sự bất thường của các receptor GABA-benzodiazepin có thể gặp trong các rối loạn lo âu lan tỏa Bệnh nhân rối loạn lo âu lan tỏa có sự giảm mật độ các receptor này ở các tế bào máu ngoại vi cũng như giảm các ARN truyền tin Cả hai sẽ trở về bình thường khi được điều trị và lo âu đã giảm Các hệ thống dẫn truyền thần kinh khác cũng đã được nghiên cứu trong rối loạn lo âu lan tỏa bao gồm noradrenergic, glutamat và cholecystokinin [5], [17] Vai trò của noradrenalin tương đối phức tạp, nồng độ noradrenalin và các chất chuyển hóa của nó tăng lên ở bệnh nhân rối loạn lo âu trong khi receptor 2 thì lại giảm đi Vai trò của gen và các yếu tố

di truyền cũng tương đối rõ ràng trong rối loạn lo âu lan tỏa Các vùng não khác được cho là có liên quan đến rối loạn lo âu lan tỏa gồm: các hạch đáy não, hệ viền, thùy thái dương trái và vỏ não thùy trán Trong đó thùy thái dương trái ở các bệnh nhân có rối loạn lo âu lan tỏa là nơi có nhiều receptor benzodiazepin bị ức chế nhất [5] Trong rối loạn hoảng sợ (panic disorder, PD), một số nghiên cứu về cơ sở sinh học nhận thấy các triệu chứng của rối loạn này có liên quan đến các bất thường sinh học trong cấu trúc và chức năng não Các nghiên cứu này đã đưa đến giả thuyết cho rằng sự rối loạn điều chỉnh (dysregulation) của hệ thần kinh trung ương và ngoại biên

có liên quan đến sinh lý bệnh của rối loạn hoảng sợ Hệ thần kinh tự chủ của một số bệnh nhân mắc chứng rối loạn hoảng sợ được cho là bị tăng trương lực giao cảm,

thích ứng chậm với các kích thích mạnh và đáp ứng quá mức với các kích thích trung bình Các hệ thần kinh chính được cho là có liên quan bao gồm noradrenergic, seroroninergic, GABA, trục dưới đồi-tuyến yên-tuyến thượng thận (hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA) và các yếu tố di truyền Sự rối loạn hoạt động hệ serotonergic rất rõ rệt trong rối loạn hoảng sợ Nhiều nghiên cứu với các thuốc chủ vận-đối kháng hỗn hợp receptor serotonin đã làm tăng lo âu, các đáp ứng này có thể do sự tăng nhạy cảm với serotonin sau synap trong rối loạn hoảng sợ Cũng có bằng chứng tiền lâm sàng cho rằng, giảm chất dẫn truyền loại ức chế GABA cục bộ trong hạnh nhân đáy bên, não giữa và dưới đồi có thể gây ra các đáp ứng sinh lý giống lo âu Các dữ liệu sinh học đã tập trung vào não giữa, hệ viền (có thể liên quan tới lo âu viễn tưởng) và

vỏ não trước trán (có thể liên quan tới né tránh ám ảnh) Trong số các chất dẫn truyền thần kinh khác nhau có liên quan, hệ noradrenergic được chú ý nhiều nhất, đặc biệt với receptor α2-adrenergic trước synap Vai trò của các receptor này được thăm dò qua thử nghiệm dược lý trên động vật thực nghiệm với clonidin (chủ vận receptor α2)

và yohimbin (đối kháng receptor α2) gây ra các hoạt động giống hoảng loạn ở các bệnh nhân rối loạn hoảng sợ Một số nghiên cứu khác cho thấy yếu tố di truyền có thể ảnh hưởng tới bệnh rối loạn lo âu Ở người bình thường, tỷ lệ bị rối loạn hoảng

sợ là 2,3% trong khi ở gia đình có một người bị rối loạn thì tỷ lệ bị bệnh của những người còn lại trong gia đình là 24,7% Ở người sinh đôi cùng trứng, tỷ lệ bị bệnh cao gấp 5 lần so với những người sinh đôi khác trứng [5], [17]

Tương tự như GAD và PD, cơ chế bệnh sinh của các kiểu rối loạn lo âu khác có thể liên quan tới một số chất dẫn truyền thần kinh cùng các yếu tố di truyền cũng như

sự thay đổi môi trường sống Tuy nhiên mức độ ảnh hưởng của các yếu tố trong mỗi kiểu rối loạn có thể khác nhau [5]

1.1.4 Điều trị rối loạn lo âu

Hiện nay, phương pháp điều trị rối loạn lo âu chủ yếu là phối hợp liệu pháp tâm

lý với thuốc giải lo âu (anxiolytics) Các liệu pháp tâm lý chính bao gồm: liệu pháp động thái tâm lý, liệu pháp nhận thức và liệu pháp hành vi Có thể sử dụng đơn độc một liệu pháp hoặc kết hợp các liệu pháp này với nhau Nếu điều trị lâu dài, những

liệu pháp tâm lý này có thể cho hiệu quả tương đương liệu pháp dùng thuốc Trong khi đó, thuốc giải lo âu có nguồn gốc hóa dược chính sử dụng trong điều trị bao gồm: thuốc chống trầm cảm, các benzodiazepin và các chất chủ vận receptor 5-HT1A của serotonin [3], [14], [17]

 Các thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin (SSRI)

