của chuột
Tại thời điểm 5 tuần sau khi nuôi cô lập, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của mô hình tới hoạt động tự nhiên và khả năng khám phá của chuột bằng test OFT. Kết quả thu được trên số đường kẻ đi qua (linescore), số lần đứng lên bằng 2 chân sau của chuột (rearing), số lần vào trung tâm (SLTT) và thời gian ở trung tâm (TGTT) của các lô chuột thí nghiệm ở test OFT được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của mô hình nuôi cô lập trên các chỉ tiêu đánh giá của test môi trường mở (OFT)
Chỉ tiêu Bầy đàn1 Cô lập2 p1-2
Số dòng kẻ chuột đi qua (linescore) 70
(63;134)
112
(82;119) 0,606
Số lần chuột đừng lên bằng 2 chân sau (rearing)
18 (6;19)
19
(14,5 ; 29,5) 0,470
Số lần chuột đi vào trung tâm 5
(3;7)
4
(1,5 ; 6) 0,758
Thời gian chuột lưu lại trung tâm (giây) 14
(9;16)
14
(2,5 ; 37) 1,000
p so sánh với lô chứng nuôi bầy đàn (n = 10 con/lô) Nhận xét: Mô hình nuôi cô lập không ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên, không làm thay đổi số đường kẻ chuột đi qua (linescore) và số lần đứng lên bằng 2 chân (rearing) của chuột so với nhóm chứng nuôi bầy đàn. Tương tự như vậy, khả năng khám phá của chuột cũng không bị ảnh hưởng, không làm thay đổi số lần đi vào trung tâm (SLTT) và thời gian lưu lại tại trung tâm (TGTT).
3.3. Áp dụng mô hình gây lo âu phù hợp để đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP
Như vậy, 2 mô hình gây lo âu thực nghiệm là mô hình cắt buồng trứng và mô hình nuôi cô lập cho kết quả như sau:
Mô hình cắt buồng trứng không làm thay đổi có ý nghĩa thời gian lưu lại
tay hở và số lần đi vào tay hở, làm giảm có ý nghĩa tổng số đường kẻ chuột đi qua.
Mô hình nuôi cô lập làm giảm có ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở, số lần
đi vào tay hở, và không làm thay đổi tổng số đường kẻ đi qua và số lần đứng lên bằng hai chân sau của chuột.
Theo kết quả trên, mô hình nuôi cô lập đã đáp ứng được 2 tiêu chí ban đầu: gây ra trạng thái lo âu rõ rệt và không ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên của chuột. Chúng tôi quyết định áp dụng mô hình này để gây lo âu thực nghiệm và tiến hành nghiên cứu bước tiếp theo: đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP trên chuột gây lo âu thực nghiệm.
3.3.1. Đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP trên chuột đã được gây lo âu
Trên các mức liều đã được chứng minh trước đó có tác dụng giải lo âu ở chuột bình thường (liều 0,3 mg/kg và 1 mg/kg) thực hiện đánh giá tác dụng giải lo âu khi sử dụng liều lặp lại 5 ngày bằng test EPM. Kết quả thu được trên thời gian lưu lại tay hở, số lần đi vào tay hở và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín của các lô chuột thí nghiệm ở test EPM được trình bày trong hình 3.6 và hình 3.7.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.6. Tác dụng của diazepam (DZP) và l-THP trên thời gian lưu lại tay hở ở chuột gây lo âu bằng nuôi cô lập
* p < 0,05 ** p < 0,01 so với lô chứng nuôi cô lập ( n = 10 con/lô) DZP: lô chứng dương uống diazepam 2mg/kg Ro0.3: lô uống l- tetrahydropalmatin 0,3 mg/kg Ro1.0: lô uống l- tetrahydropalmatin 1,0 mg/kg Nhận xét: Sau khi sử dụng lặp lại 5 ngày, chứng dương dizepam liều 2mg/kg làm tăng có ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở so với lô chứng (lô nuôi cô lập). Tương tự như vậy, l-THP ở các mức liều 0,3 mg/kg và 1,0 mg/kg cũng làm tăng có ý nghĩa chỉ tiêu này (p < 0,05) khi so với lô chứng cô lập uống dung môi pha thuốc chứa 1% Tween 80.
