CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.6. Các test đánh giá lo âu, giải lo âu trong nghiên cứu
2.2.6.1. Test chữ thập nâng cao (EPM)
Test chữ thập nâng cao theo mô tả của Pellow [56].
Dụng cụ thí nghiệm
Dụng cụ bằng gỗ bao gồm 2 tay kín kích thước 50 x 12 x 40cm (dài x rộng x cao), 2 tay hở kích thước 50 x 12 x 1 cm, 2 tay kín và mở đặt vuông góc với nhau và đặt cách nền nhà 50 cm tạo thành hình chữ thập (hình 2.5), cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì bằng hai bóng đèn 60W.
Phương pháp tiến hành
Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô. Trong các ngày làm thí nghiệm, chuột được đặt nhẹ nhàng vào vùng trung tâm, mặt hướng về cánh tay hở, sau đó chuột được tự do di chuyển khám phá trong 5 phút. Sử dụng camera ghi nhận các hoạt động của chuột. Sau khi tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng khăn tẩm cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi. Kết quả được ghi nhận dựa trên phân tích video sau thí nghiệm.
Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian lưu lại tay hở, số lần vào tay hở, và/hoặc tay kín của chuột. Trong đó, chuột được coi là ở trong 1 cánh tay khi cả 4 chân đều nằm trong cánh tay đó.
Chuột được coi là thể hiện lo âu khi giảm có ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở hoặc số lần đi vào tay hở và không ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên so với lô chứng.
Hình 2.5. Test chữ thập nâng cao
2.2.6.2. Test môi trường mở (OFT)
Test môi trường mở (open field test, OFT) theo mô tả của Todd [70].
Dụng cụ thí nghiệm
Cho chuột nhắt: Dụng cụ bằng gỗ, hình hộp vuông, bên trong có ốp hợp kim nhôm nhựa (aluminium) màu xám kích thước 60 x 60 x 40 cm (dài x rộng x cao) bên trong sàn phân thành 16 ô vuông nhỏ bằng nhau (4 x 4) và tương ứng với 2 vùng là vùng trung tâm (4 ô nằm giữa) và vùng viền ngoài (12 ô ngoài còn lại) (hình 2.6), cường độ ánh sáng làm thí nghiệm duy trì bằng bóng đèn 60W.
Cho chuột cống: Dụng cụ bằng nhôm, hình hộp vuông, bên trong có ốp hợp kim nhôm nhựa (aluminium) màu xám kích thước 100 x 100 x 60 cm (dài x rộng x cao) bên trong sàn phân thành 16 ô vuông nhỏ bằng nhau (4 x 4) và tương ứng với 2 vùng là vùng trung tâm (4 ô nằm giữa) và vùng viền ngoài (12 ô ngoài còn lại) (hình 2.7), cường độ ánh sáng làm thí nghiệm duy trì bằng bóng đèn 60W.
Phương pháp tiến hành
Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô. Trong các ngày làm thí nghiệm, chuột được đặt nhẹ nhàng vào chính giữa vùng trung tâm hướng về phía 1 cạnh của môi trường mở, sau đó chuột được tự do di chuyển khám phá trong 5 phút. Sử dụng camera
ghi nhận các hoạt động của chuột. Sau khi tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng khăn tẩm cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi. Kết quả được ghi nhận dựa trên phân tích video sau thí nghiệm.
Chỉ tiêu đánh giá:
Trên hoạt động tự nhiên: Số đường kẻ đi qua (linescore), số lần đứng lên
bằng 2 chân sau của chuột (rearing).
Trên khả năng khám phá: Số lần vào trung tâm (SLTT), thời gian ở trung
tâm (TGTT).
Trong đó: chuột được coi là đi qua 1 đường kẻ hay vào vùng trung tâm
khi cả 4 chân của chuột đã đi qua đường kẻ đó và vào vùng trung tâm; chuột được tính là 1 lần đứng lên bằng 2 chân sau khi chuột chuyển từ trạng thái đứng bằng 4 chân sang đứng bằng 2 chân sau (2 chân trước có thể chạm thành hoặc là không).
Chuột được coi là không bị ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên khi không tăng/giảm có ý nghĩa tới các chỉ tiêu đánh giá của mô hình.
Hình 2.7. Test môi trường mở cho chuột cống
2.3. Xử lý số liệu
Dữ liệu được lưu trữ, phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0.