- Chỉ định: Các SSRI hiện là nhóm thuốc lựa chọn đầu tay trong nhiều thể lo âu bao

gồm: rối loạn ám ảnh cưỡng chế (fluvoxamin, paroxetin, sertralin và fluoxetin), rối loạn hoảng loạn (paroxetin và sertralin), rối loạn ám ảnh xã hội (paroxetin và sertralin), rối loạn stress sau chấn thương (paroxetin, sertralin và fluoxetin) do hoạt phổ giải lo âu rộng, khả năng dung nạp tương đối tốt cũng như ít các tác dụng không

mong muốn so với các nhóm thuốc khác

- Cơ chế: Ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin về bọc dự trữ ở tận cùng tế bào thần

kinh trước synap, làm tăng hoạt tính serotoninergic trung ương

- Thuốc sử dụng: fluoxetin, paroxetin, fluvoxamin, sertralin, citalopram,

escitalopram

 Các thuốc chống trầm cảm ba vòng

- Chỉ định: Các thuốc chống trầm cảm 3 vòng hiện được xếp vào nhóm thuốc lựa

chọn thay thế (second line) trong điều trị rối loạn lo âu toàn thể, rối loạn hoảng loạn

có ám sợ khoảng rộng và rối loạn ám ảnh cưỡng chế

- Cơ chế: Ức chế tái thu hồi serotonin và noradrenalin về bọc dự trữ ở tận cùng tế

bào thần kinh trước synap, làm tăng hoạt tính serotoninergic và noradrenergic trung

ương

- Thuốc sử dụng: imipramin, clomipramin, doxepin

 Các benzodiazepin (BZD)

- Chỉ định: Các BZD hiện là nhóm thuốc lựa chọn thay thế trong một số thể lo âu

như: rối loạn hoảng loạn (alprazolam và clonazepam), rối loạn ám sợ xã hội (clonazepam) Do tác dụng bất lợi trên nhóm bệnh nhân có rối loạn lo âu kèm theo trầm cảm hay nhóm bệnh nhân lạm dụng/nghiện rượu nên vị trí của BZD trong điều trị bị hạn chế hơn so với các SSRI Khác với SSRI và thuốc chống trầm cảm 3 vòng,

BZD khởi phát tác dụng rất nhanh, do đó thường được chỉ định phối hợp điều trị với

SSRI trong giai đoạn đầu

- Cơ chế: là chất chủ vận receptor benzodiazepin, làm tăng tần suất mở kênh Cl- qua trung gian GABA, Cl- vào tế bào, gây tăng ưu cực làm giảm dẫn truyền thần kinh

trung ương

- Thuốc sử dụng: diazepam, alprazolam, clonazepam

 Chất chủ vận từng phần receptor 5-HT 1A

- Chỉ định điều trị lo âu: Chỉ có hiệu quả trong điều trị rối loạn lo âu lan tỏa Do khởi

phát tác dụng chậm đồng thời không chắc chắn về hiệu quả chống tái phát khi dùng lâu dài nên buspiron được coi là thuốc lựa chọn thay thế

- Cơ chế: Kích thích từng phần trên receptor của serotonin (5- HT1A)

- Thuốc sử dụng: buspiron

1.2 Các test đánh giá lo âu và giải lo âu

Dựa vào tác nhân gây kích thích, các test đánh giá tác dụng giải lo âu được chia thành 2 nhóm chính là: các test có điều kiện và các test không điều kiện [18] (bảng 1.1)

1.2.1 Các test có điều kiện

Các test có điều kiện được chia thành hai phân nhóm chính như bảng 1.1 [18] Các hành vi được quan sát hoặc đánh giá liên quan đến các đáp ứng tự phát của động vật khi thay đổi môi trường có thể là tích cực hoặc tiêu cực Củng cố các hành vi tích cực, như được thưởng khi tiếp xúc với tác nhân kích thích, sẽ làm tăng khả năng đáp ứng với các kích thích này Mặt khác, khi thay phần thưởng bằng các tác nhân tiêu cực như sốc điện sẽ làm giảm khả năng đáp ứng với các kích thích này trong những thử nghiệm tiếp theo Các thuốc giải lo âu có tác dụng chống xung đột, tăng khả năng đáp ứng với các tác nhân tiêu cực [18] Một số test được sử dụng dựa trên cơ sở lý thuyết này như: test Geller-Seifter [32], test xung đột Vogel [73] Trong

đó test Vogel có lợi thế hơn khi không cần giai đoạn huấn luyện động vật thí nghiệm như test Geller-Seifter, tuy nhiên test Vogel lại đáp ứng với một số loại thuốc không

có tác dụng giải lo âu, gây ra kết quả dương tính giả Ngoài ra, cả 2 test đều bị ảnh

hưởng bởi các yếu tố như: đói, khát, đau, khả năng học tập và trí nhớ, gây khó khăn trong biện giải kết quả [18]

Một số phản xạ không có điều kiện hoặc cổ điển liên quan đến quá trình học nhớ, trong đó một kích thích liên tục có điều kiện trung tính (conditioned stimulus, CS) (như ánh sáng hoặc âm điệu - tone) được kết hợp với một kích thích không có điều kiện (unconditioned stimulus, US) (ví dụ: sốc điện bàn chân) Sau quá trình kết hợp lặp đi lặp lại, các kích thích có điều kiện (CS) đơn độc sẽ gây ra các đáp ứng tương tự như khi sử dụng kích thích không có điều kiện (US) [18] Một số test dựa trên nguyên lý này bao gồm: tăng phản xạ giật mình do sợ hãi (fear-potentiated startle, FPS), test ức chế phản xạ giật mình khi có tín hiệu báo trước (prepulse inhibition)