Hình 3.7. Tác dụng của diazepam (DZP) và l-THP trên số lần đi vào tay hở và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín ở chuột gây lo âu bằng nuôi cô lập
* p < 0,05 so với lô chứng nuôi cô lập (n = 10 con/lô) DZP: lô chứng dương uống diazepam 2 mg/kg Ro0.3: lô uống l- tetrahydropalmatin 0,3 mg/kg Ro1.0: lô uống l- tetrahydropalmatin 1,0 mg/kg Nhận xét: Sau khi sử dụng lặp lại 5 ngày, chứng dương dizepam liều 2mg/kg làm tăng có ý nghĩa số lần đi vào tay hở so với lô chứng (lô nuôi cô lập). Tương tự như vậy, l-THP ở các mức liều 0,3 mg/kg và 1,0 mg/kg cũng làm tăng có ý nghĩa chỉ tiêu này (p < 0,05) khi so với lô chứng. Trên chỉ tiêu tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín, l-THP 0,3 mg/kg làm tăng có ý nghĩa thống kê, trong khi DZP và l-THP 1 mg/kg không có sự khác biệt so với nhóm chứng nuôi cô lập uống dung môi pha thuốc chứa 1% Tween 80.
3.3.3. Ảnh hưởng của l-THP tới hoạt động tự nhiên và khám phá ở chuột đã được gây lo âu
Tại thời điểm 5 ngày sau khi uống thuốc, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của l- THP tới hoạt động tự nhiên và khả năng khám phá của chuột bằng test OFT. Kết quả thu được trên số đường kẻ đi qua (linescore), số lần đứng lên bằng 2 chân sau của chuột (rearing), số lần vào trung tâm (SLTT) và thời gian ở trung tâm (TGTT) của các lô chuột thí nghiệm ở test OFT được trình bày trong bảng 3.3.
Nhận xét: Sử dụng lặp lại 5 ngày dizepam liều 2 mg/kg và l-THP các mức liều 0,3 mg/kg và 1 mg/kg không ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên, không làm thay đổi số đường kẻ chuột đi qua (linescore). Trong đó, dizepam làm giảm có ý nghĩa số lần đứng lên bằng 2 chân (rearing) của chuột so với nhóm chứng nuôi cô lập uống nước muối sinh lý chứa 1% Tween 80. Số lần đi vào trung tâm (SLTT) và thời gian lưu lại tại trung tâm(TGTT) của các lô không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng nuôi cô lập uống dung môi pha thuốc chứa 1% Tween 80.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của l-THP ở mô hình nuôi cô lập trên các chỉ tiêu đánh giá của test môi trường mở (OFT)
Chỉ tiêu Chứng nuôi cô lập1 Chứng dương2 Ro 0,33 Ro 1,04 p Số dòng kẻ chuột đi qua (linescore) 112 (82;119) 105 (56 ; 121) 109 (47,5 ; 126,5) 120 (95 ; 147) p1-2 = 0,601 p1-3 = 0,596 p1-4 = 0,470 Số lần chuột đứng lên bằng 2 chân sau (rearing) 19 (14,5 ; 29,5) 3 (1 ; 11) 17 (9,5 ; 22) 29 (18 ; 34) p1-2 = 0,01 p1-3 = 0,425 p1-4 = 0,299 Số lần chuột
đi vào trung tâm 4 (1,5 ; 6) 3,5 (3 ; 6) 8 (3,5 ; 11) 10 (7 ; 10) p1-2 = 0,887 p1-3 = 0,151 p1-4 = 0,055 Thời gian
chuột lưu lại
trung tâm (giây) 14 (2,5 ; 37) 8,5 (5 ; 48) 24 (15,5 ; 43) 25 (15 ; 37) p1-2 = 0,475 p1-3 = 0,375 p1-4 = 0,408 n = 10 con/lô) Chứng dương: lô uống diazepam 2 mg/kg Ro0.3: lô uống l- tetrahydropalmatin 0,3 mg/kg Ro1.0: lô uống l- tetrahydropalmatin 1,0 mg/kg