Qua phân tích kiểm chuẩn Kolmogorow- Smirnow cho thấy dữ liệu đều không tuân theo phân bố chuẩn. Kết quả được biểu diễn dưới dạng m(a;b) trong đó m là trung vị, a và b lần lượt là 2 khoảng tứ phân vị 25% và 75%. Sử dụng test phi tham số Kruskal – Wallis, sau đó là Mann – Whitney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô. Đối với các mẫu đo có sự lặp lại theo thời gian, sử dụng phân tích two – way ANOVA với phép đo lặp lại (repeated measures) để đánh giá ảnh hưởng của thời gian trên các tiêu chí. Sự khác biệt được coi có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Đánh giá khả năng gây lo âu thực nghiệm trên mô hình cắt buồng trứng
3.1.1. Đánh giá mức độ gây lo âu theo thời gian sử dụng test EPM
Tại thời điểm 3, 7, 12 tuần sau khi cắt buồng trứng, tiến hành đánh giá mức độ gây lo âu của mô hình bằng test EPM. Kết quả thu được trên thời gian lưu lại tay hở, số lần đi vào tay hở và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín theo tuần của các lô chuột thí nghiệm ở test EPM được trình bày trong hình 3.1, hình 3.2 và hình 3.3.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng trên thời gian lưu lại tay hở
Sham: lô cắt buồng trứng giả OVX: lô cắt buồng trứng
Nhận xét:
Thời gian lưu lại tay hở ở cả 2 lô chuột thí nghiệm đều có xu hướng giảm dần theo thời gian. Tại từng thời điểm đánh giá (tuần 3, tuần 7, tuần 12), thời gian lưu lại tay hở giữa 2 lô khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
Tương tự, phân tích ANOVA 2 chiều với phép đo lặp lại cho thấy trong toàn bộ quá trình 12 tuần, thời gian lưu lại tay hở giữa 2 lô khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p = 0,177) và yếu tố thời gian ảnh hưởng có ý nghĩa đến chỉ tiêu thời gian lưu lại tay hở của chuột (p = 0,026).
Hình 3.2. Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng trên số lần đi vào tay hở
Sham: lô cắt buồng trứng giả OVX: Lô cắt buồng trứng
Nhận xét:
Số lần đi vào tay hở ở cả 2 lô chuột thí nghiệm đều có xu hướng giảm dần theo thời gian. Tại từng thời điểm đánh giá (tuần 3, tuần 7, tuần 12), số lần đi vào tay hở giữa 2 lô khác biệt không có ý nghĩa thống kê.
Tuy nhiên, phân tích ANOVA 2 chiều với phép đo lặp lại cho thấy trong toàn bộ quá trình 12 tuần, cắt buồng trứng làm giảm có ý nghĩa số lần đi vào tay hở so với lô chứng (lô Sham) (p = 0,029) và yếu tố thời gian ảnh hưởng rõ rệt đến chỉ tiêu số lần đi vào tay hở của chuột (p = 0,002).
Hình 3.3. Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng trên tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín
** p < 0,01 so với lô chứng (Sham) Sham: lô cắt buồng trứng giả OVX: Lô cắt buồng trứng
n = 19 n = 19
Nhận xét:
Tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín ở cả 2 lô chuột thí nghiệm đều có xu hướng giảm dần theo thời. Tại các thời điểm tuần 3 và tuần 7, tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín giữa 2 lô khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Tại tuần 12, cắt buồng trứng làm giảm có ý nghĩa tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín so với lô chứng (lô Sham) (p = 0,003)
Tương tự, phân tích ANOVA 2 chiều với phép đo lặp lại cho thấy trong toàn bộ quá trình 12 tuần, cắt buồng trứng làm giảm có ý nghĩa tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín so với lô chứng (lô Sham) (p = 0,030) và yếu tố thời gian ảnh hưởng rõ rệt đến chỉ tiêu số lần đi vào tay hở của chuột (p = 0,000).