Bảng 1.1 Các test đánh giá tác dụng lo âu/giải lo âu

Các test xung đột có điều kiện

 Test Geller-Seifter

 Test xung đột Vogel

Các test khám phá

 Chữ thập nâng cao (EPM)

 Chữ T nâng cao (ETM)

 Test chữ O nâng cao (elevated zero maze, EZM)

 Môi trường mở (OFT)

 Test 2 ngăn sáng tối (light/dark box, LDB)

 Test bảng lỗ (hole-board test)

 Test tương tác xã hội (social interaction test)

Các test kinh điển

 Biểu hiện cảm xúc có điều kiện

1.2.2 Các test không có điều kiện

Các nghiên cứu về phản ứng không điều kiện (tự nhiên) dựa trên các dạng đáp ứng khác nhau với các mối đe dọa trong phòng thí nghiệm, mô phỏng những gì xảy

ra trong đời sống tự nhiên (sợ hãi/né tránh bẩm sinh) Cơ sở của hầu hết các test này

là các phản ứng hành vi gây ra do tiếp xúc với môi trường mới, đồng thời tạo ra sự

sợ hãi và tò mò tạo ra xung đột né tránh (avoidance) điển hình [18]

Nghiên cứu đầu tiên đánh giá hiện tượng này được thực hiện bằng cách sử dụng mê lộ chữ Y của Montgomery với một cánh tay kín và hai cánh tay hở Kết quả quan sát cho thấy chuột ưu tiên khám phá cánh tay kín hơn cánh tay hở, và việc né tránh cánh tay hở là do khả năng tạo ra sự sợ hãi của vùng hở [45]

Test mê lộ chữ thập nâng cao (EPM) là một trong các test phổ biến nhất được

sử dụng để đánh giá lo âu Test EPM dựa trên mâu thuẫn giữa xu hướng khám phá môi trường mới lạ, an toàn (đại diện bởi cánh tay kín) và né tránh các vị trí không được bảo vệ gợi lên sự sợ hãi bẩm sinh (độ cao và ánh sáng, đại diện bởi cánh tay hở) của động vật gặm nhấm Tiêu chí đánh giá chính được coi như chỉ số phản ánh mức

độ lo âu là mức độ khám phá cánh tay hở: thời gian lưu lại tay hở hoặc số lần đi vào tay hở Giảm mức độ khám phá cánh tay hở là dấu hiệu sinh lý của sự căng thẳng Một thuốc có tác dụng giải lo âu sẽ làm giảm sự sợ hãi với những khu vực cao và trống trải Bản năng thăm dò, thích khám phá với môi trường lạ được thể hiện qua số lần vào cánh tay hở và thời gian lưu lại cánh tay này cũng như số lần di chuyển từ tay kín sang tay hở [18], [20], [29], [41], [48], [56], [64], [67], [74] Tuy nhiên hoạt động của động vật ở test EPM còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: điều kiện môi trường sống, điều kiện phòng thí nghiệm, mức độ ánh sáng, chu kỳ sinh học cũng như việc tái phơi nhiễm với test Để phản ánh chính xác nhất mức độ lo âu thông qua test EPM, cần loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng bằng các thay đổi cải tiến test đi kèm hoặc sử dụng phối hợp các test đánh giá khác [20], [29], [62]

Test môi trường mở (OFT) cũng dựa trên xung đột giữa khám phá môi trường mới và né tránh các vị trí không an toàn (khu vực trung tâm) Test OFT đánh giá hoạt động tự nhiên, khả năng khám phá và tình trạng lo lắng của chuột khi được đặt vào

một môi trường mới khác biệt hoàn toàn môi trường sống bày đàn Sau nhiều nghiên cứu, mô hình OFT đã được cải tiến nhằm phù hợp với từng điều kiện thí nghiệm, phù hợp với mục đích của từng nghiên cứu Số đường kẻ chuột đi qua và số lần đứng lên bằng 2 chân là những tiêu chí giúp đánh giá khả năng hoạt động tự nhiên của chuột, khi các chỉ số này tăng lên cho thấy sự gia tăng về khả năng hoạt động tự nhiên của chuột Vùng trung tâm là vùng nằm chính giữa, có khoảng không gian xung quanh khác biệt với vùng viền ngoài giáp với các bức tường của mô hình Số lần vào trung tâm và thời gian lưu lại trung tâm là những tiêu chí giúp đánh giá khả năng khám phá

và tình trạng lo lắng của chuột, khi các chỉ số này tăng cho thấy sự gia tăng về khả năng khám phá và giảm tình trạng lo lắng của chuột khi tiếp xúc với môi trường mới Ngoài các tiêu chí quan sát như hoạt động ngắm vuốt (grooming), số lượng phân và nước tiểu chuột…cũng giúp đánh giá tình trạng lo lắng của chuột [19], [21], [36], [59], [60], [70], [75] Một số tác giả cũng sử dụng test OFT như một test đánh giá lo