3.4. Bàn luận
Giải lo âu là tác dụng dược lý thần kinh quan trọng được nhiều nghiên cứu tập trung tiếp cận nhằm tìm nguồn dược liệu và hoạt chất chiết xuất từ dược liệu có hiệu quả, ít tác dụng không mong muốn, thay thế hoặc bổ sung cho các thuốc hóa dược đang được sử dụng trong điều trị [81]. Các nghiên cứu trước đây về các tác dụng dược lý của l-THP chủ yếu tập trung vào các tác dụng như an thần, giảm đau, hỗ trợ cai nghiện. Gần đây, một số nghiên cứu thực hiện đánh giá tác dụng giải lo âu cũng như một số tác dụng dược lý hướng thần kinh khác của l-THP, tuy nhiên các nghiên cứu này chỉ dừng lại trên các đối tượng chuột bình thường. Trên cơ sở đó, nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá và khẳng định hiệu quả các mô hình gây lo âu thực nghiệm đồng thời đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP trên các mô hình trên.
3.4.1. Kết quả gây lo âu trên 2 mô hình: mô hình cắt buồng trứng và mô hình nuôi cô lập
Hai mô hình trên được triển khai dựa trên những nguyên tắc khác nhau. Mô hình cắt buồng trứng được xây dựng nhằm mô phỏng tình trạng mãn kinh ở phụ nữ, dựa trên cơ sở một số nghiên cứu trước đó cho thấy phụ nữ ở thời kỳ này có mức độ lo âu cao hơn các thời kỳ khác. Mô hình được thực hiện bằng cách phẫu thuật cắt bỏ hai bên buồng trứng ở chuột cái trưởng thành, gây ra sự suy giảm đột ngột nồng độ 2 hormon sinh dục là estrogen và progesteron, dẫn tới thay đổi sinh lý cũng như hành vi của chuột. Điều này có thể liên quan tới vai trò của estrogen và progesteron trong việc điều hòa các chất trung gian hóa học như GABA, noradrenalin. Hormon progesteron thông qua chất chuyển hóa của nó là allopregnanolon, gây ra tác dụng tương tự một chất giải lo âu bằng cơ chế kích thích receptor GABA/benzodiazepin [15], [27], [57]. Sự thiếu hụt hormon này dẫn tới giảm hoạt động của hệ GABAergic qua đó làm tăng mức độ lo âu. Trong khi đó, vai trò của estrogen còn gây nhiều tranh cãi do có sự mâu thuẫn giữa các nghiên cứu. Có nghiên cứu cho thấy hormon này có thể làm tăng đáp ứng lo âu và sợ hãi, làm giảm tác dụng giải lo âu của diazepam [57]. Ngược lại, một số nghiên cứu khác cho rằng hormon này làm giảm các hành vi lo âu trên test OFT và thể hiện tác dụng giải lo âu trên một
vài test đánh giá lo âu. Ngoài ra, estrogen dường như là chất trung gian, ảnh hưởng tới hành vi thông qua kích thích enzym trytophan hydroxylase (enzym hạn chế tốc độ
tổng hợp serotonin) và điều hòa mức độ biểu hiện receptor 5-HT1A [57]. Mô hình cắt