3.1.2. Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng tới hoạt động tự nhiên và khám phá của chuột phá của chuột
Tại thời điểm 12 tuần sau khi cắt buồng trứng, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của mô hình tới hoạt động tự nhiên và khả năng khám phá của chuột bằng test OFT. Kết quả thu được trên số đường kẻ đi qua (linescore), số lần đứng lên bằng 2 chân sau của chuột (rearing), số lần vào trung tâm (SLTT) và thời gian ở trung tâm (TGTT) của các lô chuột thí nghiệm ở test OFT được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của mô hình cắt buồng trứng trên các chỉ tiêu đánh giá của test môi trường mở (OFT)
Chỉ tiêu Lô Sham Lô OVX p
Số dòng kẻ chuột đi qua (linescore) 27
(24;30)
15
(14;18) 0,01
Số lần chuột đứng lên bằng 2 chân sau (rearing)
7 (3;10)
6
(4;6) 0,315
Số lần chuột đi vào trung tâm 2
(1;2)
1
(1;1) 0,065
Thời gian chuột lưu lại trung tâm (giây) 6
(4;7)
2
(2;4) 0,017
p so sánh với lô cắt buồng trứng giả (lô Sham) Lô Sham: lô cắt buồng trứng giả Lô OVX: Lô cắt buồng trứng
Nhận xét: Sau 12 tuần, mô hình cắt buồng trứng làm giảm vận động tự nhiên của chuột thể hiện thông qua làm giảm có ý nghĩa số đường kẻ chuột đi qua (linescore) và ảnh hưởng tới khả năng khám phá của chuột thể hiện thông qua làm giảm có ý nghĩa thời gian chuột đi vào trung tâm (SLTT). Các chỉ tiêu còn lại không có sự khác biệt khi so sánh giữa 2 lô.
3.2. Đánh giá khả năng gây lo âu thực nghiệm trên mô hình nuôi cô lập
3.2.1. Đánh giá khả năng gây lo âu sử dụng test EPM
Tại thời điểm 5 tuần sau khi chuột được nuôi cô lập, tiến hành đánh giá khả năng gây lo âu của mô hình bằng test EPM. Kết quả thu được trên thời gian lưu lại tay hở, số lần đi vào tay hở và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín của các lô chuột thí nghiệm ở test EPM được trình bày trong hình 3.4 và hình 3.5
Hình 3.4. Ảnh hưởng của nuôi cô lập đến thời gian lưu lại tay hở.
* p < 0,05 so với lô chứng nuôi bầy đàn (n = 10 con/lô) Nhận xét: Mô hình nuôi cô lập làm giảm có ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở (p < 0,05) so với lô chứng nuôi bầy đàn. Việc giảm có ý nghĩa tiêu chí này cho thấy dấu hiệu sinh lý của sự căng thẳng. Hơn nữa thời gian lưu lại tay hở là tiêu chí chính phản ánh mức độ lo âu, nên có thể thấy mô hình này bước đầu thể hiện khả năng gây lo âu trên chuột.
Hình 3.5. Ảnh hưởng của nuôi cô lập đến số lần đi vào tay hở và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín.
* p < 0,05 ** p < 0,01 so với lô chứng nuôi bầy đàn (n = 10 con/lô) Nhận xét: Mô hình nuôi cô lập làm giảm có ý nghĩa số lần đi vào tay hở (p < 0,05) và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín (p < 0,01) so với lô chứng nuôi bầy đàn. Cùng với chỉ tiêu thời gian lưu lại tay hở, chỉ tiêu số lần đi vào tay hở cũng phản ánh mức độ lo âu của chuột. Tuy nhiên việc làm giảm tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín (một chỉ tiêu đã từng được sử dụng để đánh giá hoạt động di chuyển của chuột) cho thấy mô hình này có thể ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên của chuột.
3.2.2. Ảnh hưởng của mô hình nuôi cô lập tới hoạt động tự nhiên và khám phá của chuột của chuột
Tại thời điểm 5 tuần sau khi nuôi cô lập, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của mô hình tới hoạt động tự nhiên và khả năng khám phá của chuột bằng test OFT. Kết quả thu được trên số đường kẻ đi qua (linescore), số lần đứng lên bằng 2 chân sau của chuột (rearing), số lần vào trung tâm (SLTT) và thời gian ở trung tâm (TGTT) của các lô chuột thí nghiệm ở test OFT được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của mô hình nuôi cô lập trên các chỉ tiêu đánh giá của test môi trường mở (OFT)
Chỉ tiêu Bầy đàn1 Cô lập2 p1-2
Số dòng kẻ chuột đi qua (linescore) 70
(63;134)
112
(82;119) 0,606
Số lần chuột đừng lên bằng 2 chân sau (rearing)
18 (6;19)
19
(14,5 ; 29,5) 0,470
Số lần chuột đi vào trung tâm 5
(3;7)
4
(1,5 ; 6) 0,758
Thời gian chuột lưu lại trung tâm (giây) 14
(9;16)
14
(2,5 ; 37) 1,000
p so sánh với lô chứng nuôi bầy đàn (n = 10 con/lô) Nhận xét: Mô hình nuôi cô lập không ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên, không làm thay đổi số đường kẻ chuột đi qua (linescore) và số lần đứng lên bằng 2 chân (rearing) của chuột so với nhóm chứng nuôi bầy đàn. Tương tự như vậy, khả năng khám phá của chuột cũng không bị ảnh hưởng, không làm thay đổi số lần đi vào trung tâm (SLTT) và thời gian lưu lại tại trung tâm (TGTT).