âu đơn thuần, tuy nhiên phần này không đề cập đến hướng tiếp cận đó

1.3 Các mô hình gây lo âu

Khác với khái niệm “test”, khái niệm “mô hình” được sử dụng để mô tả một thiết lập thử nghiệm hoặc một protocol áp dụng trên một loài động vật với mục đích

mô phỏng các tính chất sinh lý bệnh cũng như hành vi ở con người [69] Tương tự như vậy, mô hình gây lo âu là mô hình động vật mà ở đó các cá thể thể hiện một kiểu hình hành vi liên quan đến rối loạn lo âu [28] Trong khi đó, khái niệm “test” đánh giá lo âu thường mô tả một thiết bị có thể quan sát, phân tích và đánh giá hành vi cũng như các phản ứng sinh lý của động vật khi được phơi nhiễm với chúng, ở một điều kiện nhất định trong phòng thí nghiệm [28] Các test bao gồm các biến phụ thuộc (các hành vi, phản ứng sinh ý ) [28], được xây dựng trên cơ sở tương đối đơn giản (test EPM dựa trên cơ sở chuột sợ độ cao để xác định mức độ ưu tiên giữa một môi trường tương đối an toàn thoải mái – đại diện bởi cánh tay kín, và một môi trường nguy hiểm hơn – đại diện bởi cánh tay hở) và giá trị của một test được công nhận bởi việc đáp ứng với các thuốc giải lo âu cổ điển [54] Trong khi, các mô hình ngoài các biến phụ thuộc còn bao gồm các biến độc lập (không phụ thuộc) như các can thiệp

bằng tay, các can thiệp phẫu thuật [28] Các mô hình được xây dựng trên nền tảng lý thuyết phức tạp, mô phỏng được sinh lý bệnh hoặc một kiểu hình nào đó [69], và có thể bao gồm nhiều test trong đó [28], [54], [69] Giá trị của một mô hình ngoài việc đáp ứng với các thuốc lo âu cổ điển (predictive validity) còn phụ thuộc vào nhiều yếu

tố khác như: biểu hiện tương tự các triệu chứng lâm sàng ở người (face validity), cơ chế sinh lý học tương tự ở người (construct validity)…[28], [72] Điều này giải thích tại sao mặc dù hiểu biết về đáp ứng sợ hãi cơ bản ở người được phát triển từ lâu, nhưng sinh lý học thần kinh của lo âu cũng như phát triển các phương pháp điều trị mới vẫn còn nhiều điểm hạn chế [28], [54]

Các mô hình gây lo âu hiện nay đã phát triển khá nhiều với những cơ chế gây

lo âu khác nhau [28] Tiêu chí phân nhóm lo âu cũng phụ thuộc vào quan điểm của mỗi tác giả Theo Cryan J.F và cộng sự [28], các mô hình gây lo âu có thể chia nhóm dựa trên các tác nhân gây lo âu như biến đổi gen, thay đổi môi trường sống cũng như

sử dụng các chất hóa học Tóm tắt các mô hình gây lo âu theo Cryan J.F và cộng sự [28] cùng một số mô hình cụ thể được trình bày chi tiết ở bảng 1.2 và các mục 1.3.1, 1.3.2 Ngoài ra một số mô hình gây lo âu được sử dụng khá nhiều nhưng chưa được đưa vào bảng phân loại, như mô hình cắt buồng trứng được trình bày chi tiết ở mục 2.2.5.1

1.3.1 Mô hình gây lo âu bằng phương pháp di truyền

Các mô hình gây lo âu bằng phương pháp di truyền được xây dựng trên cơ sở bệnh lý lo âu có liên quan tới yếu tố gen và di truyền, qua đó lựa chọn các động vật

có trạng thái lo âu bẩm sinh cao và tiến hành nhân giống chọn lọc để tạo ra các quần thể động vật lo âu Có 2 phương pháp xây dựng các quần thể động vật lo âu: một là tìm kiếm và lựa chọn các dòng chuột thuần chủng sẵn có thể hiện mức độ lo âu cao hơn các dòng chuột khác; hai là can thiệp phẫu thuật, điều chỉnh hoặc loại bỏ các gen liên quan để tạo ra các dòng chuột có mức độ lo âu cao Hai phương pháp này tương ứng với 2 phân nhóm: phân nhóm không có can thiệp (chọn lọc dòng thuần chủng)

và phân nhóm có can thiệp (biến đổi gen) Các mô hình gây lo âu bằng phương pháp chọn lọc dòng thuần chủng được phát triển từ khá sớm (năm 1938, Hall C.S bắt đầu

tiến hành các mô hình chuột thuần chủng liên quan đến cảm xúc [35]) trong khi các

mô hình gây lo âu bằng phương pháp can thiệp phẫu thuật mới được phát triển trong thời gian gần đây nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ Phương pháp chọn lọc dòng thuần chủng có nhiều ưu điểm do sự đa dạng của các chủng chuột cũng như chi phí thấp Tuy nhiên phương pháp này lại khó xác định cơ chế gây lo âu cũng như vấp phải trở ngại lớn khi có sự mâu thuẫn giữa kết quả nghiên cứu của các tác giả khác nhau khi đánh giá trên cùng một dòng chuột thuần chủng Ví dụ 2 dòng chuột được

sử dụng nhiều trong các nghiên cứu là C57BL/6 và BALB/c, trong nghiên cứu của Rogers cho thấy dòng BALB/c thể hiện mức độ lo âu thấp hơn so với dòng C57BL/c [65] tuy nhiên trong nghiên cứu của Avgustinovich lại cho thấy kết quả ngược lại [13] Một ví dụ khác khi so sánh 2 dòng là DBA/2 và C57BL/6, có nghiên cứu cho kết quả dòng DBA/2 thể hiện mức độ lo âu thấp hơn so với dòng C57BL/c (Trullas