buồng trứng đã được nhiều tác giả trên thế giới sử dụng để đánh giá tác dụng giải lo âu của các hoạt chất mới. Tuy nhiên, kết quả về khả năng gây lo của mô hình giữa các nghiên cứu này còn chưa thống nhất [23], [24], [31], [38], [39]. Tại Việt Nam, chưa có tác giả nào triển khai mô hình này với mục đích đánh giá tác dụng giải lo âu. Trong khi đó, mô hình nuôi cô lập đã được xây dựng ở Nhật bởi Ojima và cộng sự từ năm 1995 nhằm mô phỏng trạng thái stress, dựa trên cơ sở ảnh hưởng của stress với những thay đổi về sinh lý thần kinh đến tác dụng của các thuốc tác dụng trên thần kinh trung ương như an thần, gây ngủ [55]. Mô hình được thực hiện bằng cách nuôi cô lập chuột từ nhỏ, sau một thời gian dẫn tới thay đổi sinh lý cũng như hành vi. Sự thay đổi này của chuột chịu stress có thể liên quan đến hoạt hóa hệ noradrenalin trung ương và yếu tố giải phóng corticotrophin (CRF) ở vùng dưới đồi [55] hay giảm khả năng điều biến của GABA trong việc mở kênh Cl- [68], gây ra trạng thái lo âu ở chuột. Tại Nhật, đã có nhiều nghiên cứu sử dụng mô hình nuôi cô lập để đánh giá tác dụng an thần của các dược liệu như nghiên cứu của Matsumoto K. và cộng sự, Saito K. và cộng sự [51], [52], [55]. Mô hình này được Korte và cộng sự đánh giá có nhiều ưu điểm hơn so với mô hình kinh điển trên chuột bình thường không chịu stress, cho phép đánh giá hành vi tăng cường sợ hãi, tăng cường tình trạng lo âu đã được tạo ra trước đó trên động vật thực nghiệm bởi tác nhân gây stress, phản ánh cảm xúc bất an của động vật khi đứng trước mối đe dọa hoặc nguy hiểm [46]. Ở Việt Nam, mô hình nuôi cô lập được một số tác giả bước đầu triển khai trong nghiên cứu của mình để chứng minh tác dụng chống stress hoặc chống trầm cảm [42], [43]. Một số nghiên cứu khác sử dụng mô hình này nhằm mục đích đánh giá tác dụng an thần, giải lo âu, tuy nhiên các nghiên cứu này còn nhiều hạn chế và mới dừng lại ở việc đánh giá tác dụng của cao chiết dược liệu [2], [7].
Khả năng gây lo âu và ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên của chuột giữa hai mô hình cũng có sự khác nhau.
Về khả năng gây lo âu, trên mô hình cắt buồng trứng, chuột cắt buồng trứng bước đầu thể hiện xu hướng thay đổi trạng thái lo âu so với chuột ở nhóm cắt buồng trứng giả (chứng so sánh) tại từng thời điểm đánh giá (tuần 3, tuần 7, tuần 12) cũng như trong toàn bộ quá trình nghiên cứu, thông qua hai chỉ tiêu chính đánh giá mức độ lo âu là thời gian lưu lại tay hở (hình 3.1) và số lần đi vào tay hở của chuột (hình 3.2). Tuy nhiên sự khác biệt này vẫn chưa đạt mức có ý nghĩa như kết quả của một số nghiên cứu đã được công bố trên thế giới [16], [24], [31], [38], [39], [57]. Trong khi đó ở mô hình nuôi cô lập, nhóm chuột nuôi cô lập thể hiện trạng thái lo âu rõ rệt hơn nhóm chuột nuôi bầy đàn (chứng so sánh), làm giảm rõ rệt thời gian lưu lại tay hở (p = 0,012) (hình 3.4) cũng như số lần đi vào tay hở (p = 0,016) (hình 3.5) của chuột. Một số nghiên cứu trước đó cũng cho kết quả tương tự [2], [7]. Qua đó có thể thấy mô hình nuôi cô lập bước đầu phù hợp với mục gây ra trạng thái lo âu bệnh lý trên chuột thí nghiệm.