3.3. Áp dụng mô hình gây lo âu phù hợp để đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP
Như vậy, 2 mô hình gây lo âu thực nghiệm là mô hình cắt buồng trứng và mô hình nuôi cô lập cho kết quả như sau:
Mô hình cắt buồng trứng không làm thay đổi có ý nghĩa thời gian lưu lại
tay hở và số lần đi vào tay hở, làm giảm có ý nghĩa tổng số đường kẻ chuột đi qua.
Mô hình nuôi cô lập làm giảm có ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở, số lần
đi vào tay hở, và không làm thay đổi tổng số đường kẻ đi qua và số lần đứng lên bằng hai chân sau của chuột.
Theo kết quả trên, mô hình nuôi cô lập đã đáp ứng được 2 tiêu chí ban đầu: gây ra trạng thái lo âu rõ rệt và không ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên của chuột. Chúng tôi quyết định áp dụng mô hình này để gây lo âu thực nghiệm và tiến hành nghiên cứu bước tiếp theo: đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP trên chuột gây lo âu thực nghiệm.
3.3.1. Đánh giá tác dụng giải lo âu của l-THP trên chuột đã được gây lo âu
Trên các mức liều đã được chứng minh trước đó có tác dụng giải lo âu ở chuột bình thường (liều 0,3 mg/kg và 1 mg/kg) thực hiện đánh giá tác dụng giải lo âu khi sử dụng liều lặp lại 5 ngày bằng test EPM. Kết quả thu được trên thời gian lưu lại tay hở, số lần đi vào tay hở và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín của các lô chuột thí nghiệm ở test EPM được trình bày trong hình 3.6 và hình 3.7.
Hình 3.6. Tác dụng của diazepam (DZP) và l-THP trên thời gian lưu lại tay hở ở chuột gây lo âu bằng nuôi cô lập
* p < 0,05 ** p < 0,01 so với lô chứng nuôi cô lập ( n = 10 con/lô) DZP: lô chứng dương uống diazepam 2mg/kg Ro0.3: lô uống l- tetrahydropalmatin 0,3 mg/kg Ro1.0: lô uống l- tetrahydropalmatin 1,0 mg/kg Nhận xét: Sau khi sử dụng lặp lại 5 ngày, chứng dương dizepam liều 2mg/kg làm tăng có ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở so với lô chứng (lô nuôi cô lập). Tương tự như vậy, l-THP ở các mức liều 0,3 mg/kg và 1,0 mg/kg cũng làm tăng có ý nghĩa chỉ tiêu này (p < 0,05) khi so với lô chứng cô lập uống dung môi pha thuốc chứa 1% Tween 80.
Hình 3.7. Tác dụng của diazepam (DZP) và l-THP trên số lần đi vào tay hở và tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín ở chuột gây lo âu bằng nuôi cô lập
* p < 0,05 so với lô chứng nuôi cô lập (n = 10 con/lô) DZP: lô chứng dương uống diazepam 2 mg/kg Ro0.3: lô uống l- tetrahydropalmatin 0,3 mg/kg Ro1.0: lô uống l- tetrahydropalmatin 1,0 mg/kg Nhận xét: Sau khi sử dụng lặp lại 5 ngày, chứng dương dizepam liều 2mg/kg làm tăng có ý nghĩa số lần đi vào tay hở so với lô chứng (lô nuôi cô lập). Tương tự như vậy, l-THP ở các mức liều 0,3 mg/kg và 1,0 mg/kg cũng làm tăng có ý nghĩa chỉ tiêu này (p < 0,05) khi so với lô chứng. Trên chỉ tiêu tổng số lần đi vào tay hở hoặc tay kín, l-THP 0,3 mg/kg làm tăng có ý nghĩa thống kê, trong khi DZP và l-THP 1 mg/kg không có sự khác biệt so với nhóm chứng nuôi cô lập uống dung môi pha thuốc chứa 1% Tween 80.
3.3.3. Ảnh hưởng của l-THP tới hoạt động tự nhiên và khám phá ở chuột đã được gây lo âu
Tại thời điểm 5 ngày sau khi uống thuốc, tiến hành đánh giá ảnh hưởng của l- THP tới hoạt động tự nhiên và khả năng khám phá của chuột bằng test OFT. Kết quả thu được trên số đường kẻ đi qua (linescore), số lần đứng lên bằng 2 chân sau của