và Skolnick, test EPM [71]), có nghiên cứu lại cho kết quả ngược lại (Rogers, test EPM [65]), và cũng có nghiên cứu cho kết quả không khác biệt giữa 2 dòng (Griebel, test EPM [33]) Chính vì vậy khi lựa chọn áp dụng các phương pháp này để xây dựng

mô hình gây lo âu cần đánh giá lại trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm Trong khi đó, các phương pháp can thiệp phẫu thuật chủ yếu tác động vào các gen liên quan đến các chất trung gian hóa học ảnh hưởng tới lo âu như GABA, 5-HT1A, catechol-O-methyl Do đó, ưu điểm lớn nhất của các phương pháp này là xác định được cơ chế gây lo âu rõ ràng, và có sự thống nhất giữa kết quả các nghiên cứu độc lập Ví dụ điển hình là mô hình gây lo âu “5-HT1A receptor KO” (mô hình sử dụng phương pháp loại bỏ gen receptor 5-HT1A), các tác giả đều có chung một kết quả là chuột tăng hành vi lo âu trên test OFT, EPM, EZM…[34], [37], [61] Tuy nhiên, chi phí cũng như đòi hỏi yêu cầu kĩ thuật cao dẫn tới khả năng áp dụng triển khai các mô hình này không được rộng rãi

Bảng 1.2 Các mô hình gây lo âu [28]

Phương pháp di truyền

Phương pháp lựa chọn dòng thuần chủng

Chủng BALB/c

Dòng chuột thuần chủng

Thể hiện trạng thái lo âu cao trên test OFT, LDB

Chủng BTBR T+tf/J

Tăng mức độ lo âu trên test EPM cũng như test tương tác xã hội (social interaction test)

Chuột cống chủng

(FH/Wjd)

Chủng FH/Wjd thể hiện mức độ thấp các hành vi xã hội ở cả môi trường lo âu và tự nhiên so với chủng Wistar hoặc chủng Sprague-Dawley

Phương pháp biến đổi gen

COMT Knock - out

Loại bỏ gen catechol-O-methyl transferase

Ở chuột cái, quan sát thấy tăng mức độ hành vi lo âu trên test LDB

Adra2a knock-out Loại bỏ gen receptor

GAT1 knock-out Loại bỏ gen GABA

transporter (GAT1) Tăng hành vi lo âu trên test OFT

CRH-BP knock-out

Loại bỏ gen corticotrophin-

binding protein

Tăng các hành vi lo âu trên test OFT, EPM và tăng các hành vi tự

vệ

Phương pháp thay đổi môi trường

tách mẹ từ nhỏ

Tăng các hành vi lo âu ở test EPM khi trưởng thành và đáp ứng thần kinh nội tiết cao với stress

Nuôi cô lập xã hội

Chuột được sống 1 mình từ lúc cai sữa (3 tuần tuổi) tới khi trưởng thành

Tăng các hành vi lo âu ở test EPM

và test nhận diện đồ vật (NOR), tăng hành vi trầm cảm và tăng mức độ gây hấn

Phương pháp sử dụng chất hóa học

Pentylenetetrazol

(PTZ)

Sử dụng PTZ-chất đối kháng GABAA

làm tác nhân gây lo

âu

Gây ra các tình trạng lo âu ở test EPM, các test xung đột cũng như tăng đáp ứng với các test sử dụng động vật

m-chlorophenylpiperazin

(mCPP)

Sử dụng mCPP-chất đối kháng serotonin không chọn lọc làm tác nhân gây lo âu

Tăng các hành vi lo âu ở test EPM, ETM, EZM, tương tác xã hội và Geller-Steifter test

1.3.3 Mô hình gây lo âu bằng phương pháp thay đổi môi trường sống và phương pháp sử dụng tác nhân hóa học

Các phương pháp thay đổi môi trường sống cụ thể như: phương pháp nuôi cô lập, phương pháp tách mẹ từ nhỏ (cai sữa sớm hoặc không) và các phương pháp thay đổi 1 phần yếu tố môi trường như tiếng ồn, thay đổi chu kỳ sáng/tối hoặc điều kiện sống trong 2-3 tuần Các phương pháp này dựa trên cơ sở mối liên quan giữa stress,

lo âu và trầm cảm Stress kéo dài là một trong các nguyên nhân dẫn tới lo âu và trầm cảm Dựa trên cơ sở mối liên quan với stress, nhiều tác giả phân chia các phương pháp trên thành các nhóm khác nhau Nitish Bhatia và cộng sự dựa vào tác nhân gây stress chia các phương pháp trên thành 3 nhóm chính: phương pháp gây stress cấp

tính (phơi nhiễm 1 lần duy nhất), phương pháp gây stress mạn tính (phơi nhiễm một thời gian dài) và phương pháp gây stress mạn tính biến đổi (lặp đi lặp lại các tác nhân gây stress khác nhau); trong khi đó nếu dựa vào các tác nhân gây stress, có thể chia các mô hình trên thành 3 nhóm: phương pháp gây stress vật lý (sử dụng các tác nhân vật lý như thay đổi nhiệt độ, sốc điện bàn chân…), phương pháp gây stress tâm lý (nuôi cô lập, thay đổi chu kỳ ngày đêm, tiếng ồn quá mức…) và các phương pháp gây stress mạn tính không đoán trước được (các phương pháp kết hợp cả tác nhân vật

lý và tâm lý một cách ngẫu nhiên) [53] Các phương pháp này có ưu điểm là dễ áp dụng, chi phí thấp cũng như các yêu cầu kĩ thuật không quá khắt khe, tuy nhiên cũng giống như các phương pháp lựa chọn dòng chuột thuần chủng, nhược điểm chính của các phương pháp này là khó khăn trong việc xác định cơ chế gây lo âu Mặc dù vậy,

so sánh chung với các phương pháp khác thì các phương pháp này dễ dàng triển khai hơn