Có nhiều nguyên nhân có thể dẫn tới sự khác nhau về kết quả của mô hình cắt buồng trứng giữa nghiên cứu của chúng tôi với kết quả một số nghiên cứu đã công bố trên thế giới. Sự khác biệt này không đến từ phương pháp nghiên cứu cũng như thời điểm đánh giá lo âu (hầu hết các nghiên cứu đều đánh giá tại thời điểm 7 tuần sau khi cắt buồng trứng – trong đó bao gồm 3 tuần uống thuốc) mà có thể do sự khác nhau giữa các test đánh giá lo âu, cách đánh giá hiệu quả mô hình và đặc biệt là ảnh hưởng của hoạt động tự nhiên tới chuột cắt buồng trứng. Các test có thể sử dụng như test burying [31], test learned helplessness [39]…Mặc dù đều là các test không có điều kiện giống như test EPM mà nhóm nghiên cứu sử dụng, tuy nhiên cơ chế cũng như độ nhạy để phân biệt mức độ lo âu của các test này có sự khác nhau. Một nghiên cứu khác đánh giá hiệu quả mô hình bằng cách chia nhóm chuột cắt buồng trứng (OVX) thành 2 nhóm: nhóm có mức độ lo âu cao (high anxiety, HA) và nhóm có mức độ lo âu thấp (low anxiety, LA), dựa vào giá trị trung vị của thời gian lưu lại tay hở [40]. Nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành áp dụng phương pháp như trên tại tuần 7,
chia chuột cắt buồng trứng thành 2 nhóm: nhóm có mức độ lo âu cao, HA (n = 10) và nhóm có mức độ lo âu thấp, LA (n = 9). So sánh lần lượt 2 nhóm trên với nhóm chứng (lô cắt buồng trứng giả, Sham). Kết quả thu được cho thấy, nhóm chuột HA thể hiện lo âu rõ rệt, thông qua giảm rõ rệt thời gian lưu lại tay hở (p = 0.004) và số lần đi vào tay hở (p = 0,005) so với nhóm chứng (Sham). Trong khi đó, nhóm LA lại không có sự khác biệt ở cả thời gian lưu lại tay hở (p = 0,310) và số lần đi vào tay hở (p = 0,315) so với nhóm chứng. Như vậy, mô hình cắt buồng trứng có thể gây bệnh lý lo âu ở một tỷ lệ chuột nhất định. Nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá hiệu quả mô hình tại 3 thời điểm khác nhau (3, 7, 12 tuần sau khi cắt buồng trứng) nhằm tìm kiếm thời điểm thích hợp có thể gây ra trạng thái lo âu của chuột và xem xét, liệu rằng thời gian có phải yếu tố có thể ảnh hưởng tới điều này? Mặc dù kết quả cho thấy, thời gian thật sự có ảnh hưởng, làm giảm hai chỉ tiêu thời gian lưu lại tay hở (p = 0,026) và số lần lưu lại tay hở (p = 0,002) theo từng thời điểm đánh giá, nhưng giữa hai lô (lô cắt buồng trứng - OVX, và lô chứng - Sham) lại chưa có sự khác biệt có ý nghĩa (hình 3.1, hình 3.2). So sánh với các nghiên cứu khác, hầu hết đều thống nhất thời gian 7 tuần là khoảng thời gian phù hợp để gây ra được trạng thái lo âu ở chuột. Tuy nhiên cũng có nghiên cứu cho thấy, muốn làm giảm có ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở của toàn bộ lô cắt buồng trứng, cần thời gian là 15 tháng [23]. Một lý do khác cũng nên được xem xét là việc sử dụng lặp lại test EPM trên cùng một đối tượng chuột có thể ảnh hưởng tới khả năng học nhớ của chuột, qua đó làm giảm thời gian lưu lại tay hở.
Về ảnh hưởng trên hoạt động tự nhiên, đối với các nghiên cứu về lo âu cũng như test EPM, hoạt động tự nhiên của chuột có liên quan tới mức độ lo âu của chuột,