Các phương pháp sử dụng tác nhân hóa học chủ yếu sử dụng các tác nhân như

PTZ (pentylenetetrazol), mCPP (m-chlorophenylpiperazin)….Tương tự như các

phương pháp can thiệp phẫu thuật gen, cơ sở chính của các phương pháp này là sử dụng các chất đối kháng với các chất trung gian hóa học liên quan tới lo âu hoặc thông qua các chất khác (CO2) gián tiếp làm thay đổi nồng độ các chất đó trong máu gây ra tình trạng lo âu bệnh lý ở chuột Tuy nhiên việc áp dụng các phương pháp này hiện nay vẫn còn nhiều hạn chế, chưa được nhắc tới nhiều trong các nghiên cứu liên quan tới mô hình gây lo âu trên động vật thực nghiệm

1.4 l-tetrahydropalmatin

1.4.1.Tác dụng giải lo âu

Theo Lê Doãn Trí và cộng sự, l-tetrahydropalmatin (l-THP) khi sử dụng liều đơn và liều lặp lại 5 ngày bằng đường uống tại các mức liều từ 0,1 mg/kg đến 1 mg/kg thể hiện tác dụng giải lo âu trên test chữ thập nâng cao tương tự chứng dương diazepam 2 mg/kg Tác dụng giải lo âu giảm dần trong khi tác dụng an thần tăng lên khi tăng dần liều (từ 3 mg/kg đến 100mg/kg) Tác dụng giải lo âu được xác định là tác dụng chống rối loạn hoảng sợ (test chữ T nâng cao) tương tự chất đối chiếu

clomipramin 25 mg/kg khi sử dụng liều lặp lại 21 ngày và tác dụng này không xuất hiện khi sử dụng liều đơn l-THP [8]

Tại các mức liều thể hiện tác dụng giải lo âu (0,1 mg/kg đến 1 mg/kg), l-tetrahydropalmatin không ảnh hưởng tới khả năng hoạt động tự nhiên, khả năng khám phá của chuột (test môi trường mở, OFT) đồng thời không thể hiện tác dụng an thần (test tăng cường thời gian do thiopental) Tại các mức liều này, l-tetrahydropalmatin thể hiện tác dụng chống trầm cảm (test bơi cưỡng bức, FST) tương tự chất đối chiếu clomipramin liều 25 mg/kg [8]

Các kết quả trên cũng phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố trước đó Nghiên cứu của Leung và cộng sự cho thấy, THP có tác dụng giải lo âu rõ rệt ở liều thấp (0,5 - 10 mg/kg) Trong khi, tác dụng an thần và giãn cơ chỉ thể hiện ở liều cao (50 mg/kg) Tác dụng giải lo âu của tetrahydropalmatin bị đối kháng bởi flumazenil, một chất cạnh tranh vị trí gắn của benzodiazepin trên receptor GABAA, chứng tỏ cơ chế giải lo âu của THP một phần thông qua tương tác với vị trí gắn của benzodiazepin trên receptor GABAA [47] Một nghiên cứu khác của Hong Xue và cộng sự đã cho thấy dl-THP thể hiện tác dụng giải lo âu rõ rệt ở các mức liều 0,1 mg/kg đến 50 mg/kg [79], và l-THP thể hiện tác dụng giải lo âu rõ rệt ở các mức liều từ 0,1 mg/kg đến 2,5 mg/kg Tác dụng an thần xuất hiện ở mức liều cao (5 mg/kg) [78], đồng thời cơ chế tác dụng có thể liên quan đến khả năng dl-THP và l-THP là những chất chủ vận tại

vị trí gắn benzodiazepin trên receptor GABAA [78], [79]

Các nghiên cứu ở trên chỉ đánh giá tác dụng của THP trên đối tượng chuột bình thường, không có biểu hiện bệnh lý rối loạn lo âu Trong khi đó, rối loạn lo âu là bệnh

lý có cơ chế phức tạp và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố nên việc sử dụng các mô hình chuột bình thường không mô phỏng được tình trạng thật sự của bệnh lý rối loạn

lo âu cũng như đáp ứng với l-THP của các đối tượng này, dẫn tới việc thiếu bằng chứng áp dụng trên lâm sàng

Năm 2013, Ceremega T E và cộng sự đã sử dụng mô hình gây rối loạn stress sau sang chấn (post-traumatic stress disorder, PTSD stress model) để đánh giá ảnh hưởng của THP lên mức độ biểu hiện gen (gene expression) Kết quả cho thấy THP

đã tác động lên một số vùng trên não như hồi hải mã (hippocampus), hạch hạnh nhân (amygdala) làm thay đổi mức độ biểu hiện của nhiều gen, trong đó có một số gen quy định tổng hợp các chất dẫn truyền liên quan tới lo âu như GABA, serotonin [22]

1.4.2.Các tác dụng dược lý hướng thần kinh và tâm thần khác

Ngoài tác dụng giải lo âu đang được nghiên cứu hiện nay, nhiều tác dụng dược

lý khác của tetrahydropalmatin (THP) đã được nghiên cứu

Tác dụng an thần và giảm đau của THP được chứng minh có liên quan tới hoạt tính đối kháng của thuốc trên hệ dopaminergic [25], [44] Trên mô hình tăng cường thời gian ngủ do thiopental, Phạm Duy Mai và cộng sự đã cho thấy gindarin hydrochlorid (l-tetrahydropalmatin hydrochlorid) ở mức liều 30 mg/kg kéo dài thời gian ngủ do thiopental lên 1,5 lần so với lô chứng [6] Tương tự, l-THP ở mức liều

40 mg/kg làm tăng thời gian ngủ do thiopental lên 8 lần so với nhóm chứng [10] Trong nghiên cứu của Lê Doãn Trí và cộng sự, ở mức liều thấp (từ 0,03 mg/kg đến 3 mg/kg) l-THP không thể hiện tác dụng an thần; tuy nhiên ở mức liều cao hơn (10 mg/kg và 100 mg/kg) l-THP thể hiện tác dụng an thần rõ rệt tương tự diazepam [8] Tác dụng giảm đau của l-THP thể hiện ở mức liều 30 mg/kg [11]

Về tác dụng ức chế thần kinh trung ương của dl-tetrahydropalmatin (THP), nghiên cứu của Nguyễn Tiễn Vững cho thấy l-THP có tác dụng tăng cường ức chế tế bào thần kinh ở vỏ bán cầu đại não và thể lưới thân não [10]

Trong khi, tác dụng hạ huyết áp động mạch và giảm nhịp tim liên quan tới quá trình giải phóng của hệ thần kinh serotonergic ở vùng dưới đồi [26] THP có tác dụng đối kháng receptor α1-adrenergic, chủ vận trên receptor α2-adrenergic và là chất điều hòa dị lập thể dương tính của receptor GABAA [76] THP đối kháng tác dụng hoạt hóa các receptor serotonin, noradrenalin và dopamin do cocain gây ra Tác dụng trên receptor 5-HT1A và α-adrenergic giúp giảm nhẹ tác dụng ngoại tháp do đối kháng dopamin [50] THP có tác dụng giảm các triệu chứng trong quá trình cai nghiện cocain và heroin ở chuột cống [50], [80], làm giảm sự thèm muốn và tình trạng tái nghiện trong quá trình cai nghiện heroin [77] THP ức chế sự phụ thuộc tâm thần gây

ra bởi oxycodon thông qua ảnh hưởng tới sự phosphoryl hóa CREB (cyclic-AMP

response element-binding protein) và ERK (Extracellular signal-regulated kinases) ở nhân vòng và hồi hải mã (hippocampus) ở chuột cống [49]

Về ảnh hưởng trên hoạt động tự nhiên, Kai Yue và cộng sự đã cho thấy l-THP

ở mức liều 5 mg/kg làm giảm rõ rệt khả năng hoạt động trên chuột cống, trong khi các mức liều thấp hơn không cho thấy ảnh hưởng này [80] Nghiên cứu của Hong Xue và cộng sự cho thấy mức liều làm giảm hoạt động tự nhiên của dl-THP và l-THP tương ứng là: từ 0,1 mg/kg đến 100 mg/kg và từ 5 mg/kg đến 40 mg/kg [78], [79] Nghiên cứu của Lê Doãn Trí và cộng sự cho thấy l-THP ở các mức liều giải lo âu (từ 0,1 mg/kg đến 1 mg/kg) không ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên của chuột cả khi sử dụng liều đơn và sử dụng liều lặp lại 5 ngày [8]

Ứng dụng trong điều trị, l-tetrahydropalmatin từ lâu đã được sử dụng để điều trị một số rối loạn bệnh lý tâm thần và thần kinh Tại Trung Quốc, hiệu quả của l-THP như một thuốc giảm đau không opioid, một hoạt chất an thần/giải lo âu, hỗ trợ điều trị cai nghiện dẫn đến sự phê duyệt trong chỉ định điều trị các bệnh lý tương ứng cho thuốc [76] Tại Việt Nam, nhiều sản phẩm chứa THP lưu hành trên thị trường với các biệt dược: Rotundin, Rotundin 30, Rotunda đã được sử dụng với chỉ định điều trị

an thần gây ngủ, giảm đau, hỗ trợ điều trị cai nghiện

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

l - tetrahydropalmatin (l-THP) đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm với hàm lượng 98,4%, được cung cấp bởi công ty Cổ Phần Dược phẩm Tâm Hiếu Đức Mẫu

l - tetrahydropalmatin được kiểm nghiệm tại phòng kiểm tra chất lượng, công ty cổ phần dược phẩm Traphaco theo tiêu chuẩn cơ sở CP 1998

Máy nghiền bi siêu mịn Retsch mm20 sản xuất bởi hãng Retsch GmbH & Co

RG của Đức, bộ môn Bào Chế, trường Đại học Dược Hà Nội

Bơm, kim tiêm nhựa, đồng hồ bấm giây, nhiệt kế, bóng đèn 60W, đèn bàn, cân phân tích, cân kỹ thuật

Cốc có mỏ 100, 250 ml, bình định mức 10, 20, 25, 50 và 100 ml, chày, cối, micropipet 1 ÷ 5 ml và một số dụng cụ dùng trong chăn nuôi và pha chế của bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.3 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng giống đực, chủng Swiss albino khỏe mạnh, 2 tuần tuổi, khối

lượng 13 - 15 g do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp

Chuột cống trắng giống cái, chủng Wistar khỏe mạnh, 5-7 tuần tuổi, khối lượng

100 - 120g do Học viện Quân Y cung cấp

Động vật được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 24 ± 1oC, ánh sáng tự nhiên, được nuôi bằng thức ăn chuẩn, uống nước tự do, chu kỳ sáng/tối 12 giờ

2.1.4 Chuẩn bị thuốc thử

Thuốc thử được sử dụng dưới dạng hỗn dịch: diazepam, l-tetrahydropalmatin được phân tán đồng nhất trong Tween 80 1% để đạt được nồng độ mong muốn Tất

cả các thuốc đều được sử dụng theo đường uống

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế thành 3 đợt thí nghiệm với các nội dung sau đây: Đợt 1: Thí nghiệm trên chuột cống trắng, đánh giá mức độ gây lo âu thực nghiệm của mô hình cắt buồng trứng sử dụng test EPM và test OFT

Đợt 2: Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng, đánh giá khả năng gây lo âu thực nghiệm của mô hình nuôi cô lập sử dụng test EPM và test OFT

Mô hình phù hợp

Nuôi cô lập Cắt buồng trứng

Đánh giá ảnh hưởng trên hoạt động tự nhiên của chuột, test môi trường

Đánh giá anh hưởng trên hoạt động tự nhiên của chuột, test môi trường

mở (OFT)

Đợt 3: Áp dụng mô hình có khả năng gây lo âu thực nghiệm trên động vật từ 2

mô hình trên Đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP trên mô hình đã chọn sử dụng test EPM và test OFT

2.2.3 Điều kiện tiến hành thí nghiệm

Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành trong phòng riêng biệt, yên tĩnh tại khu chăn nuôi động vật thí nghiệm của trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian tiến hành thí nghiệm trong khoảng từ 8h-17h Với test EPM và test OFT, cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì bằng 1 hoặc 2 bóng đèn 60W

2.2.4 Liều lượng sử dụng trong nghiên cứu

Mức liều sử dụng trong nghiên cứu đánh giá tác dụng giải lo âu trên chuột lo âu (đợt 3) của l-THP là 0,3 mg/kg và 1,0 mg/kg tính theo trọng lượng cơ thể chuột Đây

là 2 mức liều đã được chứng minh có tác dụng giải lo âu trên đối tượng chuột bình thường [8] Mức liều của chứng dương diazepam được sử dụng trong nghiên cứu là

2 mg/kg thể trọng chuột theo Dương Phước An và cộng sự [1] Mức liều này phù hợp theo mức liều của diazepam dùng trên người để điều trị lo âu trên người trưởng thành dùng đường uống ( 4 - 15 mg/ngày) [4] Các thuốc thử được phân tán trong Tween80 1% để tạo hỗn dịch cho chuột uống

2.2.5 Thiết kế nghiên cứu

và xylazin (tiêm phúc mạc, liều 5 mg/kg) Cạo bỏ phần lông tại vị trí phẫu thuật (vị trí ngang lưng chuột ở 2 bên trái, phải tính từ đốt sống thứ 4) và sát trùng bằng povidon iot (povidine) Tách dần lớp mô cơ, mô mỡ và bộc lộ buồng trứng ra ngoài Dùng chỉ thắt chặt quanh ống dẫn trứng (bao gồm các mạch máu), cắt bỏ phần buồng

trứng và ống dẫn trứng ở sau nút buộc Đặt lại buồng trứng vào trong cơ thể, khâu vết

mổ bằng chỉ vô trùng và sát trùng vết thương bằng dung dịch povidon iot (povidine)

Lô cắt buồng trứng giả (Sham) được tiến hành tương tự lô OVX, tuy nhiên thay vì buộc chặt và cắt bỏ thì buồng trứng chỉ cần kéo nhẹ ra và khâu trờ lại ngay Tiêm thuốc giảm đau sau đó đặt nhẹ nhàng động vật tại nơi ấm áp, chăm sóc cẩn thận sau phẫu thuật Tiến hành đánh giá mức độ gây lo âu thực nghiệm của mô hình cắt buồng trứng bằng test EPM và test OFT tại các thời điểm khác nhau (tuần 3, tuần7 và tuần

12 sau khi cắt buồng trứng) Thí nghiệm được thực hiện theo sơ đồ sau (hình 2.2)

Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm đợt 1

2.2.5.2 Mô hình nuôi cô lập

Mô hình gây lo âu bằng phương pháp nuôi cô lập (mô hình nuôi cô lập) được triển khai theo mô tả của Ojima và cộng sự [55]

Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh 2 tuần tuổi, được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm 2 tuần trước khi nuôi cô lập và được chia ngẫu nhiên thành 2

lô (mỗi lô 10 con): lô chứng nuôi bầy đàn và lô nuôi cô lập Trong đó lô bầy đàn nuôi

5 con/lồng và lô cô lập nuôi 1 con/lồng Sau 5 tuần nuôi cô lập, tiến hành đánh giá khả năng gây lo âu thực nghiệm của mô hình bằng test EPM và test OFT Thí nghiệm được thực hiện theo sơ đồ sau ( hình 2.3)

-3